王晉鵬 羅仍卓么 王興平 楊箭 賈立 馬云 魏大為

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2. 寧夏回族自治區(qū)反芻動(dòng)物分子細(xì)胞育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021）

奶牛乳腺炎是乳腺組織受到病原微生物感染和理化因素刺激等發(fā)生的炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致奶牛泌乳量減少、奶品質(zhì)下降、生長(zhǎng)發(fā)育減緩、繁殖力降低、產(chǎn)奶年限縮短和死淘率上升，造成牧場(chǎng)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界奶牛乳腺炎的發(fā)病率高達(dá)50%，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失約350億美元［2］；在我國(guó)，奶牛乳腺炎的發(fā)病率高于國(guó)外，且每年造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)30億元［3］。因此，奶牛乳腺炎是一個(gè)亟需解決的難題。為了能夠及時(shí)有效地預(yù)防和治療奶牛乳腺炎，研究人員不斷優(yōu)化檢測(cè)方法和治療策略（圖1），并積極探索未來(lái)的發(fā)展方向。目前，雖然在奶牛乳腺炎的致病原因和治療等方面取得了一定的進(jìn)展，但對(duì)奶牛乳腺炎治療的分子作用機(jī)制還不是十分清楚。其治療的分子作用機(jī)制對(duì)于精準(zhǔn)的藥物研發(fā)至關(guān)重要。本文綜述了奶牛乳腺炎的致病原因、治療及抗炎的分子機(jī)制等方面的最新研究進(jìn)展，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研發(fā)人員提供有效的參考資料和新的視野。

圖1 奶牛乳腺炎防治策略Fig.1 Control strategy of dairy cow mastitis

1 奶牛乳腺炎的致病原因

奶牛乳腺炎是遺傳、環(huán)境、管理和營(yíng)養(yǎng)等多種因素共同作用的結(jié)果［1，4］。有報(bào)道顯示，奶牛在飼養(yǎng)管理相同的條件下，乳腺炎的發(fā)生既與個(gè)體差異有關(guān)，也與自身健康狀況密切相關(guān)。在環(huán)境因素中，最常見(jiàn)的致病原因就是病原微生物感染［1］和血液循環(huán)障礙［5］。

1.1 病原微生物感染

引起奶牛乳腺炎的病原微生物一般分為接觸傳染性病原菌（又叫牛依賴性病原菌）和環(huán)境性病原菌（又叫條件病原菌），前者主要有無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae）、金黃色葡萄球菌（S. aureus）和停乳鏈球菌（S.dysgalactiae）等，后者主要是革蘭陰性菌，如大腸桿菌（E. coli）、沙雷氏菌（Serratia）和克雷伯菌（Klebsiella）等［6-7］。

大多數(shù)乳腺內(nèi)感染是由于病原微生物克服乳頭管的解剖物理屏障所致［7］。乳頭管是防止病原微生物入侵第一道防線，也是外界病原微生物進(jìn)入乳房的唯一途徑［8］。當(dāng)病原微生物入侵乳頭括約肌和乳頭管時(shí)，引起乳腺內(nèi)感染，由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞組成的第二道防線產(chǎn)生獲得性免疫反應(yīng)［4］。病原微生物一旦突破防線，進(jìn)入乳區(qū)，在乳頭池和乳腺池中定植，然后入侵到泌乳組織引起感染，從而產(chǎn)生炎癥，導(dǎo)致乳汁體細(xì)胞數(shù)（somatic cell count，SCC）顯著增加，若感染嚴(yán)重，會(huì)導(dǎo)致泌乳量減少，甚至停乳［4，7］。

1.2 血液循環(huán)障礙

乳腺內(nèi)乳汁的形成依賴于血液循環(huán)。在泌乳期，尤其是高產(chǎn)奶牛對(duì)乳房要進(jìn)行定期護(hù)理，若因操作不當(dāng)造成乳房血液循環(huán)障礙，會(huì)引起乳房局部淤血，造成組織缺氧、乳腺腺泡上皮細(xì)胞排列紊亂和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，使得乳腺組織對(duì)外界病原微生物的抵抗力下降，進(jìn)而環(huán)境性病原微生物入侵而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［5，9］。隨之受損乳腺的血管擴(kuò)張，血乳屏障通透性增加，血液中產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，滲出物很快在乳腺管內(nèi)凝固，造成泌乳障礙［9］。

此外，當(dāng)乳房受到理化因素刺激時(shí)，角蛋白和粘膜內(nèi)皮的乳頭竇受損，使得病原微生物易于入侵、定植和感染［4］。在形成感染區(qū)后，病原微生物快速增殖并擴(kuò)散到其他部位［1］，超出動(dòng)物機(jī)體自身免疫的防御能力，從而造成機(jī)體損傷并引發(fā)乳腺炎［4］。

2 奶牛乳腺炎治療及抗炎分子機(jī)制的研究

目前，抗生素作為治療奶牛乳腺炎的首選藥物和最佳途徑，取得了很好的療效。但是，長(zhǎng)期廣泛地使用抗生素，會(huì)導(dǎo)致一系列副作用，如抗生素殘留、耐藥性增加和奶品質(zhì)下降等，給人類健康帶來(lái)了巨大的安全隱患［1］。為了緩解這一現(xiàn)狀，研究人員一直在努力尋找合適的方案用于奶牛乳腺炎的預(yù)防和治療。至今為止，學(xué)者們開(kāi)展了多種物質(zhì)（生物活性物質(zhì)、礦物元素、維生素和生物制劑等）對(duì)奶牛乳腺炎分子治療技術(shù)的相關(guān)基礎(chǔ)研究，并取得了較好的結(jié)果。

2.1 生物活性物質(zhì)對(duì)奶牛乳腺炎的抗炎機(jī)制

E. coli和S. aureus是引起奶牛乳腺炎的主要的的病原微生物，可通過(guò)在乳腺組織中的快速繁殖和持續(xù)粘附，繼而導(dǎo)致臨床型和亞臨床型奶牛乳腺炎的發(fā)生［7］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）分別是E. coli和S.aureus細(xì)胞壁上的病原體相關(guān)模式分子，也是導(dǎo)致奶牛乳腺炎加劇的重要因素［10］。值得一提的是，中草藥富含酚類、酸類、生物堿和黃酮類等多種生物活性物質(zhì)，是純天然的“綠色”藥物，具有抗炎、抗菌和抗癌等生物活性。近年來(lái)，學(xué)者們以E. coli（或LPS）和S. aureus（或LTA）誘導(dǎo)的牛乳腺上皮 細(xì) 胞（bovine mammary epithetlial cells，bMECs）炎癥模型為研究材料，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多種生物活性物質(zhì)能抑制炎癥性bMECs中的腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、 白 細(xì) 胞 介 素 -1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素 -6（interleukin-6，IL-6）和白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)；阻斷κB抑制劑α（κB inhibitor α，IκBα）的降解和p65磷酸化（P-p65）來(lái)減弱核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號(hào)通路的活性；或抑制c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38和c-Jun并阻斷細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）磷酸化水平，使絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路的活性減弱；最終減輕bMECs的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞損傷（表1）。此外，還發(fā)現(xiàn)少數(shù)生物活性物質(zhì)能消除炎癥性bMECs的自由基，抑制活性氧（ROS）的產(chǎn)生，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，進(jìn)而保護(hù)機(jī)體免受炎癥損傷（表1），為奶牛乳腺炎治療的藥物研發(fā)奠定了很好的基礎(chǔ)。綜上所述，上述生物活性物質(zhì)具有較強(qiáng)的靶向抗炎作用，有望成為治療乳腺炎的潛在藥物，并解決藥物殘留和抗藥性的問(wèn)題。

表1 生物活性物質(zhì)對(duì)奶牛乳腺炎的抗炎機(jī)制Table 1 Anti-inflammatory mechanism of bioactive substances on cow mastitis

2.2 礦物元素對(duì)奶牛乳腺炎的治療機(jī)制

礦物元素可參與酶活性中心調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過(guò)程，在動(dòng)物生理過(guò)程和體內(nèi)代謝中都具有重要作用。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在嘗試用礦物元素治療奶牛乳腺炎方面展開(kāi)了積極的研究，并取得一定進(jìn)展。

研究表明，作為飼源性微量元素——硒（selenium，Se）在機(jī)體內(nèi)可發(fā)揮抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等生理功能［27-28］。Wang等［28］研究發(fā)現(xiàn)，Se能抑制 Toll樣受體 2（toll like receptors 2，TLR2）、NF-κB和MAPK信號(hào)通路的激活，從而顯著下調(diào)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)，進(jìn)而緩解S. aureus誘導(dǎo)的炎癥過(guò)程。此外，在小鼠乳腺炎中，發(fā)現(xiàn)Se缺乏會(huì)導(dǎo)致S. aureus性乳腺炎中TNF-α、IL-1β、IL-6和TLR2的表達(dá)量以及IκB、NF-κB、JNK 和p38的磷酸化水平均顯著增加［27，29］，這一結(jié)果進(jìn)一步證明Se對(duì)S. aureus性乳腺炎具有輔助抗炎治療的作用。

此外，金屬納米粒子主要包括銀納米粒子（AgNPs）、銅納米粒子（CuNPs）和合成的銀-銅納米粒子（AgCuNPs），是近期炎癥和癌癥治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［30］。研究表明，AgNPs具有潛在修復(fù)組織、抗菌、抗糖尿病和抗氧化的醫(yī)療保健效益，并有利于炎癥和癌癥的治療［30］。Kalińska 等［31］發(fā)現(xiàn)市售的AgNPs、CuNPs和AgCuNPs對(duì)人和bMECs無(wú)毒性作用，但能降低病原微生物的生存能力，然而分子機(jī)制尚不清楚。這些數(shù)據(jù)表明，金屬納米顆?？梢杂糜谖磥?lái)乳腺炎的預(yù)防和治療，有望成為治療奶牛乳腺炎的潛在藥物。

2.3 維生素對(duì)奶牛乳腺炎的抗炎機(jī)制

維生素是以輔酶的形式參與體內(nèi)代謝，對(duì)生物體的新陳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育和健康有極其重要的作用［32］，其中維生素A、維生素B3、維生素B9、維生素D和維生素E等對(duì)奶牛乳腺具有一定的保護(hù)作用。研究表明，維生素A能夠維持上皮細(xì)胞的完整性和細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)正常的通透性，可形成物理屏障抵御病原微生物的入侵，提高機(jī)體免疫力，降低隱性乳腺炎的發(fā)病率［33］。煙酸（維生素B3）通常用于改善奶牛能量負(fù)平衡、治療脂質(zhì)紊亂和心血管疾病，近年來(lái)也應(yīng)用于奶牛乳腺炎的治療［32，34］。Wei等［32］研究表明，煙酸對(duì)S. aureus的生長(zhǎng)和bMECs活力無(wú)影響，但對(duì)S. aureus的內(nèi)化抑制率為13%-42%，并能下調(diào)抗菌肽TAP和BNBD5的mRNA表達(dá)、抑制NF-κB的p65亞基從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，使NF-κB信號(hào)通路得到了抑制，從而減輕炎癥損傷。此外，Guo等［34］研究發(fā)現(xiàn)，煙酸能激活G蛋白偶聯(lián)受體109A（GPR109A）和磷酸化AMP依賴 蛋 白 激 酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK），促進(jìn)核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（nuclear factor erythrocyte two related factors-2，NRF-2）核導(dǎo)入和自噬，并降低細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-1β和TNF-α的表達(dá)，從而減輕LPS誘導(dǎo)的bMECs炎癥反應(yīng)。

隨著奶牛良種化程度、產(chǎn)奶量和飼養(yǎng)管理水平不斷升高，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)飼葉酸對(duì)預(yù)防和治療奶牛隱性乳腺炎也有積極的作用［35］。劉雪琴等［36］發(fā)現(xiàn)，給患隱性乳腺炎的奶牛補(bǔ)飼包被葉酸后，乳汁SCC顯著下降，且在補(bǔ)飼組檢測(cè)到105個(gè)顯著上調(diào)和172個(gè)顯著下調(diào)的基因，主要富集在細(xì)胞因子生成調(diào)控、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等免疫學(xué)調(diào)控相關(guān)的GO條目以及富集在腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用等炎癥和免疫學(xué)重要信號(hào)通路上，說(shuō)明葉酸可能通過(guò)上述通路而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，進(jìn)而對(duì)隱性乳腺炎有積極的預(yù)防作用。

研究表明，奶牛在干奶期給予維生素E-硒可增強(qiáng)乳區(qū)的免疫反應(yīng)，降低產(chǎn)犢時(shí)的乳腺感染，當(dāng)乳腺內(nèi)部受到病原微生物入侵時(shí)，巨噬細(xì)胞活化，分泌出大量的多形核白細(xì)胞（polymorphonuclear，PMN），PMN進(jìn)入乳腺，改變?nèi)橄俚膬?nèi)環(huán)境，發(fā)揮殺滅和吞噬細(xì)菌的功能［37］。因此，補(bǔ)充或注射維生素E-硒可增強(qiáng)乳腺免疫系統(tǒng)。此外，維生素D可抑制 S. aureus感染的 bMECs中IL-10、IL-1β和TNF-α的表達(dá)，從而減輕炎癥損傷，是乳腺炎良好的調(diào)節(jié)劑［38］。

綜上所述，目前維生素在奶牛乳腺炎的作用，更多是提高機(jī)體免疫力，緩解奶牛乳腺炎，并不能從根本上解決問(wèn)題，而且缺乏大規(guī)模對(duì)照試驗(yàn)，使其不能推廣使用。因此，未來(lái)亟需更深入的研究補(bǔ)充維生素的種類、最佳劑量和投喂時(shí)間，及其對(duì)產(chǎn)奶性能的影響等補(bǔ)飼細(xì)節(jié)，方可在改善奶牛乳腺炎中推廣應(yīng)用。

2.4 生物制劑對(duì)奶牛乳腺炎治療的機(jī)制

生物制劑主要是由動(dòng)物細(xì)胞、微生物及其代謝物和動(dòng)物血液等產(chǎn)品加工而成，不僅能預(yù)防和治療相關(guān)疾病，而且具有針對(duì)性強(qiáng)、治療效果明顯、多靶點(diǎn)殺菌、無(wú)毒和無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)［39］。迄今為止，學(xué)者們進(jìn)行了抗菌肽［40］、溶菌酶［41］和乳酸菌［42］等生物制劑在奶牛乳腺炎中的治療及其機(jī)制方面的研究，并取得相應(yīng)成果。

抗菌肽在動(dòng)物體內(nèi)可直接抑制或殺滅病毒、真菌、細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞［40］，是最近在抗炎機(jī)制上研究較多的生物制劑。研究表明，bMECs表達(dá)的多種抗菌肽，可通過(guò)直接作用于微生物感染，并作為炎癥反應(yīng)的一個(gè)組成部分積極促進(jìn)天然免疫的形成［43］。李連彬［40］通過(guò)對(duì)菌絲霉素源抗菌肽（NZ2114和MP1102）在bMECs中殺菌效果的研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)S.aureus E48的殺菌效果較好，原因是能抑制炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的迅速升高，緩解由S. aureus引起的乳腺炎癥反應(yīng)。此外，β-防御素是一類具有固有免疫的抗菌肽（主要包括DEFB1、BNBD4、BNBD5和BNBD10等成員）［44］。當(dāng)奶牛乳腺受到病原微生物感染時(shí)，β-防御素的表達(dá)水平顯著上調(diào)［45］，可啟動(dòng)固有免疫，從而發(fā)揮殺滅細(xì)菌、抗炎和保護(hù)機(jī)體的功效。

溶菌酶是一種消炎、抗菌和抗病毒的堿性酶，既能水解致病菌中的粘多糖，也能與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，使病毒失活［41］。于是，孫懷昌等［46］構(gòu)建了人溶菌酶基因的重組質(zhì)粒，并將其注射到患有奶牛乳腺炎的病牛中，結(jié)果顯示，人溶菌酶基因的重組質(zhì)粒對(duì)奶牛乳腺炎具有良好的治療效果，且呈現(xiàn)出劑量和次數(shù)依賴性。究其原因有3點(diǎn)：（1）溶菌酶對(duì)細(xì)菌具有一定的溶解能力；（2）溶菌酶能夠增強(qiáng)PMN和巨噬細(xì)胞的消化、吞噬能力以及抗菌素等其他藥物消炎和修復(fù)組織的能力等；（3）該溶菌酶質(zhì)粒是在pUC質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建的，該質(zhì)粒中的CpG序列可激活以IL-6、IL-12和干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）等產(chǎn)生為特征的非特異性免疫應(yīng)答，提高機(jī)體抵抗力［46］。此外，Donovan等［47］從S. aureus基因組中分離并純化出S. aureus（NCTC 8325）噬菌體phi11溶菌酶，可降解宿主細(xì)胞壁的肽聚糖，溶解細(xì)菌，使感染噬菌體逃逸，而且該純化的溶菌酶可以溶解從乳腺炎感染中分離的6種代表性菌株（包括S. aureus），使其成為了候選蛋白抗菌劑。

乳酸菌通過(guò)與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)組織定植、調(diào)節(jié)毒力表達(dá)或刺激先天免疫系統(tǒng)，有助于維持自然微生物群的平衡，是治療炎癥的一種良好選擇［42］。Assis等［48］研究表明，L. lactis V7可抑制E. coli和S. aureus在bMECs的粘附能力和內(nèi)化作用，也可使bMECs中趨化因子8（C-X-C motif chemokine ligand 8，CXCL8）的表達(dá)量輕微增加，從而增加bMECs炎癥反應(yīng)。上述結(jié)果表明，L. lactis V7有望成為一種潛在的預(yù)防牛乳腺炎的益生菌。

綜上所述，生物制劑在奶牛乳腺炎的治療中變得越來(lái)越重要，已成為國(guó)內(nèi)外科研工作者研究的熱點(diǎn)。當(dāng)前，國(guó)外科研工作者已取得璀然可觀成績(jī)，相反，國(guó)內(nèi)則是剛剛起步，故加強(qiáng)生物制劑在奶牛乳腺炎甚至是其他炎癥方面的開(kāi)發(fā)與利用是至關(guān)重要的，可為奶?！敖】叼B(yǎng)殖”的發(fā)展方向提供動(dòng)力。

3 展望

奶牛乳腺炎病因復(fù)雜，提倡預(yù)防為主和治療為輔的防治原則?？茖W(xué)家們已挖掘出一些能抑制奶牛乳腺炎的生物活性物質(zhì)、礦物元素、維生素和生物制劑，并初步探索它們的分子作用機(jī)制。但是，上述大多數(shù)研究?jī)H停留在細(xì)胞水平上，而對(duì)奶牛個(gè)體水平的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)尚未開(kāi)展。此外，受活性物質(zhì)獲取難、成本高和奶牛乳腺炎致病機(jī)制復(fù)雜等因素的影響，目前基于生物活性物質(zhì)類藥物的精準(zhǔn)治療技術(shù)研發(fā)相對(duì)滯后，未真正在現(xiàn)代化牧場(chǎng)中應(yīng)用。近年來(lái)，許多學(xué)者積極開(kāi)展奶牛乳腺炎的分子調(diào)控機(jī)制研究，試圖挖掘調(diào)節(jié)炎癥的重要分子或信號(hào)通路，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)成本低、殘留少和效價(jià)高的乳腺炎治療新產(chǎn)品，以期提高乳腺炎的治愈率，從而提高牧場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。