范宇宸 陸瑤 劉香男 趙博

（上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240）

泛素化是由包括泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3在內(nèi)的一系列酶催化下發(fā)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要過程［1］。其中，E3識(shí)別并介導(dǎo)底物的泛素化，是參與泛素化的關(guān)鍵酶之一。E3根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同主要分為RING家族、HECT家族、U-box家族和CRL家族［2］。作為U-box家族泛素連接酶的主要活性區(qū)域，U-box結(jié)構(gòu)域的功能主要是與泛素結(jié)合酶E2相互作用，并將泛素Ub傳遞至底物蛋白上［3］。因此，U-box結(jié)構(gòu)域?qū)τ谠摷易錏3的活性至關(guān)重要。CHIP（carboxyl terminus of Hsc70/Hsp70-interacting protein）和E4B（ubiquitination factor E4B）是U-box家族泛素連接酶的2個(gè)重要成員，它們共同參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)量控制［4］。不同的是，CHIP是分子伴侶依賴型的泛素連接酶，通過N末端的TPR結(jié)構(gòu)域與分子伴侶Hsc70/Hsp70相互作用介導(dǎo)底物的泛素化［5］；而E4B不僅具有E3的活性，還能夠充當(dāng)E4，發(fā)揮延伸泛素鏈的功能［6］，因此它們一直是U-box家族泛素連接酶研究的熱點(diǎn)。

U-box結(jié)構(gòu)域的活性與其氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)的完整性密切相關(guān)。研究表明，發(fā)生在CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域的突變E301Q，使CHIP泛素化其底物的活性下降［7］。而通過改造E4B的U-box結(jié)構(gòu)域的部分氨基酸序列，增強(qiáng)其與E2的親和力，能夠增強(qiáng)E4B的活性［8］。亦有報(bào)道表明，CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域完整序列保留的情況下，它的N末端融合一個(gè)異源性蛋白能夠特異性靶向底物蛋白，同時(shí)U-box結(jié)構(gòu)域依舊能傳遞泛素，這種融合蛋白稱為嵌合泛素連接酶［9］。由此可見，U-box結(jié)構(gòu)域的序列及空間結(jié)構(gòu)若得以完整保留，其活性有可能得到部分保留。CHIP和E4B的U-box結(jié)構(gòu)域氨基酸序列并不相似，先前的研究篩選得到的它們的潛在底物中，卻有多種共同底物［10］。為了進(jìn)一步研究U-box結(jié)構(gòu)域?qū)HIP和E4B活性的影響，我們通過互換CHIP和E4B的U-box結(jié)構(gòu)域，驗(yàn)證構(gòu)建得到的突變體對(duì)CHIP和E4B各自底物和二者共同底物的泛素化活性。因此，基于前期研究成果，我們選取了篩選得到的CHIP的潛在底物RCC2、E4B的潛在底物NIPSNAP1、二者潛在共同底物CDC37和文獻(xiàn)報(bào)道的CHIP和E4B的共同底物p53［11］為實(shí)驗(yàn)底物進(jìn)行驗(yàn)證，旨在為進(jìn)一步研究CHIP和E4B的E3活性及其U-box結(jié)構(gòu)域的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK-293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、opti-MEM減血清培養(yǎng)基購自Gibco公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞菌種由本實(shí)驗(yàn)室保存并制備；pLVX-IRES-mCherry、pLVX-3′flag-IRES-mCherry、pcDNA-NIPSNAP1、pcDNACDC37、pLVX-E4B、pLVX-CHIP等質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；高保真KOD酶購自東洋紡上海有限公司；限制酶、T4 DNA連接酶購自Thermo Fisher公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技公司；引物合成及質(zhì)粒測(cè)序由生工生物公司完成；anti-flag抗體、anti-CHIP抗體、anti-E4B抗體和anti-GAPDH抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 HEK-293T細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的HEK-293T細(xì)胞株，迅速置入37℃水浴中，并輕輕搖晃凍存管使其在1 min內(nèi)融化。加入適量完全培養(yǎng)基800 r/min離心2 min，再使用4 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞狀態(tài)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 底物質(zhì)粒pLVX-RCC2-IRES-mCherry、pLVX-p53-IRES-mCherry的構(gòu)建

1.2.2.1 底物基因RCC2和p53的PCR擴(kuò)增 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫調(diào)取的RCC2和p53底物的全長CDS序列設(shè)計(jì)引物，并在RCC2基因上下游分別插入Nde I、Not I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，在p53基因上下游分別插入EcoR I、BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)，并在p53基因3′端引入flag標(biāo)簽序列。引物序列如下：

RCC2-F：TACCTTCATATGCCCAGGAAGAAGGCGGC；RCC2-R：ATCTTAAAGCGGCCGCGAGGGT TCGGGGGTTGTATT；p53-F：GCGGCGGAATTCATGGAGGAGCCGCAGTCA；p53-R：ACAGTAGGATCCTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGTCTGAGTCAGGCCCTTC

根據(jù)KOD酶說明書設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.2.2 載體與底物基因連接 應(yīng)用Nde I、Not I兩種限制酶酶切pLVX-3′flag-IRES-mCherry載體質(zhì)粒和RCC2底物基因，應(yīng)用EcoR I、BamH I兩種限制酶酶切pLVX-IRES-mCherry載體質(zhì)粒和p53底物基因。載體經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，底物基因經(jīng)柱回收，根據(jù)底物基因與載體摩爾比7∶1計(jì)算各自用量，使用T4 DNA連接酶室溫連接1.5 h。取5 μL酶連產(chǎn)物加入30 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞，冰敷30 min，42℃熱激90 s，再冰敷2 min。用1 mL LB液體培養(yǎng)基37℃，220 r/min復(fù)蘇1 h，后將菌液涂布于氨芐抗性的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日各挑取4個(gè)單克隆小搖，提質(zhì)粒后測(cè)序鑒定質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

1.2.3 Overlap PCR構(gòu)建CHIP及E4B互換U-box結(jié)構(gòu)域的突變體

1.2.3.1 目的片段的擴(kuò)增 根據(jù)overlap PCR的技術(shù)要求設(shè)計(jì)引物，分別將CHIP A片段（CHIP基因1-675 bp）和CHIP B片段（CHIP的U-box基因676-909 bp）、E4B A片段（E4B基因1-3 678 bp）、E4B B片段（E4B的U-box基因3 679-3 906 bp）的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列為：

CHIP A-F：TTACTGGAATTCATGAAGGGCAAGGAGGAG；CHIP A-R：TCGCTTCTTCCTCTTGACGCTCCTG；CHIP B-F：TCGCTTCTTCGACGCTCCTGATGAG；CHIP B-R：ATTATTGGATCCTTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTGATCGCTG；E4B A-F：TCTAGTGAATTCATGGAGGAGCTGAGC；E4B A-R：GCTGTAGTCGATTTCGACATCCCCG；E4B B-F：GCTGTAGTCGGACATCCCCGACTAC；E4BB-R：ATTATTGGATCCTCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGTAGTCCTCCA

根據(jù)KOD酶說明書設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.3.2 全長突變體基因的融合 將1.2.3.1中4條片段的PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，根據(jù)A、B片段摩爾比1∶1計(jì)算overlap PCR的各自模板用量，進(jìn)行PCR反應(yīng)。前8個(gè)循環(huán)體系中不加引物，A、B片段互為模板融合成全長的突變體序列，第9個(gè)循環(huán)起體系中加入A片段上游引物及B片段下游引物擴(kuò)增全長序列。

1.2.3.3 全長突變體基因與載體的連接 應(yīng)用EcoR I、BamH I兩種限制酶酶切pLVX-IRES-mCherry載體質(zhì)粒和全長突變體目的基因。后續(xù)回收、連接及鑒定方法如1.2.2.2所述。

1.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞 取生長狀態(tài)良好的HEK-293T細(xì)胞，胰酶消化后用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以2.2×106個(gè)的數(shù)量接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過夜。移除培養(yǎng)基，無菌PBS洗滌細(xì)胞兩遍，加入適量opti-MEM減血清培養(yǎng)基。取無菌EP管兩支，一支加入質(zhì)粒，另一支加入質(zhì)粒質(zhì)量3倍體積的PEI，分別用250 μL opti-MEM將質(zhì)粒和PEI制備為均勻的溶液，室溫靜置5 min，后將PEI加入質(zhì)粒中，輕輕混勻，室溫靜置20 min，隨后將PEI-質(zhì)粒混合物加入預(yù)先更換培養(yǎng)基的細(xì)胞中，過夜培養(yǎng)12 h后更換為含血清的DMEM培養(yǎng)基。

1.2.5 底物、CHIP和E4B及其突變體在細(xì)胞中的表達(dá)檢測(cè) 1.2.4中細(xì)胞轉(zhuǎn)染44 h后，將培養(yǎng)基替換為含10 μmol/L MG132的培養(yǎng)基，37℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)基，4℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2遍，每皿加入400 μL 含蛋白酶抑制劑和去泛素化酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解5 min。使用細(xì)胞刮刀刮取裂解后的細(xì)胞至EP管中，置于搖床冰上繼續(xù)裂解30 min，隨后4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清即為總蛋白。BCA法對(duì)總蛋白濃度定量，根據(jù)濃度將樣品總蛋白濃度調(diào)整到一致水平，取適量裂解液煮樣，10%分離膠SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉。由于4個(gè)底物上都帶有flag標(biāo)簽，因此使用anti-flag抗體（1∶1 000）檢測(cè)底物表達(dá)量。由于anti-CHIP和anti-E4B兩種抗體所識(shí)別的抗原分別為CHIP和E4B的前100個(gè)氨基酸殘基所組成的肽鏈，而兩種突變體前100個(gè)氨基酸殘基與各自的野生型E3相同，因此使用anti-CHIP抗體（1∶10 000）和anti-E4B抗體（1∶5 000）檢測(cè)CHIP、E4B及其突變體的表達(dá)量。anti-GAPDH抗體（1∶10 000）檢測(cè)內(nèi)參蛋白表達(dá)量。

1.2.6 免疫共沉淀驗(yàn)證CHIP和E4B及其突變體對(duì)底物的泛素化情況 取1.2.5中所獲得的細(xì)胞裂解液，向1 mg總蛋白中加入6 μL anti-flag抗體偶聯(lián)的proteinG beads，搖床上4℃結(jié)合6 h，隨后4℃ 9 000 r/min離心1 min，棄上清，PBS-T洗beads 6-8次。40 μL PBS 重懸 beads，加入 10 μL 還原性 5× 蛋白上樣緩沖液，99℃煮樣10 min，取上清上樣，6%分離膠SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，anti-Ub抗體（1∶5 000）檢測(cè)底物上結(jié)合的Ub水平，反映泛素化情況。

2 結(jié)果

2.1 pLVX-RCC2-IRES-mCherry、pLVX-p53-IRES-mCherry質(zhì)粒的構(gòu)建

以HEK-293T細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增得到的條帶分子量符合理論值，RCC2目的基因全長1 569 bp，位于1.5 kb marker附近；p53 目的基因全長1 182 bp，位于1 kb marker附近（圖1-A、B）。目的基因與載體經(jīng)酶切酶連后轉(zhuǎn)化涂板，分別挑取了4個(gè)陽性克隆小搖提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳顯示質(zhì)粒質(zhì)量良好，與空載體質(zhì)粒相比，電泳速率較慢（圖1-C），提示目的基因可能成功連接，經(jīng)測(cè)序后序列正確，2個(gè)底物質(zhì)粒均構(gòu)建成功。

圖1 RCC2、p53底物質(zhì)粒克隆及構(gòu)建Fig.1 Plasmid cloning and construction of substrate RCC2 and p53

2.2 互換U-box的突變體pLVX-C+E-IRES-mCherry、pLVX-E+C-IRES-mCherry質(zhì)粒的構(gòu)建

以實(shí)驗(yàn)室保存的pLVX-CHIP-IRES-mCherry、pLVX-E4B-IRES-mCherry質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增分別得到CHIP的A片段CA和B片段CB，E4B的A片段EA和B片段EB。瓊脂糖凝膠電泳顯示，CA位于750 bp marker附近、CB位于250 bp marker附近，EA位于2 000 bp marker以上，EB位于250 bp marker附近，均符合其理論大小（圖2-A）。

隨后分別以CA和EB、EA和CB為模板，經(jīng)overlap PCR融合、擴(kuò)增，得到CHIP A片段與E4B B片段的融合基因，命名為C+E（CHIP基因1 bp-675 bp序列的3′端融合E4B基因第3 679-3 906 bp的U-box序列）；得到E4B A片段與CHIP B片段的融合基因，命名為E+C（E4B基因1-3 678 bp序列的3′端融合CHIP基因第676-909 bp的U-box序列）。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，C+E條帶位于1 kb marker附近（圖 2-B），E+C條帶位于 4 kb marker附近（圖 2-C），均符合其理論大小。后經(jīng)酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、測(cè)序確 認(rèn) pLVX-C+E-IRES-mCherry、pLVX-E+C-IRES-mCherry兩種質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 融合基因C+E及E+C的PCR結(jié)果Fig.2 PCR results of fusion genes C+E and E+C

2.3 底物、CHIP和E4B及其突變體在HEK-293T細(xì)胞中的表達(dá)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，分別轉(zhuǎn)染底物pLVX-RCC2表達(dá)質(zhì)粒（圖3-A）、pcDNA-NIPSNAP1表達(dá)質(zhì)粒（圖3-B）、pLVX-p53表達(dá)質(zhì)粒（圖3-C）和pcDNA-CDC37表達(dá)質(zhì)粒（圖3-D）。收集細(xì)胞樣品，經(jīng)Western blot，pLVX-RCC2表達(dá)質(zhì)粒、pcDNA-NIPSNAP1表達(dá)質(zhì)粒、pLVX-p53表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA-CDC37表達(dá)質(zhì)粒在HEK-293T細(xì)胞中均能正常表達(dá)，具有較高的表達(dá)量。分別與4種底物共轉(zhuǎn)染的pLVX-CHIP表達(dá)質(zhì)粒、pLVX-C+E表達(dá)質(zhì)粒、pLVX-E4B表達(dá)質(zhì)粒和pLVX-E+C表達(dá)質(zhì)粒均能夠正常表達(dá)，且與HEK-293T組相比有過表達(dá)趨勢(shì)。

圖3 底物、CHIP和E4B及其突變體的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)結(jié)果Fig.3 Intracellular expression results of substrates，CHIP，E4B and their mutants

2.4 CHIP和E4B及其突變體對(duì)底物泛素化的影響

底物RCC2的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與HEK-293T組相比，過表達(dá)CHIP能夠增強(qiáng)RCC2的泛素化，其Ub拖尾條帶更深（圖4-A）。同時(shí)，過表達(dá)E4B不能增強(qiáng)RCC2的泛素化。過表達(dá)C+E能夠一定程度上增強(qiáng)RCC2的泛素化，但其程度不及野生型CHIP。過表達(dá)E4B或E+C則無增強(qiáng)泛素化的作用（圖4-A）。與RCC2類似，底物NIPSNAP1的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與HEK-293T組相比，過表達(dá)E4B能夠增強(qiáng)NIPSNAP1的泛素化，過表達(dá)E+C亦能增強(qiáng)其泛素化，但其程度不及野生型E4B。過表達(dá)CHIP或C+E則無增強(qiáng)泛素化的作用（圖4-B）。這2個(gè)底物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了，RCC2是CHIP的底物，NIPSNAP1是E4B的底物。同時(shí)，CHIP和E4B互換U-box結(jié)構(gòu)域后對(duì)各自底物依舊保留了一定程度的泛素化活性。

對(duì)于底物p53和CDC37，與HEK-293T組相比，過表達(dá)CHIP或E4B均能夠增強(qiáng)p53和CDC37的泛素化。同時(shí)，過表達(dá)C+E能夠一定程度上增強(qiáng)p53和CDC37的泛素化，但其程度不及野生型的CHIP。而過表達(dá)E+C幾乎不能增強(qiáng)p53和CDC37的泛素化（圖4-C、D）。這2個(gè)底物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了文獻(xiàn)報(bào)道的p53是CHIP和E4B的共同底物，同時(shí)證明了CDC37是CHIP和E4B的共同底物。與上述類似，CHIP換上E4B的U-box結(jié)構(gòu)域后對(duì)CHIP和E4B的共同底物保留了部分的泛素化活性，但不同的是，E4B換上CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域后則幾乎失去了泛素化共同底物的活性。

圖4 底物RCC2、NIPSNAP1、p53、CDC37的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Co-immunoprecipitation experiment results of substrate RCC2，NIPSNAP1，p53 and CDC37

3 討論

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)通過泛素化降解胞內(nèi)蛋白起到調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要作用。該系統(tǒng)調(diào)節(jié)包括細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝等在內(nèi)的一系列重要細(xì)胞生命活動(dòng)［12］。泛素連接酶作為泛素化過程的重要參與者，在調(diào)節(jié)其特異性底物的降解及其他信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有關(guān)鍵的作用。其中，U-box家族泛素連接酶CHIP和E4B及其底物在疾病發(fā)生過程中的作用越來越受到關(guān)注。例如，CHIP 在肺癌［13］、三陰性乳腺癌［14］等中呈現(xiàn)為抑癌蛋白，CHIP的過表達(dá)伴隨其促癌底物的降解抑制了腫瘤細(xì)胞的生長。在脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)患者中，CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域存在突變，導(dǎo)致了其E3活性改變，從而加速了疾病進(jìn)展［15］。也有的研究將CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域嵌合至Grb2蛋白C末端，靶向酪氨酸激酶BCR-ABL的泛素化，成為了慢性粒細(xì)胞白血病治療的潛在新手段［16］。而E4B則在肝癌［17］等癌癥中表現(xiàn)為促癌蛋白。在乳腺癌中，E4B促癌的可能機(jī)制是由于它對(duì)p53的泛素化降解［18］。因此，對(duì)CHIP和E4B的U-box結(jié)構(gòu)域的功能進(jìn)行深入研究有助于進(jìn)一步闡明部分疾病的發(fā)病機(jī)理，從而開發(fā)新的治療方法。

基于以上理論基礎(chǔ)，本研究通過將CHIP和E4B的U-box結(jié)構(gòu)域互換，分別對(duì)突變體泛素化CHIP和E4B各自底物和共同底物的活性進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)CHIP突變體C+E、E4B突變體E+C都保留了一定的活性，同時(shí)，E+C對(duì)二者共同底物的泛素化活性基本喪失了。有報(bào)道表明，E4B可以作為E4發(fā)揮鏈延長的功能，而不直接作為E3將底物泛素化，但具體發(fā)揮E4功能的區(qū)域尚不明確［19］。因此，可能在互換U-box結(jié)構(gòu)域時(shí)對(duì)全長E4B蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，喪失了E4的活性，因而表現(xiàn)為部分底物泛素化活性的減弱。未來，一方面，結(jié)合涉及CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域的嵌合泛素連接酶技術(shù)，深入研究突變體C+E泛素化CHIP底物的活性；另一方面，利用免疫共沉淀技術(shù)，研究突變體C+E和E+C與底物的相互作用，進(jìn)一步闡明U-box結(jié)構(gòu)域?qū)HIP和E4B活性的作用。

4 結(jié)論

本研究基于泛素連接酶CHIP及E4B的底物，為研究U-box結(jié)構(gòu)域?qū)HIP和E4B活性的影響，成功構(gòu)建了2個(gè)互換U-box結(jié)構(gòu)域的CHIP及E4B突變體C+E和E+C。經(jīng)HEK-293T細(xì)胞內(nèi)泛素化反應(yīng)檢測(cè)底物泛素化情況，最終確定CHIP突變體C+E能夠部分保留泛素化CHIP底物的活性，E4B突變體E+C只在泛素化E4B底物時(shí)保留了部分泛素化活性，而在泛素化共同底物時(shí)活性喪失。