何軼群 何天文 盧建

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學遺傳中心，廣東廣州 511400）

染色體平衡易位是2條不同源的染色體各發(fā)生斷裂后，互相變位重接而形成兩條結構上重排的染色體。這種易位大多數(shù)都保留了原有基因總數(shù)，對基因作用和個人發(fā)育一般無嚴重影響，通常易位攜帶者表型正常。平衡易位人群攜帶頻率約為0.2%，不孕夫婦約為0.6%，復發(fā)流產(chǎn)夫婦約為9.2%［1］。植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）是胚胎植入前檢測胚胎染色體的整倍性和基因組染色體拷貝數(shù)的變異?；诟咄繙y序的PGT技術，以大規(guī)模并行序列為特征，一次性完成幾十萬到幾百萬條的DNA分子進行序列測序。通過囊胚活檢獲得5～8個滋養(yǎng)外胚層細胞，經(jīng)全基因組擴增（whole genome amplification，WGA），高通量測序和生信分析，可篩選出染色體正常／平衡易位攜帶者的整倍體囊胚，減少流產(chǎn)發(fā)生和出生缺陷。本研究運用基于高通量測序的PGT技術對1例染色體平衡易位家系的胚胎染色體進行分析，并探討了染色體平衡易位夫婦的胚胎整倍體率和形成機制。

1 對象與方法

1.1 對象 患者，女，29歲，G1P0A1，既往自然流產(chǎn)1次，不孕7＋年，女方HPV 12型（＋），雙側卵巢多囊改變，男方精液檢查提示：弱精子癥；女方染色體核型提示：46，XX（未見異常），男方染色體核型提示：46，XY，t（1；12）（p32；q24.3）。夫婦二人于2020年1月來廣東省婦幼保健院進行體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVFET）治療。卵泡期長方案促排獲卵20枚，卵胞漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受精獲獲得囊胚15個，活檢10個。依據(jù)Garnder囊胚分級法分級，1號胚胎為B／4ab，2～7號胚胎為B／4bb，8～9號胚胎為B／6bb，10號胚胎為B／5bc。高通量測序結果提示：6枚整倍體囊胚，4枚非整倍體囊胚。移植1枚B／4bb整倍體囊胚，移植12d后血清HCG 661.6IU／ml，移植28d超聲提示：宮內單活胎。唐氏篩查提示：臨界風險，21-三體風險值1∶318。胎兒頸項透明層厚度（nuchal translucency，NT）提示：1.6mm。羊水染色體核型提示：46，XN（未見異常核型），羊水染色體微陣列提示：（-），羊水定量熒光聚合酶鏈反應（quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR）提示：（-）。胎兒足月后，順產(chǎn)1男嬰，體重3.41kg，發(fā)育正常。

1.2 方法

1.2.1 IVF和囊胚培養(yǎng) 在夫妻雙方簽署知情同意書后，采用卵泡期長方案，月經(jīng)第2d注射達菲林降調節(jié)，30d后注射果納芬針促進卵泡生長，當3個以上卵泡直徑≥18mm時，肌注HCG，36h后取卵。通過ICSI受精，將受精胚胎培養(yǎng)5d或6d后，使用摩擦解剖法進行囊胚活檢5～8個滋養(yǎng)外胚層細胞，放置聚合酶鏈式反應管中，-20℃儲存，待WGA。

1.2.2 WGA和高通量測序分析 通過Sureplex擴增試劑盒對聚合酶鏈式反應管中滋養(yǎng)外胚層細胞進行WGA。構建文庫，使用胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒進行測序。通過MiSeq平臺進行胚胎文庫的大規(guī)模高通量平行測序。測序數(shù)據(jù)采用平均值算法，對基因組染色體進行連續(xù)窗口劃分，統(tǒng)計每個樣本每個窗口內的DNA序列片段數(shù)目，使用PGXcloud進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果

經(jīng)測序數(shù)據(jù)分析，提示該夫婦共獲6個整倍體囊胚，4個非整倍體囊胚，其中1號和9號胚胎染色體結果為46，XN，-（1）（p36.33-p32.3）（52.91Mb），＋（12）（q24.32-q24.33）（5.68Mb），6號胚胎染色體結果為47，XN，＋1，8號胚胎染色體結果為46，XN，-（5）（p15.33-p13.2）（37.97Mb），＋（mosaic）（9）（32%），其他6個整倍體胚胎染色體結果為46，XN，共6個胚胎可供移植，詳見表1和圖1。

圖1 高通量測序的基因組變異圖譜

表1 10個囊胚染色體結果匯總表

3 討論

本例家系男方攜帶1號和12號染色體的平衡易位，女方染色體核型正常。理論上，染色體平衡易位攜帶者，其表型一般正常，可形成18種配子，若其配偶染色體正常，子代中1／18為正常染色體核型，1／18為與受檢者相同類型的平衡易位攜帶者，其余16／18的染色體核型為單體或部分單體、三體或部分三體，易導致流產(chǎn)、死胎或畸形兒。然而，該夫婦行染色體結構重排的胚胎植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing for chromosomal structural rearrangement，PGT-SR）助孕后，獲得10個囊胚，其中6個為正常／平衡整倍體，且1號和12號易位染色體的完全正常或平衡易位攜帶整倍體率高達70%（7／10），其易位染色體的整倍體率遠遠高于理論值1／9。Ko等［2］收集65對易位夫婦的1294個3天卵裂球胚胎，進行減數(shù)分裂分離分析，通過2∶2分離獲得729個胚胎（56.3%），對位分離占21.8%，鄰位-1分離占23.4%，鄰位-2分離占7.0%。Ogilvie等［3］收集18對易位夫婦的149個3天的胚胎，減數(shù)分裂分離分析發(fā)現(xiàn)，47.7%為對位分離，24.8%為鄰位-1分離，10.1%為鄰位-2分離，15.4%為3∶1分離，2.0%為4∶0分離。Wang等［4］收集89對平衡易位夫婦，獲得378個5D或6D囊胚，對活檢囊胚的減數(shù)分裂分離方式進行分析，發(fā)現(xiàn)女性攜帶者對位分離發(fā)生率為44.19%，男性攜帶者對位分離發(fā)生率為45.15%。Zhang等［5］收集356例易位夫婦的1842個囊胚，其中對位分離模式最常見（749／1842，40.7%），其次是鄰位-1（508／1842，27.6%）和鄰位-2（201／1842，10.9%）。由此可見，在囊胚中，平衡易位染色體，減數(shù)分離分離方式以2∶2的分離方式為主，其中以對位分離占主要，接近40%～50%。這表明同源著絲粒在細胞中向相對極遷移的趨勢是增強的。而這種對位分離的比例依然不能直接預測整倍體囊胚的比例。因為在配子形成的過程中，有一定比例的染色體會發(fā)生其他新發(fā)的染色體變異，而且由于染色體相互效應的影響，平衡易位攜帶者的囊胚新發(fā)異常率要大于染色體正常夫婦。Liu等［6］收集75對平衡易位夫婦的252個囊胚，平衡易位攜帶者整倍體胚胎率為27.8%，男性攜帶者的正常／平衡整倍體胚胎率高于女性攜帶者（42.4%vs.23.3%）。Lei等［7］收集了532對易位夫婦的3030個囊胚信息，其中874（28.8%）為整倍體，男性攜帶者整倍體胚胎率為30.68%；女性攜帶者整倍體胚胎率為27.20%，男性攜帶者D3胚胎率、囊胚形成率和囊胚整倍體率高于女性攜帶者。所以，平衡易位攜帶者實際產(chǎn)生正?；蚱胶庖孜坏恼扼w率，即可移植胚胎概率接近30%，而且男性易位攜帶者實際產(chǎn)生可移植胚胎概率高于女性易位攜帶者。這可能與ICSI技術使用有關，因為優(yōu)先選擇了形態(tài)正常的精子，從而起到過濾作用。因此，在臨床咨詢中，我們不應該只是簡單地告知咨詢者平衡易位攜帶者整倍體配子的理論值，而應該在大數(shù)據(jù)的基礎上，結合實驗室的數(shù)據(jù)和經(jīng)驗，以及患者的自身情況，綜合評估患者的生育風險。