秦 通 邢 丹 張美娜 施明杰 孫 毅** 蔣寶貴

(1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，媒介生物危害和自然疫源性疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071 2.中國(guó)人民解放軍91638部隊(duì)衛(wèi)生所,北京 102202)

蜱是一種專(zhuān)性吸血的媒介節(jié)肢動(dòng)物,廣布于世界五大洲許多國(guó)家和地區(qū)(Andersonetal.,2008),且能將多種病原體(包括細(xì)菌、真菌、立克次體、原生動(dòng)物、線蟲(chóng)、病毒及毒素等)傳播給人類(lèi)、牲畜和野生動(dòng)物,引發(fā)多種蜱媒傳染病的流行(Jiaetal., 2020),因此,蜱類(lèi)及其傳播的蜱媒疾病是當(dāng)前傳染病防控的重要對(duì)象,而其中影響或制約蜱媒病原傳播的蛋白修飾或降解過(guò)程更是明確蜱媒病原傳播分子機(jī)制、揭示病原—宿主相互關(guān)系的關(guān)鍵環(huán)節(jié)(Hajdu?eketal., 2013)。

作為最普遍的蛋白質(zhì)翻譯后修飾因子之一,泛素在所有真核生物廣泛存在且高度保守。由E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶組成的三級(jí)酶聯(lián)反應(yīng)組成的泛素化過(guò)程是生物體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后的修飾、降解的重要過(guò)程,是蜱類(lèi)與病原體之間蛋白質(zhì)相互作用的重要方式之一(Cabezas-Cruzetal., 2019)。其中，E3泛素連接酶因其嚴(yán)格控制泛素化反應(yīng)的效率和底物特異性成為泛素化級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵成分(Zhengetal., 2017)。研究表明，E3泛素連接酶是細(xì)胞體液免疫所必需的。E3泛素連接酶VHL通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)依賴的糖酵解途徑正向調(diào)節(jié)TFH細(xì)胞的早期啟動(dòng)，從而成為T(mén)FH細(xì)胞在急性病毒感染或抗原免疫時(shí)發(fā)揮功能所必需(Zhuetal., 2019)。一些病原體通過(guò)對(duì)宿主體內(nèi)E3泛素連接酶的誘導(dǎo)與控制，實(shí)現(xiàn)在宿主體內(nèi)的免疫逃逸或病原體的復(fù)制。如登革病毒2(DENV2)在感染期間通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)而誘導(dǎo)E3泛素連接酶SIAH1的表達(dá),SIAH1與先天性免疫接頭蛋白MyD88結(jié)合并泛素化,最終實(shí)現(xiàn)抑制宿主的先天免疫反應(yīng)和促進(jìn)登革病毒2(DENV2)復(fù)制(Schaferetal., 2020)。還有一些病毒，通過(guò)招募宿主的E3泛素連接酶來(lái)促進(jìn)病毒的復(fù)制和釋放。例如埃博拉病毒(EBOV)的VP40基質(zhì)蛋白(EVP40)和馬爾堡病毒(MARV)的VP40基質(zhì)蛋白(MVP40),兩者的PPxY型L結(jié)構(gòu)域通過(guò)其WW結(jié)構(gòu)域招募宿主的E3泛素連接酶，以促進(jìn)病毒的復(fù)制和釋放(Hanetal., 2016)。此外,E3泛素連接酶還參與了傳染性病毒粒子的釋放。E3泛素連接酶與拉薩病毒(LASV)、莫佩亞病毒(MOPV)和其他病毒的Z蛋白結(jié)合，參與了病毒樣顆粒的釋放和傳染性子代病毒的釋放(Bailletetal., 2020)。更有甚者，有些病毒利用自身病毒蛋白來(lái)攜帶E3泛素酶活性，從而達(dá)到病毒在宿主體內(nèi)生存發(fā)展的某些條件，如新近發(fā)現(xiàn)的托斯卡納病毒(Toscana virus, TOSV)，其非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-Structure Protein, NSs)本身就是負(fù)鏈RNA病毒中首次發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有非典型的RBR(RING between RING)結(jié)構(gòu)的E3泛素連接酶，它是通過(guò)泛素化介導(dǎo)靶點(diǎn)蛋白降解、實(shí)現(xiàn)免疫逃避的主要功能單元(Gori Savellinietal., 2019)。因而，E3泛素連接酶在病原體的復(fù)制、擴(kuò)散與免疫逃避等眾多方面發(fā)揮著重要作用。本研究以真核生物體內(nèi)普遍存在且高度保守的E3泛素連接酶為切入點(diǎn)，對(duì)主要媒介蜱類(lèi)E3泛素連接酶的多態(tài)性進(jìn)行初步探討，以期為進(jìn)一步揭示蜱蟲(chóng)對(duì)多種病原體的媒介作用的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

森林革蜱Dermacentorsilvarum：2020年4月采自內(nèi)蒙古扎蘭屯市巴林鎮(zhèn)風(fēng)景區(qū)(N47° 49′07″， S 122° 28′7″)，20只為一組，雄性(QTHTS_01)，雌性(QTHTS_02～03)。

全溝硬蜱Ixodespersulcatus和嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna2020年7月采自牡丹江市海林縣大石溝林場(chǎng)(N44° 59′26″， S 129° 38′12″)。20只為一組，全溝硬蜱雌性(QTHTS_04～05)、全溝硬蜱雄性(QTHTS_06)，森林革蜱雄性QTHTS_07)、森林革蜱雌性QTHTS_08)。

1.2 試劑來(lái)源

DNA/RNA共提試劑盒(DNA/RNA Isolation Kit)和不含RNA酶的DNA酶I(RNase-Free DNase I)均由天根生化科技(北京)有限公司提供。

1.3 核酸提取與高通量測(cè)序

根據(jù)高通量測(cè)序?qū)颖緷舛鹊囊?，結(jié)合濃度差異以20只為測(cè)序單位，建立8組測(cè)序單位。委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行RNA高通量測(cè)序。

1.4 序列及結(jié)構(gòu)分析方法

利用軟件CLC Genomics Workbench v3.6.1對(duì)所得的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，主要包括去雜(trinity)、拼接(assembly)、比對(duì)(alignment)、翻譯(translation)等步驟獲得可用的序列數(shù)據(jù)；再利用BLAST工具(www.ncbi.nlm.nih.gov)將所得的序列數(shù)據(jù)與GenBank中注冊(cè)的基因序列進(jìn)行同源性比較。與此同時(shí),利用NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(kù)(CDD)對(duì)獲得的氨基酸序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行注釋(Marchler-Baueretal., 2011)并推斷其功能位點(diǎn)。

表1 高通量測(cè)序結(jié)果Tab.1 High-throughput sequencing result

1.5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

以嗜群血蜱E3泛素連接酶CDS同源序列為基礎(chǔ)，在已完成全基因組測(cè)序的長(zhǎng)角血蜱(CM023451.1)中檢索同源序列；同樣，以肩突硬蜱E3泛素連接酶CDS在已完成基因組測(cè)序的全溝硬蜱(JABSTQ010009524.1)中檢索同源序列；以此類(lèi)推，我們獲得了亞洲璃眼蜱(CM023483.1)的E3泛素連接酶CDS同源序列。同時(shí),從GenBank獲得其他相關(guān)節(jié)肢動(dòng)物的E3泛素連接酶編碼序列，包括軟蜱科圖卡鈍緣蜱Ornithodorosturicata、森林革蜱D.silvarum、網(wǎng)紋革蜱D.reticulatus、亞洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum、肩突硬蜱I.scapularis、蓖子硬蜱I.ricinus、微小扇頭蜱Rhipicephalusmicroplus、血紅扇頭蜱R.sanguineus、麗色扇頭蜱R.pulchellus、黃色大蜜蜂Apisdorsata、麗蠅蛹集金小蜂N(xiāo)asoniavitripennis、大腹鬼蛛Araneusventricosus、橫紋金蛛Argiopebruennichi等。基于這15個(gè)節(jié)肢動(dòng)物的E3泛素連接酶CDS同源序列，以黑猩猩Pantroglodytes為外群，采用鄰接法Neighbor-Join 和 BioNJ 算法構(gòu)建基于E3泛素連接酶SH3RF異構(gòu)體編碼序列遺傳距離的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并對(duì)模型進(jìn)行最大似然估計(jì)(Maximum Composite Likelihood approach, MCL)以評(píng)價(jià)系統(tǒng)發(fā)育的有效性，NJ的構(gòu)建與評(píng)估由MEGA7.0系統(tǒng)完成。

2 結(jié)果

2.1 高通量質(zhì)量評(píng)估

8組測(cè)序結(jié)果整體測(cè)序錯(cuò)誤率均小于5%(表1)，原始讀長(zhǎng)數(shù)與清潔讀長(zhǎng)數(shù)十分接近，表明此次高通量測(cè)序質(zhì)量較高，結(jié)果可信。

2.2 媒介蜱類(lèi)E3泛素連接酶的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

從8組樣品分別獲得了與已知蜱類(lèi)E3泛素連接酶高度同源(氨基酸序列大于80%)的編碼序列，經(jīng)Blast同源比對(duì)從森林革蜱發(fā)現(xiàn)E3泛素連接酶高度同源序列2條(MW354543、MW354544)、嗜群血蜱1條(MW354545)。森林革蜱、嗜群血蜱的同源序列同已知的森林革蜱E3泛素連接酶SH3RF3異構(gòu)體的同源性分別達(dá)到99.30%～99.56%(森林革蜱)和76.29%(嗜群血蜱)，而同肩突硬蜱E3泛素連接酶SH3RF3異構(gòu)體差異較大，同源性僅達(dá)64.01%～66.11%(森林革蜱)和72.38%(嗜群血蜱)(表2)。

E3泛素連接酶SH3RF3異構(gòu)體的氨基酸序列在進(jìn)化中表現(xiàn)出種屬特異性特征，且這些特征差異隨蜱種的分類(lèi)地位和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系逐漸分化(圖1)；其中，以圖卡鈍緣蜱Ornithorodosturicata為代表的軟蜱科與硬蜱科之間形成了明顯的分支；硬蜱科中以硬蜱屬為代表的硬蜱亞科形成獨(dú)立分支，同扇頭蜱亞科(革蜱屬Dermacentor、扇頭蜱屬Rhipicephalus)、璃眼蜱亞科(璃眼蜱屬Hyalomma)以及血蜱亞科(血蜱屬Haemaphysalis)差異顯著；而后三者中，血蜱亞科分化較遠(yuǎn)，璃眼蜱亞科次之，扇頭蜱亞科中的革蜱屬和扇頭蜱屬則比較接近。

表2 高通量測(cè)序所獲得得蜱類(lèi)E3泛素連接酶Tab.2 The E3 Ubiquitin Ligase sequences obtained by high throughput sequencing

圖1 基于E3泛素連接酶SH3RF3異構(gòu)體氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic analysis based on E3 ubiquitin ligase SH3RF3 amino acid sequences of different vector tick species

2.3 主要媒介蜱類(lèi)E3泛素連接酶的結(jié)構(gòu)多態(tài)性特征

圖2 主要蜱類(lèi)E3泛素連接酶結(jié)構(gòu)域推測(cè)Fig.2 Conserved domain speculation of E3 ubiquitin ligase of major ticksa: E3泛素連接酶SH3RF3結(jié)構(gòu)模式圖; b: E3泛素連接酶SH3RF2結(jié)構(gòu)模式圖; c: 森林革蜱E3泛素連接酶保守結(jié)構(gòu)域(MW354543、MW354544); d: 全溝硬蜱E3泛素連接酶保守結(jié)構(gòu)域; e: 嗜群血蜱E3泛素連接酶保守結(jié)構(gòu)域; f: 長(zhǎng)角血蜱E3泛素連接酶保守結(jié)構(gòu)域; g: 亞洲璃眼蜱E3泛素連接酶保守結(jié)構(gòu)域.a: Conserved domain on E3 ubiquitin-protein ligase SH3RF3; b: Conserved domain on E3 ubiquitin-protein ligase SH3RF2; c: Conserved domain speculation on Dernacentor silvarum MW354543 and MW354544; d: Conserved domain speculation on Ixodes persulcauts; e: Conserved domain speculation on Haemaphysalis concinna MW354545; f: Conserved domain speculation on Haemaphysalis longicornis; g: Conserved domain speculation on Hyalomma asiaticum.

測(cè)序獲得的森林革蜱E3泛素連接酶(MW354543)與GenBank中的E3 ubiquitin-protein ligase SH3RF3-like isoform X1 [D.silvarum]雖然在氨基酸序列上偶有變化，但是在5個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列比對(duì)結(jié)果完全一致(圖2-c)；MW354544除在起始的N端的環(huán)指結(jié)構(gòu)RING-HC_SH3RF3存在大量的缺失外，C端的SH3_SH3RF_C和3個(gè)SH3保守域完全相同(圖2-c)?？梢?jiàn)，森林革蜱轉(zhuǎn)錄獲得的MW354543、MW354544應(yīng)為SH3RF3型E3泛素連接酶，該酶在轉(zhuǎn)錄過(guò)程可出現(xiàn)N端的環(huán)指結(jié)構(gòu)缺失現(xiàn)象。同時(shí)，從全溝硬蜱Ixodespersulcatus(JABSTQ010009524.1)中檢索獲得E3泛素連接酶與肩突硬蜱SH3RF3的5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域同源性高度一致(圖2-d)，亦為SH3RF3型。

嗜群血蜱E3泛素連接酶(MW354545)僅包含位于N端的RING鋅指結(jié)構(gòu)域和接下來(lái)的3個(gè)SH3域(SH3_SH3RF2_1、SH3_SH3RF2_1、SH3_SH3RF2_3)，沒(méi)有C端的SH3_SH3RF2_C (Luetal., 2020)(圖2-e)。SH3域又稱為POSHER，其功能是消除RING蛋白或心臟蛋白磷酸酶1結(jié)合蛋白 (HEPP1)。SH3RF3有4個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域。與之不同，SH3RF2型E3泛素蛋白連接酶僅具3個(gè)SH3域(圖2-a、圖2-b)。依據(jù)結(jié)構(gòu)特征, 嗜群血蜱的MW354545應(yīng)為SH3RF2型E3泛素連接酶。同樣，從基因組測(cè)序檢索獲得的長(zhǎng)角血蜱(CM023451.1)E3泛素連接酶在RING-HC結(jié)構(gòu)域和3個(gè)SH3域同嗜群血蜱同源性高度一致，保守域結(jié)構(gòu)也完全一致(圖2-f)，應(yīng)為SH3RF2型。

亞洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum(CM023483.1)的全基因組中檢索獲得的E3泛素連接酶序列結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不屬于已知的SH3RF1、SH3RF2和SH3RF3(圖2g)，可能為中間類(lèi)型。

3 討論

泛素化是生物體普遍存在的、調(diào)控蛋白質(zhì)合成、加工、代謝過(guò)程的重要生理機(jī)制。泛素化過(guò)程是由E1泛素激活酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素蛋白連接酶組成的三酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。E1酶以依賴于三磷酸腺苷的方式激活泛素并將其轉(zhuǎn)移到E2酶上，E2酶的活性位點(diǎn)半胱氨酸與泛素的C端羧基形成硫酯鍵。E3泛素連接酶與同時(shí)負(fù)載泛素的E2酶和特定底物相互作用介導(dǎo)泛素的轉(zhuǎn)移，最終在底物的賴氨酸ε氨基和泛素的C端羧基之間形成異肽鍵。E3泛素連接酶因其嚴(yán)格控制泛素化反應(yīng)的效率和底物特異性，所介導(dǎo)的泛素與底物結(jié)合形式復(fù)雜多樣，是泛素化級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程的關(guān)鍵成分(Zhengetal., 2017)。目前，根據(jù)E3連接酶的特征結(jié)構(gòu)域和泛素轉(zhuǎn)移蛋白底物的機(jī)制，可分為3種主要類(lèi)型：(1)RING E3s，這是泛素連接酶中含量最豐富的一種類(lèi)型，其特征是存在1個(gè)被稱為RING的鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者是1個(gè)U-box結(jié)構(gòu)域，能介導(dǎo)泛素直接轉(zhuǎn)移到底物上、發(fā)揮支架的作用。(2)HECT E3s, 其功能是通過(guò)兩步反應(yīng)催化泛素轉(zhuǎn)移到蛋白底物，泛素首先轉(zhuǎn)移催化E3上的半胱氨酸，然后再?gòu)腅3轉(zhuǎn)移到蛋白底物。(3)RBR E3s，其功能同樣是通過(guò)兩步反應(yīng)催化泛素轉(zhuǎn)移，RBR名稱源于兩個(gè)預(yù)測(cè)的環(huán)狀域(RING1和RING2)的存在，兩個(gè)環(huán)狀域由環(huán)間結(jié)構(gòu)域(IBR)分隔(Morreale et al., 2016)。其中，SH3RF3是具有活性的E3泛素蛋白連接酶的支架蛋白，它包含5個(gè)保守域，分別是位于N端的RING-HC_SH3RF3與4個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域。SH3RF1與SH3RF3高度同源，也具4個(gè)SH3域；與之不同，SH3RF2型E3泛素蛋白連接酶僅具3個(gè)SH3域。SH3結(jié)構(gòu)域以其中等親和力和選擇性，優(yōu)先于PxxP基序同富含脯氨酸的配體特異性結(jié)合，在細(xì)胞中發(fā)揮著酶促反應(yīng)調(diào)節(jié)、信號(hào)通路組分的亞細(xì)胞定位以及介導(dǎo)多蛋白復(fù)合物裝配等多種功能 (Luetal., 2020)。

泛素化機(jī)制在節(jié)肢動(dòng)物中普遍存在，果蠅E3泛素連接酶CTRIP和Slimm/β-TrCP被證實(shí)具有調(diào)節(jié)生物鐘(Lamazeetal., 2011)和維持體內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)的生理作用 (Zhangetal., 2020)。更為重要的是泛素化機(jī)制在媒介節(jié)肢動(dòng)物感染和傳播病原微生物的過(guò)程中也發(fā)揮十分重要的生理作用。庫(kù)蚊體內(nèi)的泛素連接酶Cullin 4(cullin RING ubiquitin ligase)具有親病毒性，上調(diào)表達(dá)的Cullin 4可促進(jìn)西尼羅病毒(WNV)在庫(kù)蚊體內(nèi)的復(fù)制(Paradkaretal., 2015)。肩突硬蜱體內(nèi)的E3泛素連接酶XIAP會(huì)調(diào)控嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體在其體內(nèi)的定植(Severoetal., 2013)。果蠅體內(nèi)的E3泛素連接酶dSmurf是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞突觸重塑和軸突修剪所必需的重要成分(Chenetal., 2017)，雌性果蠅突觸復(fù)合體的組裝和分解也受體內(nèi)E3泛素連接酶Sina的調(diào)節(jié)(Hughesetal., 2019)。由此可見(jiàn)，深入分析媒介節(jié)肢動(dòng)物的泛素化作用特征及其介導(dǎo)的傳播效能將是明確病原—媒介和宿主關(guān)系的重要契機(jī)。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同蜱種轉(zhuǎn)錄表達(dá)的E3泛素連接酶在種類(lèi)和亞型(異構(gòu)體)方面呈多樣化態(tài)勢(shì)，這種多樣化態(tài)勢(shì)是否同感染的特定蜱媒病原體(萊姆病螺旋體(Andersonetal., 1991)、森林腦炎(Dumpisetal., 1999)等)、抑或與蜱類(lèi)吸血狀態(tài)相關(guān)，尚需深入系統(tǒng)地開(kāi)展研究。 除此之外，盡管基因組檢索證實(shí)了E3泛素連接酶SH3RF3亞型的存在，但事實(shí)上3組60只全溝硬蜱均未獲得SH3RF亞型同源序列的轉(zhuǎn)錄結(jié)果，其可能的原因是(1)E3泛素連接酶編碼基因可有選擇性地轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在特定情況下，病毒等病原體相關(guān)核酸小分子(dsRNA、siRNA)的干擾沉默可導(dǎo)致不表達(dá)。(2)病毒等病原體的感染誘發(fā)了蜱類(lèi)泛素化蛋白修飾機(jī)制，轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的SH3結(jié)構(gòu)功能蛋白瞬時(shí)被C Jun氨基末端激酶(C Jun-N-terminal Kinase, JNK)通路中的POSHER(消除)作用完全消耗。POSHER過(guò)程需要大量的泛素化支架蛋白以充當(dāng)蜱類(lèi)靶標(biāo)器官或組織抗凋亡調(diào)節(jié)劑。鑒于泛素化蛋白修飾機(jī)制在諸多病原體的感染、傳播、宿主調(diào)節(jié)和免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用，媒介生物E3泛素連接酶對(duì)不同病原體介導(dǎo)作用及其內(nèi)在分子機(jī)制也是亟待深入探討的基礎(chǔ)性科學(xué)問(wèn)題。譬如，近年來(lái)肆虐的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV)已經(jīng)證實(shí)可通過(guò)長(zhǎng)角血蜱進(jìn)行經(jīng)卵和經(jīng)期傳播(Zhuangetal., 2018)，但該病毒對(duì)媒介蜱種的選擇性是否與長(zhǎng)角血蜱E3泛素連接酶的特異性表達(dá)相關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。