何 婷 艾樂樂 朱長強(qiáng) 胡 丹 王長軍 李 萌 譚偉龍**

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院輸血科，江蘇南京 210000； 2.東部戰(zhàn)區(qū)疾病預(yù)防控制中心，江蘇南京 210000)

蜱蟲是一類專性吸血的媒介節(jié)肢動(dòng)物，可以傳播細(xì)菌、病毒、立克次體等多種病原體(Chenetal., 2014)。其中，克里—米亞剛果出血熱病毒(CCHFV)(Leblebiciogluetal., 2016)、蜱傳腦炎病毒(TBEV)(Lindquistetal., 2008)和發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)(Yuetal., 2011)等對人類具有較高的致病性。Dabieshan病毒和SFTSV、哈特蘭德病毒(HRTV)(Mcmullanetal., 2012)同屬布尼亞病毒目、白纖病毒科、白蛉病毒屬，節(jié)段式單股負(fù)鏈RNA病毒。2015年通過高通量測序技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)該病毒(Shietal., 2016)。2016年本課題組通過對舟山地區(qū)蜱蟲高通量測序及特異性PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)該地區(qū)蜱蟲中廣泛攜帶Dabieshan病毒，陽性率高達(dá)64.9%(Zhuetal., 2020)。大多數(shù)布尼亞病毒NP蛋白能夠與RNA結(jié)合，協(xié)助RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，在病毒的入侵和定植中發(fā)揮作用(Fieldsetal., 1993)。本課題組前期發(fā)現(xiàn)的Dabieshan病毒NP蛋白(GenBank序列號(hào)MN723842.1)，雖然與致病的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV) (GenBank序列號(hào)YP006504092.1)以及裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus)(GenBank序列號(hào)ABQ2358.1)同屬于白蛉病毒屬的分支，但其位置上相距較遠(yuǎn)，同源性只有29.88%和35.00%。相反，與2015年發(fā)現(xiàn)的Dabieshan病毒(GenBank序列號(hào)KM817733.1)和Yongjia病毒(GenBank序列號(hào)AJG39335.1)同源性比較高，分別為100%和55.06%(何婷，2019)。為了明確Dabieshan病毒NP蛋白的生物學(xué)功能，解析該病毒的潛在致病性和流行病學(xué)特征，實(shí)現(xiàn)對舟山地區(qū)蟲媒病毒的監(jiān)控和預(yù)警，本文以Dabieshan病毒NP蛋白生物信息學(xué)分析為基礎(chǔ)，成功表達(dá)和構(gòu)建一種以NP蛋白為包被抗原的高特異性和敏感度的間接ELISA方法，后續(xù)將對采集地人群動(dòng)物進(jìn)行血清學(xué)的初步篩查。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶XhoI/EcoRV、T4連接酶、JM-109/BL-21感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒提取試劑盒均購自寶生物工程有限公司(大連)；Goat-anti-rabbit/mouse IgG-HRP購自博奧森生物技術(shù)公司(北京)；Anti-6×His Tag mouse monoclonal antibody購自Thermo Fisher Scientific(美國)；pET-32a空載體質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室提供；Dabieshan病毒陽性cDNA來自舟山地區(qū)長角血蜱Haemaphysalislongicornis樣本，由本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃低溫冰箱保存；抗SFTSV病毒NP蛋白陽性兔血清由課題組提供(諸葛堯堯，2020)。

1.2 NP蛋白基因序列擴(kuò)增

以Dabieshan病毒陽性的cDNA為模板，以帶有ECORV酶切位點(diǎn)的上游引物C C GG A T A T CA T G G G C G A C C A A G A T C TG和帶有XhoI酶切位點(diǎn)的下游引物C C GC T C G A GT C A G C C C A G G A G C T G G C GG進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL)： 2×premix taq 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min共計(jì)35循環(huán)，最后延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定以后，回收純化目的片段。

1.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建

將純化好的帶有酶切位點(diǎn)的NP基因片段和pET-32a空載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠鑒定后回收純化。T4連接酶于16 ℃連接NP片段和載體片段，重組質(zhì)粒經(jīng)JM109感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增培養(yǎng)后，收集純化pET-32a-NP質(zhì)粒，并且用T7通用引物進(jìn)行測序，保證序列連接的準(zhǔn)確性。

1.4 重組蛋白表達(dá)純化

將pET-32a-NP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)蛋白高表達(dá)，37 ℃培養(yǎng)4 h后，冰浴超聲破碎菌體后，取上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE確定蛋白表達(dá)形式，用含His-tag的鎳柱對蛋白進(jìn)行收集純化。

1.5 Western Blot實(shí)驗(yàn)

將經(jīng)鎳柱收集純化的NP重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，用5%脫脂乳4 ℃封閉過夜。以抗-His單克隆抗體(1∶5000)為一抗，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗3次,再加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶5000)為二抗37 ℃孵育1 h，TBST緩沖液洗3次后顯色。

1.6 間接ELISA方法建立

1.6.1包被NP抗原濃度確定:將經(jīng)Western Blot鑒定后的NP蛋白(原始濃度為300 μg/mL)按照1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512、1∶1024、1∶2048 倍比稀釋包被ELISA板，將兔血清按照1∶104、 1∶ 5×104和1∶105比例稀釋后作為一抗，棋盤滴定法依據(jù)P/N值確定抗原抗體最佳反應(yīng)比。

1.6.2酶標(biāo)二抗?jié)舛却_定：以棋盤滴定結(jié)果確定的最佳抗原包被濃度和一抗?jié)舛茸鳛榉磻?yīng)條件，在此條件下，將二抗以1∶1000，1∶5000和1∶10000比例稀釋，確定二抗最佳反應(yīng)濃度。

1.6.3最佳底物反應(yīng)時(shí)間確定：根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳抗原抗體反應(yīng)濃度，設(shè)置3個(gè)孔，分別顯色5、10和15 min，確定最佳底物顯色時(shí)間。

1.7 特異性實(shí)驗(yàn)

按照上述確定的最佳試驗(yàn)條件，以發(fā)熱伴血小板減少綜合征NP蛋白兔免疫血清作為對照，確定Dabieshan病毒NP蛋白是否和發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒陽性血清存在血清學(xué)交叉反應(yīng)。

1.8 板內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按照上述確定的最佳實(shí)驗(yàn)條件，設(shè)置3塊ELISA板，每塊板隨機(jī)選取8個(gè)孔，重復(fù)滴定，測定各孔OD450值。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒陽性克隆PCR驗(yàn)證

利用針對PET-32a質(zhì)粒載體的通用引物對T7，對轉(zhuǎn)化有PET-32a-NP重組質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞JM109的單克隆菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，如圖1所示。將PCR陽性的單克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后進(jìn)行DNA測序，返回序列在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行比對，沒有g(shù)ap，也沒有突變位點(diǎn)形成終止密碼子，說明序列插入正確，pET-32a-NP質(zhì)粒構(gòu)建成功，可用于后續(xù)的蛋白原核表達(dá)。

圖1 PCR驗(yàn)證單克隆菌落Fig.1 Identification of monoclonal colony by PCR1,4,5,7：陽性菌落；2,3,6：陰性菌落.1,4,5,7: Positive colony; 2,3,6: Negative colony.

2.2 重組蛋白表達(dá)形式鑒定

經(jīng)重組質(zhì)粒小樣誘導(dǎo)表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，IPTG能夠誘導(dǎo)NP蛋白順利表達(dá)。由于蛋白是可溶性表達(dá)還是以包涵體形式存在，將影響后續(xù)蛋白的純化方法，所以將全菌、上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果如圖2-a所示，發(fā)現(xiàn)在上清和沉淀中均有表達(dá)，條帶大小48 kDa與預(yù)期一致，因上清表達(dá)量強(qiáng)于沉淀并且上清中可溶性蛋白純化操作較為簡便，故選取上清作為后續(xù)NP蛋白純化的對象。如圖2-b所示，用不同濃度咪唑進(jìn)行洗脫收集，各濃度洗脫液經(jīng)SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，咪唑濃度在100～200 mmol/L時(shí)，目的條帶純度最高。

圖2 NP蛋白表達(dá)純化Fig.2 The expression and purification of NP proteina:重組蛋白表達(dá)形式鑒定; b:不同濃度咪唑洗脫液SDS-PAGE電泳鑒定.a: Identification of the expression forms; b: SDS-PAGE electrophoresis analysis.

2.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)

由于純化的NP重組蛋白上表達(dá)6 × His-tag，可以與抗-His單克隆抗體有特異性結(jié)合反應(yīng)。Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，顯示在48 kDa處出現(xiàn)特異性單一條帶，與SDS-PAGE條帶大小相符合。

圖3 Western Blot鑒定重組蛋白Fig.3 Western Blot of expressed recombinant protein

2.4 間接ELISA反應(yīng)條件的確定

2.4.1抗原抗體反應(yīng)濃度的確定: 棋盤滴定結(jié)果表明，當(dāng)NP蛋白按1∶128稀釋(原始濃度為300 μg/mL)，兔血清按1∶5×104稀釋時(shí)，P/N反應(yīng)值最大，表明該稀釋度下，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)最佳。

2.4.2二抗反應(yīng)濃度的確定: 按照上述優(yōu)化的最佳抗原抗體稀釋比例，將商品化羊抗兔IgG-HRP抗體作為二抗按照1∶1000，1∶5000和1∶10000 稀釋，檢測不同二抗稀釋度下P/N值。結(jié)果表明，當(dāng)以1∶5000稀釋度稀釋二抗時(shí)，P/N反應(yīng)值最大。

2.4.3最佳底物反應(yīng)時(shí)間: 按照上述優(yōu)化的反應(yīng)條件，設(shè)置檢測底物反應(yīng)時(shí)間為5、10和15 min時(shí)的P/N值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)顯色時(shí)間為15 min時(shí)，P/N反應(yīng)值最大。

2.5 血清學(xué)反應(yīng)特異性

利用以上建立的間接ELISA方法，對抗SFTSV病毒NP蛋白陽性兔血清進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖4所示，發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒抗NP兔血清與Dabieshan病毒重組NP蛋白不存在交叉反應(yīng)，特異性好。

圖4 間接ELISA方法特異性檢測Fig.4 Identification of the specificity of the indirect ELISA method

2.6 板內(nèi)重復(fù)性檢測

測定每塊板8個(gè)復(fù)孔OD450，計(jì)算ELISA板板內(nèi)變異系數(shù)，結(jié)果如圖5顯示，板內(nèi)變異系數(shù)范圍在5.57%～8.22%，表明該ELISA板內(nèi)重復(fù)性較好。

圖5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Fig.5 The repeat tests of the indirect ELISA method

3 討論

蜱蟲作為一種專性吸血的節(jié)肢動(dòng)物，可攜帶并傳播有大量病原體，近年來，不斷出現(xiàn)由于蜱蟲叮咬而染病的報(bào)道(Yuetal., 2011; Mengetal., 2019)。高通量測序技術(shù)的應(yīng)用極大地豐富了人們對蜱媒病毒的了解，2015年通過高通量測序技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)新病毒—Dabieshan病毒的存在(Lietal., 2015)。與傳統(tǒng)的白蛉病毒屬不同，Dabieshan病毒存在M片段缺失的現(xiàn)象。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，浙江舟山群島地區(qū)蜱蟲自然感染Dabieshan病毒率較高，而江蘇鹽城地區(qū)則未檢出該病毒。作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，對于Dabieshan病毒本身繁殖周期和對人類感染性和致病性的研究資料甚少。因此，了解人群中Dabieshan病毒的流行情況，對于判斷該病毒的致病性有重要參考價(jià)值。

間接ELISA作為一種利用固化已知抗原檢測未知血清樣本的方法，適用于大規(guī)模臨床血清樣本的篩查，特別是現(xiàn)場快速篩查和基層醫(yī)療初篩( Newcombeetal.,2007)。本研究中通過摸索最佳抗原抗體反應(yīng)濃度、二抗反應(yīng)濃度和底物反應(yīng)時(shí)間等一系列實(shí)驗(yàn)條件對Dabieshan病毒間接ELISA檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，初步確認(rèn)了該方法具有較好的重復(fù)性和特異性。IgG類抗體在體內(nèi)存在時(shí)間長、含量高、易于檢測，可檢測既往感染情況。本實(shí)驗(yàn)探究性地將新建立的ELISA方法應(yīng)用于蜱蟲高攜帶Dabieshan病毒的區(qū)域(舟山)和未攜帶區(qū)(鹽城)人群的血清學(xué)檢測，本次測定的人群OD450值均較低，大都集中正在0.2附近，且兩地區(qū)人群血清中抗NP抗體含量不存在顯著性差異，表明舟山地區(qū)可能不存在Dabieshan病毒引起的既往感染(由于缺乏人群的陰性和陽性對照，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果未列出相關(guān)數(shù)據(jù))。但由于本次測定所選取的人群標(biāo)本來自健康人群，因此加入真正的陽性及陰性對照并進(jìn)一步擴(kuò)大人群的檢測范圍，將更具有科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。攜帶Dabieshan病毒的蜱蟲一部分來自于牛、羊等家畜，至于這些動(dòng)物血清中是否存在相應(yīng)病毒NP抗體也是后續(xù)研究需要明確的內(nèi)容。本次研究成功制備了Dabieshan病毒NP蛋白抗原，為Dabieshan病毒蛋白功能研究和疫苗研制奠定基礎(chǔ)；以NP蛋白為固相抗原成功構(gòu)建的間接ELISA方法，可望應(yīng)用于人群血清學(xué)篩查，為了解該病毒致病性和傳染性乃至科學(xué)防控措施提供了重要的人群流行資料。