張美娜 秦 通 施明杰 孫 毅

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重點實驗室，北京 100071)

蜱隸屬于蛛形綱蜱目，是一類通過叮咬吸血，傳播病毒、細(xì)菌、螺旋體和毒素等多種病原體并引發(fā)人獸共患疾病流行的媒介節(jié)肢動物(劉敬澤等，2013)。蜱類傳播的病原體譜很廣，既包括經(jīng)典蜱媒疾病病原體，如伯氏疏螺旋體、克里米亞剛果出血熱病毒、森林腦炎病毒、斑點熱群立克次體等，又包括新近發(fā)現(xiàn)的病原體，如波本Bourbon病毒(Lambertetal., 2015)、荊門蜱病毒(Jiaetal., 2019)、阿龍山病毒(Wangetal., 2019)、假面山病毒(Kobayashietal., 2020)、奧多摩町病毒(Kobayashietal., 2020)、Thogoto病毒(THOV)(Talactacetal., 2018)和新布尼亞病毒(Yuetal., 2011)。近年來，以發(fā)熱伴血小板減少綜合征、荊門蜱病毒為代表的蜱媒病危害日益嚴(yán)重，探索蜱媒病防治方法成為科學(xué)界尤其是預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中熱點問題之一。然而由于蜱媒病原種類多樣、變異快，蜱媒病原特異性疫苗研發(fā)投入巨大，但成效甚微。研究者不得不將單純的病原體研究轉(zhuǎn)移到病原體、媒介蜱和宿主動物(人)的相互作用方面來，其中圍繞涎腺等關(guān)鍵傳播環(huán)節(jié)的研究最為活躍。在NIH支持下，2005年Francischetti 完成了肩突硬蜱涎腺的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析(Francischettietal., 2005)，接著Ribeiro 等人完成了肩突硬蜱涎腺分泌蛋白的分類與功能注釋，發(fā)現(xiàn)了可通過調(diào)節(jié)宿主免疫介導(dǎo)病原傳播的Salp蛋白及類似物(Ribeiroetal., 2006)；針對美洲花蜱涎腺的基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究(Karimetal., 2011; 2015)也為明確蜱類涎腺活性分子在病原體傳播中的作用提供了堅實基礎(chǔ)。尤其是2016年完成的肩突硬蜱全基因組測序成為蜱媒研究中具有里程碑意義的前沿進(jìn)展(Gulia-Nussetal., 2016)。在應(yīng)用方面，繼蜱類中腸抗原的獸用抗蜱疫苗TickGARD?和Gava?上市以后，涎腺分泌的粘質(zhì)蛋白cement 64TRP組分被認(rèn)為具有阻斷森林腦炎病毒傳播的開發(fā)潛力(de la Fuenteetal., 2016)；電壓依賴型陰離子通道蛋白(voltage-dependent anion channel, VDAC)重組疫苗通過阻斷蜱媒病原對家畜的傳播作用已進(jìn)入現(xiàn)場評價階段(Ortega-Sánchezetal., 2020)。最近對我國6個代表蜱種的高質(zhì)量基因組分析也為闡明涎腺在病原體傳播中的關(guān)鍵作用提供了重要基礎(chǔ)(Jiaetal., 2020)。這些圍繞著蜱類涎腺、中腸等活性成分的應(yīng)用基礎(chǔ)研究，初步彰顯了涎腺在病原體傳播中的關(guān)鍵作用以及傳播阻斷在蜱媒病防控中的巨大潛力(de la Fuenteetal., 2017)。

1 涎腺結(jié)構(gòu)與功能

1.1 涎腺結(jié)構(gòu)

涎腺是蜱類游離態(tài)和寄生態(tài)多樣化生理過程的必要腺體，除維持離子與水分平衡外，涎腺通過分泌涎液在蜱媒病原傳播中發(fā)揮關(guān)鍵作用。涎腺位于蜱的體腔兩側(cè)、呈葡萄串狀， 是蜱體內(nèi)最大的腺體。附突扇頭蜱Rhipicephalusappendiculatus雄蜱有約1 400個(acini I～I(xiàn)V)腺泡，雌蜱約1 350個(acini I～I(xiàn)II)，涎腺支管匯合于涎腺管，涎腺管匯于貯涎竇(salivarium)并開口于口下板基部。其中，I型腺泡 (acini I)為非顆粒型，在所有蜱種中存在，多位于總涎管的前端或涎管的基部。II型腺泡中的單一顆粒型(acini II)僅為軟蜱所有；在硬蜱科種類中，雄蜱有腺泡I～I(xiàn)V型(acini I～I(xiàn)V)，雌蜱僅有腺泡I～I(xiàn)II型。顆粒狀結(jié)構(gòu)的II、III型腺泡 (acini II、III)往往位于分支涎管的端部，被認(rèn)為是蜱類分泌涎液的主要場所。

圖1 硬蜱涎腺模式圖Fig.1 Diagram of salivary gland in Ixodid ticks

1.2 涎腺功能

無論是游離還是寄生，蜱類涎腺都發(fā)揮著重要的生理功能，主要包括(1)非取食期從空氣中吸收水分；(2)調(diào)節(jié)蜱類離子和滲透壓平衡；(3)產(chǎn)生粘質(zhì)物質(zhì)，固定口器；(4)產(chǎn)生有助于吸血或調(diào)節(jié)宿主免疫作用的活性物質(zhì)；(5)為病原體發(fā)育和釋放提供合適的傳播途徑等。

1.2.1水分及離子平衡：硬蜱體表為幾丁質(zhì)所覆蓋，具有相對不透水的特性。除了非取食期，蜱類利用腺泡I分泌的吸濕性涎液獲取水分外，涎腺腺泡還可以排出多余的水分(Reuben Kaufmanetal., 2010)。涎腺通過涎液分泌將血餐中多余的液體和離子歸還給寄主，以濃縮營養(yǎng)物質(zhì)并調(diào)節(jié)血淋巴的體積和離子成分(Reuben Kaufmanetal., 2010)、維持水壓(Bowmanetal., 2008)及水分平衡。在安氏革蜱Dermacentorandersoni中74%的水分以及96% 鈉離子就是通過這種方式歸還至宿主動物。其中，腺泡III所具有的鈉鉀泵(sodium potassium pump (Na/K-ATPase))可能發(fā)揮著重要作用。

1.2.2涎液分泌：涎液分泌是涎腺的一個復(fù)雜過程，調(diào)控涎腺分泌活動的諸多生物活性成分被逐漸發(fā)現(xiàn)。兒茶酚胺 (catecholamines)被認(rèn)為是涎液分泌的主要激活分子，由多巴胺介導(dǎo)的蜱類涎腺分泌激活已在多個蜱種的體內(nèi)、外實驗中得以證實(imoetal., 2012)。多巴胺由蜱類的中樞神經(jīng)—合神經(jīng)節(jié)的多巴胺性神經(jīng)元觸突產(chǎn)生，腺泡細(xì)胞是多巴胺的自分泌或旁分泌信號的靶標(biāo) (imoetal., 2011;etal., 2014)。除多巴胺外，其他一些物質(zhì)也可直接或間接地調(diào)控涎腺的分泌，但這些物質(zhì)的受體尚不清楚。例如章魚胺可誘導(dǎo)美洲花蜱涎腺分泌3倍于多巴胺誘導(dǎo)的分泌量；γ-氨基丁酸可影響多巴胺的產(chǎn)生，但其本身則無法誘導(dǎo)涎腺分泌；此外，麥角生物堿(Ergot alkaloids)、擬膽堿類普魯卡因(pilocarpine)都可刺激涎腺分泌涎液。與此同時，最近的研究發(fā)現(xiàn)，蜱類也可通過神經(jīng)肽網(wǎng)絡(luò)選擇性控制腺泡的生理分泌活動，如合神經(jīng)節(jié)大神經(jīng)元上的肌神經(jīng)肽(myosin inhibitory peptide，MIP)和SIFamide被證實可調(diào)控腺泡II和III的基部組織的生理活動(Rolleretal., 2015)。在誘導(dǎo)涎腺分泌涎液過程中，環(huán)磷酸腺苷依賴型蛋白磷酸化途徑和激活胞質(zhì)磷酸化酶A2的鈣離子依賴途徑尤為重要，后者被證實可釋放花生四烯酸(arachidonic acid)和前列腺素E2(PGE2) (Qianetal., 1998; Saueretal., 2000)，PGE2進(jìn)入涎腺可誘導(dǎo)涎腺通過胞內(nèi)Ca2+通道分泌抗凝血成分以及其他蛋白。

2 涎液的組成及功能

蜱類涎液的組分隨發(fā)育期、性別、行為以及病原體感染不同而不同(Ribeiroetal., 2006; Diaz-Martinetal., 2013; Liuetal., 2014c)。關(guān)于涎腺或涎液的基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究目前已見報道，但對涎液組分的認(rèn)識仍舊是冰山一角，只有不足5%的涎腺蛋白得到了注釋和功能驗證(Francischettietal., 2009)。對篦子硬蜱涎腺的轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)，大部分轉(zhuǎn)錄子(12.8%)被歸類于氧化—還原過程，整合至細(xì)胞膜系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄子約占11.4%，還有63.2%的轉(zhuǎn)錄子被轉(zhuǎn)錄為結(jié)合蛋白(Liuetal., 2014b)。在該蜱疊聯(lián)群序列數(shù)據(jù)中，13%被認(rèn)為是分泌蛋白，蛋白抑制劑占所有疊聯(lián)群的2.6% (Schwarzetal., 2013)。

2.1 宿主免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的涎液活性分子

為應(yīng)對宿主動物的免疫脅迫，蜱類也演化出一系列調(diào)節(jié)或逃避宿主免疫體系的涎液活性分子。

2.1.1先天免疫與補體系統(tǒng)：抗炎反應(yīng)：炎性反應(yīng)通常發(fā)生在蜱類叮咬形成的傷口，傷口的炎性反應(yīng)主要基于炎性細(xì)胞對補體組分、前列腺素、白三烯素、抗菌肽、化學(xué)因子和細(xì)胞因子等招募活動(Andradeetal., 2005)；作為應(yīng)對措施，蜱類涎液分泌出可調(diào)節(jié)前炎性因子(pro-inflammatory factor)的活性分子，作用于包括嗜中性粒細(xì)胞(Guoetal., 2009)、NK 細(xì)胞 (Kube?etal., 1994)、巨噬細(xì)胞 (Krameretal., 2011)、T淋巴細(xì)胞 (Ramachandraetal., 1992)和樹突細(xì)胞 DCs (Cavassanietal., 2005)等在內(nèi)的多種靶細(xì)胞。這些分子通過抑制前炎性Th1細(xì)胞因子，上調(diào)抗炎性Th2細(xì)胞因子，引發(fā)Th2細(xì)胞的極化(Mejrietal., 2001)。Th2細(xì)胞因子對炎性的抑制對于蜱類完成吸血和病原體傳播具有重要作用(Schoeleretal., 2001)。同樣，蜱類涎液蛋白也可通過模擬宿主動物的蛋白實現(xiàn)免疫逃逸，如美洲花蜱中的巨噬細(xì)胞遷移抑制因子可保護(hù)蜱類免遭巨噬細(xì)胞攻擊(Jaworskietal., 2001)。

抗補體反應(yīng)：連接先天免疫和后天免疫的補體系統(tǒng)主要通過備選、經(jīng)典和凝集素補體激活通路進(jìn)行激活。其中，備選的補體激活通路是宿主動物應(yīng)對病原入侵和蜱類攻擊的重要防線。肩突硬蜱的Isac、Salp20和Isac-1 (Valenzuelaetal., 2000; Tysonetal., 2007) 以及篦子硬蜱Isac類似物 IRAC I、II (Daixetal., 2007; Couvreuretal., 2008) 可通過阻斷寄主補體因子B與補體C3b的結(jié)合，特異性抑制C3 轉(zhuǎn)換酶的激活。非洲鈍緣蜱脂蛋白補體抑制劑特異性作用于宿主動物補體級聯(lián)系統(tǒng)的C5 活化步驟(Nunnetal., 2005)；卡津花蜱A.cajennense涎液則可抑制寄主動物補體系統(tǒng)的經(jīng)典激活通路(Francoetal.，2016)。

2.1.2后天免疫：在抗蜱宿主動物中，蜱類抗原的特異性抗體或T淋巴細(xì)胞效應(yīng)因子的出現(xiàn)可引起宿主動物對蜱類再次叮咬的拮抗。而在敏感宿主動物中，蜱類的反復(fù)叮咬并不出現(xiàn)拮抗作用，這可能與增強(qiáng)T細(xì)胞激活反應(yīng)、Th1/Th2聯(lián)合的細(xì)胞因子反應(yīng)相關(guān)(Heinzeetal., 2012b)。

蜱類誘導(dǎo)的宿主動物免疫抑制特征是降低初級抗體對T細(xì)胞依賴性抗原的免疫反應(yīng)和宿主動物對Th2型免疫反應(yīng)的極化。這種極化作用主要通過下調(diào)前炎性Th1細(xì)胞因子(IL-2, IFN-gamma)和上調(diào)Th2細(xì)胞因子(IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13) (Schoeleretal., 2001; Wikeletal., 2001)實現(xiàn)的。蜱類涎液中發(fā)現(xiàn)多個T細(xì)胞抑制分子，包括安氏革蜱(Bergmanetal., 2000)中的P36、篦子硬蜱(Leboulleetal., 2002)中的Iris、肩突硬蜱(Anguitaetal., 2002)中的Salp15等。Iris 抑制T細(xì)胞增生誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)并抑制前炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α；Salp15同CD4+T 細(xì)胞表面的CD4分子結(jié)合，進(jìn)而抑制T細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)，降低白介素IL2的增生并抑制T細(xì)胞增殖(Anguitaetal., 2002; Gargetal., 2006)。此外，Salp15還通過Toll樣受體 (TLR) 抑制樹突細(xì)胞功能，導(dǎo)致樹突細(xì)胞的T細(xì)胞激活和前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生受阻(Hoviusetal., 2008a)。太平洋硬蜱I.pacificus、篦子硬蜱、全溝硬蜱以及中華硬蜱I.sinensis(Hoviusetal., 2007; Hojgaardetal., 2009; Morietal., 2010；Wangetal., 2014)的Salp15蛋白陸續(xù)得以鑒定。蜱類涎腺免疫調(diào)節(jié)蛋白還包括白介素IL2結(jié)合蛋白，該蛋白抑制T細(xì)胞增生并激活多個白介素2以外的免疫效應(yīng)分子(Gillespieetal., 2001)。涎腺半胱氨酸蛋白酶抑制劑sialostatin L 及L2可抑制組織蛋白酶cathepsin L (Kotsyfakisetal., 2006)，從而抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的繁殖和脂多聚糖誘導(dǎo)的樹突細(xì)胞成熟(Sa-Nunesetal., 2009)。蜱類亦可通過抑制B細(xì)胞反應(yīng)阻止特異性抗蜱反應(yīng)，其中B細(xì)胞抑制蛋白BIP和BIF已分別從篦子硬蜱和亞洲璃眼蜱中鑒定出來(Hannieretal., 2004; Yuetal., 2006)。另外，蜱類涎液中還含有免疫球蛋白結(jié)合蛋白IGBP，它可以通過蜱類的中腸，促進(jìn)涎液的分泌，該蛋白保護(hù)蜱類免受宿主動物IgG的作用(Wangetal., 1999)。同時，附突扇頭蜱涎腺的脂蛋白Japanin被認(rèn)為具有刺激和抑制前炎性因子和抗炎性因子、以及T細(xì)胞極化的細(xì)胞因子，最終抑制單核細(xì)胞向樹突細(xì)胞的分化。

3 涎液與病原體傳播

3.1 涎液組分對病原體傳播的影響

病原體在蜱體內(nèi)進(jìn)行增殖并進(jìn)入涎腺后，涎腺尤其是涎液在病原體向宿主動物傳播過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因而病原體的傳播不能以“注射器”簡化了之。在蜱、宿主和病原體的長期共同進(jìn)化中，涎腺已進(jìn)化出通過宿主局部感染或系統(tǒng)感染甚至一過性感染，確保病原體傳播的能力(Nuttalletal., 2004; Ramamoorthietal., 2005; Wikel, 2013)。這三者之間的分子互作不僅僅是進(jìn)化沖突，也包括兩方或者三方受益的合作共贏。目前有關(guān)涎腺或涎液與病原體的傳播大多停留在涎液輔助傳播等現(xiàn)象的觀察階段，盡管一些涎腺活性分子已得到鑒定，但距離深刻洞悉涎腺及其涎液對病原體傳播的內(nèi)在機(jī)制及其分子基礎(chǔ)還有不少差距。

3.1.2共同吸血傳播(Cofeeding transmission): Jones等觀察到THOV向未感染蜱傳播，在與感染蜱的共同吸血時更為有效，且共同吸血的寄主動物并不發(fā)生系統(tǒng)感染，因此，將這種新型的病毒傳播模式定義為共同吸血傳播(Cofeeding transmission) (Jonesetal., 1987)。感染與未感染蜱之間的共同吸血傳播也被認(rèn)為是涎腺輔助傳播的間接證據(jù)(Nuttalletal., 2004)。蜱類吸血時形成的融入了涎液的血池為病原體在蜱個體間交換提供了良好條件 (Randolph, 2011; Voordouw, 2015)。森林腦炎病毒共同吸血傳播比其他細(xì)菌更為有效，甚至可以發(fā)生在有一定滴度的病毒特異性中和抗體出現(xiàn)的條件下 (Labudaetal., 1997)，這提示了蜱媒病毒具有的精妙的免疫逃逸策略。涎腺活性物質(zhì)所致的免疫調(diào)節(jié)和免疫逃逸在蜱類共同吸血傳播中發(fā)揮著重要作用。在篦子硬蜱共同吸血傳播案例中，局部皮膚的一過性感染是共同吸血傳播的基礎(chǔ)，在叮咬部位出現(xiàn)的細(xì)胞浸潤以及病毒抗原在朗格罕細(xì)胞Langerhans cells、中性粒細(xì)胞出現(xiàn)，乃至病毒出現(xiàn)在單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞提示了這些遷移細(xì)胞及引流淋巴結(jié)作為病毒運輸工具在蜱類共同吸血傳播中發(fā)揮主要作用(Labudaetal., 1996)。體外實驗也證實了利用涎液處理樹突細(xì)胞可增加病毒的載量，并降低病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α、IL-6以及病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 (Fialováetal., 2010)。肩突硬蜱涎液中的Sialostatin L2就具有抑制干擾素，促進(jìn)TBEV在樹突細(xì)胞復(fù)制的能力(Lieskovskáetal., 2015)。除病毒外，蜱類共同吸血傳播還發(fā)生在胞間寄生的病原體如萊姆病螺旋體或胞內(nèi)寄生的立克次體R.conorii,R.parkeri和埃?？梭wEhrlichiamuris等。

3.1.3與蜱媒病原傳播相關(guān)的涎腺活性分子: 目前涎腺活性分子對病原體的作用主要表現(xiàn)在兩個方面，一是病原體在蜱體內(nèi)的復(fù)制和轉(zhuǎn)運，二是促進(jìn)病原體向宿主的傳播。其中，最典型的案例是萊姆病螺旋體的表型可塑性。在蜱體內(nèi)萊姆病螺旋體表達(dá)外膜蛋白A(Osp A)，并通過中腸的Osp A特異性受體結(jié)合至蜱類中腸。隨著蜱類在寄主動物體表開始吸血，在ROS系統(tǒng)調(diào)控下，萊姆病螺旋體上調(diào)表達(dá)外膜蛋白C(Osp C)同時下調(diào)外膜蛋白A(Osp A)的表達(dá)，并突破中腸屏障向血淋巴和涎腺遷移。當(dāng)螺旋體由涎腺釋放進(jìn)入涎液，萊姆病螺旋體又分別同涎液中的諸多活性分子相互作用，包括調(diào)控T細(xì)胞的Salp15、抑制補體反應(yīng)的Isac、Salp20以及作用于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及宿主免疫系統(tǒng)的其他組分等。(1)外泌體(exosome)等液泡系統(tǒng)(vesicles system) 液泡是由細(xì)胞囊泡系統(tǒng)生成，可運載生物活性多糖、脂類、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)，在細(xì)胞間交流并調(diào)控靶細(xì)胞功能的囊泡體。蜱類涎液中的液泡按直徑和功能可劃分為微體ectosome、外泌體exosome、自噬體autophagosome及凋亡體apotosome等。作為蜱類重要的分泌腺體，涎液中的涎腺外泌體等液泡體因其具有脂質(zhì)雙層膜，可作為載運工具長距離遞送涎液活性分子。涎液中液泡體除運送多樣化的涎腺活性分子外(包括具有免疫調(diào)節(jié)和自噬及凋亡誘導(dǎo)作用的小分子如mRNA、miRNA、ncRNA以及l(fā)ncRNA等)，還可遞送蜱媒病原體，如蘭加特病毒、發(fā)熱伴血小板綜合征病毒、森林腦炎病毒等。涎腺外泌體對多種涎腺活性分子乃至病原體的個性化分揀包裝機(jī)制和遞送至宿主后誘導(dǎo)的自噬和凋亡調(diào)控及宿主免疫調(diào)節(jié)，為解釋蜱媒病原突破蜱類涎腺釋放屏障機(jī)制，抑制蜱類和宿主動物的免疫脅迫提供了可靠的分子基礎(chǔ)(Robbinsetal., 2016)。(2)涎腺中B細(xì)胞抑制蛋白BIP可在螺旋體外膜蛋白C的誘導(dǎo)下抑制B淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)螺旋體向宿主的傳播(Hannieretal., 2003)。(3)Salp15 涎腺分泌Salp15可結(jié)合哺乳動物的CD4細(xì)胞(Gargetal., 2006)，并抑制CD4+T淋巴細(xì)胞的激活(Anguitaetal., 2002)。除此以外，Salp15還作為免疫保護(hù)抗原，降低螺旋體對宿主動物的感染載量(Ramamoorthietal., 2005；Daietal., 2009)。在蜱類涎腺中，螺旋體通過外膜蛋白OspC與Salp15結(jié)合，可有效保護(hù)螺旋體免于宿主動物抗體及補體的脅迫(Schuijtetal., 2008)，促進(jìn)螺旋體的傳播及其在宿主皮膚中繁殖(Ramamoorthietal., 2005)。除此以外，從篦子硬蜱、中華硬蜱的涎腺中也發(fā)現(xiàn)了Salp15的類似物如Salp15 Iric-1, Salp15 Isin-1a (Hoviusetal., 2008b, Wangetal., 2014)。(4)Salp25D 從肩突硬蜱分離出來優(yōu)勢免疫涎腺蛋白Salp25D在蜱類獲取螺旋體感染時作為抗氧化劑維護(hù)螺旋體的存活(Dasetal., 2001; Narasimhanetal., 2007)。(5)Salp20 腺蛋白Salp20通過與備解素properdin或P因子的結(jié)合，解離補體的C3轉(zhuǎn)換酶，抑制備選補體激活途徑(Tysonetal., 2007; Hourcadeetal., 2016)。Salp20的表達(dá)對于保護(hù)螺旋體免于在血漿激活因子H的輔助下被人血清水解具有重要意義。(6)tHRF(組氨酸釋放因子) 蜱類組氨酸釋放因子可結(jié)合哺乳動物的嗜堿性粒細(xì)胞并啟動組氨酸的釋放 (Mulengaetal., 2003b; Daietal., 2010)。該因子在蜱類快速吸血階段表達(dá)上調(diào)，通過提高血管的通透性增加血流滿足蜱類飽血以及萊姆病螺旋體感染的需要，對tHRF的基因沉默則影響蜱類的取食并降低宿主動物心臟和關(guān)節(jié)中的萊姆病螺旋體載量(Daietal., 2010)。組氨酸的血管擴(kuò)張作用對于促進(jìn)螺旋體的復(fù)制及其從中腸向血淋巴的擴(kuò)散、以及宿主動物的系統(tǒng)感染都具有重要意義(Daietal., 2010)。(7)TSLPI 蜱類涎腺凝集素途徑抑制劑 該抑制劑同人的凝集素補體系統(tǒng)相互作用，抑制中性粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞以及趨化因子的作用，保護(hù)病原體免疫凝集素補體途徑的殺滅(Schuijtetal., 2011)。(8)IrSPI 來源于篦子硬蜱涎腺的絲氨酸蛋白酶抑制劑IrSPI，屬于BPTI (bovine pancreatic trypsin inhibitor)/Kunitz家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑，它通過阻遏宿主的止血，促進(jìn)蜱類吸血和病原體的感染。對IrSPI的RNAi沉默可導(dǎo)致蜱類吸血受阻和蜱類涎腺中漢賽巴爾通體載量下降(Liuetal., 2014b)。(9)Salp 16 嗜吞噬細(xì)胞無形體的感染可誘導(dǎo)肩突硬蜱涎腺產(chǎn)生Salp16，該涎腺蛋白的表達(dá)對于無形體由血餐向蜱類涎腺的擴(kuò)散至關(guān)重要，也是蜱類持續(xù)感染嗜吞噬細(xì)胞無形體的特異需求(Sukumaranetal., 2006)。(10)sialostatin L2 肩突硬蜱涎腺蛋白sialostatin L2可通過阻遏caspase-1活性抑制炎性體的形成(Chenetal., 2014)。其他已知涎液活性成分及功能見表1。

3.1.4病原感染對涎腺活性分子基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的影響: 在涎腺作用于病原體同時，病原感染也對涎腺蛋白轉(zhuǎn)錄及表達(dá)產(chǎn)生著深刻的影響。目前僅有的幾項研究主要集中在變異革蜱與蒙特立克次體(Macalusoetal., 2003)、附突扇頭蜱與帕瓦泰勒蟲Theileriaparva(Neneetal., 2004)、微小扇頭蜱與中心無形體(Zivkovicetal., 2010; Mercado-Curieletal., 2011)、肩突硬蜱I.scapularis與嗜吞噬細(xì)胞無形體(Ayllónetal., 2015)及蘭加特病毒 Langat virus (McNallyetal., 2012)和篦子硬蜱與漢賽巴爾通體B.henselae(Liuetal., 2014b)，采用方法主要包括差異顯示PCR(ddPCR)(Macalusoetal., 2003)、表達(dá)序列標(biāo)簽測序(Neneetal., 2004)、抑制差減雜交(Zivkovicetal., 2010)、微陣列芯片(Mercado-Curieletal., 2011; McNallyetal., 2012)以及高通量測序等(Liuetal., 2014b; Ayllonetal., 2015)等。

不同病原體感染不同的媒介蜱類，其涎腺蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)出現(xiàn)了不同的動態(tài)，或上調(diào)或下調(diào)，或沉默或過表達(dá)。但總體而言，應(yīng)對病原體感染和傳播，涎腺蛋白基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的整體策略是最小的適合度代價(Mercado-Curieletal.，2011)，對于具有高度適應(yīng)關(guān)系的病原體與媒介來說，如中心無形體與微小扇頭蜱，病原體的感染對涎腺基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)影響不大；而對于兩者適應(yīng)程度較低的環(huán)附扇頭蜱Rhipicephalusannulatus和牛巴貝西原蟲B.bovis來說，病原體的感染則影響較大(Ouhellietal., 1987)。

在病原體感染對蜱類涎腺蛋白、尤其是免疫相關(guān)涎腺蛋白的調(diào)控已有不少報道。如蘭加特病毒對肩突硬蜱(McNallyetal., 2012)、漢賽巴爾通體B.henselae對篦子硬蜱(Liuetal., 2014b)、中心無形體對微小扇頭蜱BME26 (Rosaetal., 2016)的作用就是下調(diào)免疫相關(guān)基因，包括涎腺蛋白編碼基因。除下調(diào)免疫相關(guān)基因外，病原體的感染可上調(diào)組氨酸釋放因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，誘導(dǎo)巨細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放組氨酸。tHRF的上調(diào)已在肩突硬蜱感染萊姆病螺旋體(Daietal., 2010)和變異革蜱感染蒙特立克次體(Mulengaetal., 2003a)時得以證實。另外，值得一提的是涎液中的鈣網(wǎng)結(jié)合蛋白基因CRT，該蛋白已從美洲花蜱、變異革蜱D.variabilis(Jaworskietal., 1995) 和微小扇頭蜱 (Ferreiraetal., 2002) 以及篦子硬蜱 (Cottéetal., 2014)中得到鑒定。鈣網(wǎng)結(jié)合蛋白通過與經(jīng)典補體激活通路的第一組分C1q結(jié)合，抑制血栓及補體反應(yīng)進(jìn)而影響蜱類吸血和病原體傳播(Kimetal., 2015)。同時，具有抗菌特性的5.3 kDa的抗菌肽也可通過蜱類Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子通路(Janus kinase/signal transducers and activators of transcription signal transduction pathway)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分泌至蜱類涎液(Pichuetal., 2009)。蘭加特病毒(McNallyetal., 2012)、萊姆病螺旋體(Ribeiroetal., 2006)以及嗜吞噬細(xì)胞無形體(Liuetal., 2012)對肩突硬蜱的感染可引起該抗菌肽家族基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)。

4 涎腺與蜱媒疾病的防控

4.1 蜱暴露的分子標(biāo)記

叮咬是蜱暴露的主要形式，蜱類叮咬人群或動物會在動物體內(nèi)遺留蜱類活性分子，其中，對于蜱暴露最具有意義的是涎腺及涎液活性分子。早在1990年，通過叮咬注入的涎腺蛋白及其引起的抗體反應(yīng)就被用作蜱暴露的分子標(biāo)記(Schwartzetal., 1990)。盡管蜱暴露分子標(biāo)記對于蜱媒疾病的診斷和風(fēng)險評價具有重要意義，然而其最大挑戰(zhàn)在于蜱類涎液的抗原標(biāo)記的精準(zhǔn)鑒定及其不同種屬間區(qū)分度；其他媒介生物的涎液分子亦可干擾蜱暴露的分析判斷，因而，基于涎液免疫檢測的特異性是利用涎液分子標(biāo)記進(jìn)行蜱暴露分析的先決條件(Fontaineetal., 2011)。這可能還需要對基于不同蜱種涎液組分的海量數(shù)據(jù)整體性分析。盡管早在1990年超聲破碎的涎腺蛋白抗體已被提議作為人蜱暴露的分子標(biāo)記，然而，由于這種方法過于簡單且特異性很差限制了它在蜱媒病流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用。后來，重組的鈣網(wǎng)蛋白CRT也被用作肩突硬蜱暴露的分子標(biāo)記，其特異性有所提高，但敏感性仍低于全涎腺蛋白(Sandersetal., 1999)。同時，涎腺蛋白抗體也被用于調(diào)查對蜱暴露的影響(Malouinetal., 2003)。對人群而言，蜱類涎腺蛋白抗體還需要考慮效期和交叉反應(yīng)問題。一般地，涎腺蛋白抗體可在人血清中持續(xù)1年半之久(Alarcon-Chaidezetal., 2006)，而血紅扇頭蜱的涎腺蛋白Rs24p抗體在宿主狗體內(nèi)只有很短時間(Medlocketal., 2013; Liuetal., 2014)。

4.2 候選疫苗抗原

蜱類涎腺分泌的活性分子，除了抗凝、止血、舒張血管的作用(Stibraniovaetal., 2019)，涎腺蛋白也是理想的候選疫苗抗原，如蜱類涎腺分泌的粘質(zhì)蛋白4TRP接種可保護(hù)小鼠免受感染蜱的叮咬侵襲(Labudaetal., 2006)，這表明，不僅蜱蟲粘質(zhì)的天然和密封劑特性可作為新型醫(yī)用粘合劑進(jìn)行開發(fā)，而且其粘質(zhì)蛋白可作為抗蜱蟲和病原體傳播的潛在疫苗靶標(biāo)(Suppanetal., 2018)加以應(yīng)用?？跪缫呙绾涂共≡w疫苗一直是無害化且有效的蜱媒病防治手段。用于控制家畜蜱蟲感染的第一批疫苗已于1990年代初上市(de la Fuenteetal., 2007)。這些疫苗，如含有微小扇頭蜱BM86或BM95抗原的重組疫苗 (de la Fuenteetal., 2007)等并不能預(yù)防蜱蟲感染，而是通過影響蜱類對動物吸血、繁殖和發(fā)育，降低蜱蟲種群密度和蜱傳病原體(TBP)的流行率(de la Fuenteetal., 2007)。近來研究發(fā)現(xiàn)，蜱源性抗原和病原體源性抗原結(jié)合起來可以提高疫苗對TBDs的控制效果(Merinoetal., 2013)。其中，蜱類涎腺蛋白可作為疫苗候選抗原具備阻斷病原體傳播的潛能，如Salp15 (Daietal., 2009)、TSLPI (Schuijtetal., 2011)、tHRF (Daietal., 2010)、 Salp25D (Wagemakersetal., 2016)以及64TRP (涎腺粘質(zhì)蛋白) (Labudaetal., 2006)等。這些蛋白的免疫活動，如肩突硬蜱唾液蛋白Salp15和萊姆病螺旋體外膜蛋白OspA/OspC聯(lián)合免疫對小鼠的免疫保護(hù)，比任一抗原單獨免疫更有效(Daietal., 2009)。Salp15抗體的產(chǎn)生對病原體，如萊姆病螺旋體的侵染、適應(yīng)和傳播具有顯著的抑制作用(Daietal., 2009)。Subolesin也被發(fā)現(xiàn)并被描述為一種蜱蟲保護(hù)性抗原，用于控制肩突硬蜱感染(Almazánetal., 2003, 2005)。而后Subolesin/Akirin被運用于疫苗研制，以控制不同節(jié)肢動物的侵?jǐn)_以及病原體感染/傳播(de la Fuenteetal., 2006a, 2011)。Subolesin抗體可通過目前未知的機(jī)制進(jìn)入蜱細(xì)胞，并與胞質(zhì)Subolesin相互作用以防止其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，從而發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能(de la Fuenteetal., 2011)。這些結(jié)果證明了靶向媒介感染和病原體感染/傳播的蜱源性抗原和病原體衍生抗原，應(yīng)用于控制蜱媒病防控是可行的(de la Fuente和 Contreras, 2015)。因而，基因組學(xué)分析及其相關(guān)的反向遺傳學(xué)研究將在解析蜱類涎腺對病原體的感染反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡、繁殖和存活等功能方面發(fā)揮重要作用(Umemiya-Shirafujietal., 2019)。利用基因編輯CRISPR-Cas9等(Sanderetal., 2014)手段，改造蜱類涎腺及其傳播蜱媒病原的功能基因，也將是未來實現(xiàn)蜱媒病防治目的的有效手段。

表1 蜱類涎腺活性分子的靶標(biāo)、功能及其作用Tab.1 Biological activities of tick saliva and salivary molecules in modulation of host defense reactions

表1續(xù) Tab.l Continued