陳婷 謝梅英 魏立民 歐陽坤 程曉 張永亮

（1. 海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，?？?，571100；2. 生豬種業(yè)中心 廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州，510642；3. 廣東生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，廣州，510520）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是引起豬腹瀉的主要病原之一，對仔豬的致死率高達100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。截止目前，豬流行性腹瀉的治療尚無特效藥，生產(chǎn)中以綜合性預(yù)防手段為主［1］，研究顯示，仔豬可從乳中獲得母源抗體而得到被動免疫保護，黏膜免疫在抵抗腸道病毒PEDV的感染中發(fā)揮重要作用，可誘導(dǎo)產(chǎn)生分泌型IgA（sIgA），有效抵御病毒入侵［2］。

Exosome是一類由內(nèi)吞作用形成的膜上小囊泡，可通過融合多泡體（multivesicularbodies，MVB）而釋放到細胞外環(huán)境［3］，在透射電鏡下呈圓形或杯狀磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，直徑為40-100 nm［4-5］。研究顯示，exosome可攜帶細胞特異性生物分子，如miRNA、mRNA、DNA和蛋白質(zhì)，并分泌出細胞［6］，人和牛乳汁exosome中的mRNA、miRNA可以轉(zhuǎn)運進入免疫細胞，并潛在地調(diào)控免疫細胞功能［7-8］。同時，包裹在外泌體中的乳汁miRNA可以穩(wěn)定的抵抗人類消化系統(tǒng)的惡劣環(huán)境，并滲透進腸上皮Caco-2細胞單層屏障到達血液循環(huán)，最終作用于細胞功能［9］。人乳exosome可以抵抗消化進而被腸細胞吸收，最終在細胞核的位置發(fā)揮作用影響基因表達［10］。本課題組在2016年報道了豬乳exosome可能通過其包裹的miRNAs、mRNAs及蛋白質(zhì)等組分，調(diào)控相應(yīng)的基因和蛋白表達，最終促進腸道上皮細胞增殖［11］。同樣，Alison等［12］也報道了大鼠乳exosome可以增強IEC-18細胞的活力，促進增殖，刺激腸干細胞活性。然而，至今仍未見乳exosome在腸道細胞上調(diào)控PEDV病毒的報道。因此，本研究擬從細胞水平上探索豬乳exosome對PEDV的抑制作用，并進一步對其作用方式和作用途徑進行解析，以確定豬乳exosome對仔豬的腸道保護功能，為進一步揭示乳生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

仔豬小腸上皮細胞 IPEC-J2完全培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基+10%胎牛血清+5 ng/mL EGF +5 μg/mL 胰島素+1%雙抗（由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)陳代文老師實驗室饋贈）。

1.2 方法

1.2.1 PEDV的繁殖 Vero E6細胞（非洲綠猴腎上皮細胞系，本實驗室已保存）：DMEM+100單位/mL青/鏈霉素+10%胎牛血清FBS。PEDV CV777由本校生豬種業(yè)工程中心實驗室提供。

將保存的PEDV（strain CV777）毒株用含2.5 μg/mL胰酶的無血清DMEM稀釋1 000倍后，接種至長成單層培養(yǎng)的非洲綠猴腎細胞系（Vero E6），37℃吸附2 h后，加入含2%血清的DMEM在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后收毒。將含有病毒液的細胞瓶置于-20℃冰箱，待病毒液結(jié)冰后，放置室溫，等完全融化后，再置-20℃冰箱，反復(fù)凍融3次。收獲的病毒懸液1 000 r/min離心10 min去除細胞碎片，收集病毒液上清，分裝后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 豬乳exosome提取 收集10頭未免疫豬流行性腹瀉病毒疫苗的健康長白母豬分娩后0-5 d內(nèi)乳汁200 mL，2 000×g，4℃，30 min離心收集上清，除去乳脂蛋白和乳腺細胞碎片后；將收集到的乳清按12 000×g，4℃，離心30 min，收集上清，去除乳脂蛋白、酪蛋白和其他細胞碎片；將收集到的乳清按110 000×g，4℃，進行超高速離心2 h，去除上清部分，獲得豬乳外泌體并存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 結(jié)晶紫檢測

（1）IPEC-J2細胞分別按照2.5×104/cm2密度接種于24孔板，每組10個重復(fù)；按下述3種處理方式處理完后，吸去并棄掉培養(yǎng)基，PBS涮洗2次；每孔加入500 μL 10%甲醇，靜置 2 min，棄掉甲醇溶液，并晾干；每孔加入200 μL結(jié)晶紫染液，靜置10 min；輕輕甩去染液，PBS洗滌2次后，倒置于吸水紙上吸干水分，置于顯微鏡下觀察拍照；拍照結(jié)束后，每孔加400 μL 33%的醋酸脫色，充分溶解后，每孔取200 μL在570 nm處測定光吸收度。

（2）將細胞分為PEDV組（對照組）和PEDV +exosome組（實驗組），豬乳exosome按照預(yù)防、殺毒及感染后修復(fù)3種目的處理細胞，具體設(shè)計要求如下。

Group1（預(yù)防作用）：實驗組先添加含2.5 mg總蛋白的豬乳exosome（以蛋白質(zhì)含量為計量單位，下同）處理細胞24 h，再用0.1 MOI PEDV 感染IPEC-J2細胞2 h；對照組先添加與豬乳exosome等體積的DMEM/F12培養(yǎng)基處理細胞24 h，再用0.1 MOI PEDV 感染細胞2 h，處理完72 h 后檢測（感染前添加）。

Group2（殺毒作用）：實驗組先進行等體積包含2.5 mg總蛋白的豬乳exosome與0.1 MOI PEDV 感染IPEC-J2細胞，混合后室溫靜置10 min，感染細胞2 h；對照組進行等體積的DMEM/F12培養(yǎng)基與0.1 MOI PEDV感染IPEC-J2細胞，混合后室溫靜置10 min后感染細胞2 h，處理完72 h 后檢測（同時添加）。

Group3（修復(fù)作用）：實驗組先用0.1 MOI PEDV 感染IPEC-J2細胞2 h，再添加包含2.5 mg總蛋白的豬乳外泌體處理72 h 后檢測；對照組先用0.1 MOI PEDV 感染IPEC-J2細胞2 h，再加入與豬乳exosome等體積的DMEM/F12培養(yǎng)基處理72 h 后檢測（感染后添加）。

1.2.4 MTT檢測 仔豬小腸上皮細胞IPEC-J2按照2.5×104/cm2密度接種于96孔板，每組12個重復(fù)；待細胞完全貼壁后生長至融合度50%-60%時，添加處理物進行處理；待細胞長至預(yù)設(shè)時間點時每孔加MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)并吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解，570 nm波長測定各孔光吸收值。

1.2.5 絕對定量PCR檢測PEDV基因在細胞中的復(fù)制情況 通過Primer 5軟件設(shè)計病毒及其他基因定量引物，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

檢測方法如下：（1）分別在上述引物的5′端加入Nhe I、Xba I酶切位點和保護堿基序列，并用上述引物擴增PEDV中對應(yīng)基因片段；（2）將所得上述基因片段同源重組至pUC19載體，通過DH5α大腸桿菌擴增質(zhì)粒，試劑盒提取質(zhì)粒，并測定質(zhì)粒濃度，按照“每μL中質(zhì)?？截悢?shù)=（質(zhì)量/分子量）×（6.0×1023）=［質(zhì)粒濃度（μg/μL）× 1 μL］× 10-6÷［（pUC19載體堿基數(shù)+插入片段堿基數(shù)）×660］×（6.0×1023拷貝數(shù) /mol）”計算質(zhì)?？截悢?shù)（注：每個堿基的平均分子量為330，載體為DNA雙鏈結(jié)構(gòu)）；（3）按照梯度稀釋標準品質(zhì)粒pUC19，通過定量PCR計算基因拷貝數(shù)和CT值之間的標準曲線；（4）提取樣本中病毒RNA，通過絕對定量PCR檢測相關(guān)基因在不同處理間拷貝數(shù)的差異。

1.2.6 蛋白質(zhì)檢測（Western blot）方法 首先提取細胞或上清樣本中蛋白質(zhì)，并采用BCA Protein Assay Kit試劑盒測定蛋白濃度（ThermoFisher，美國）。按20-30 μg蛋白質(zhì)濃度進行Western blot檢測。具體步驟如下：（1）樣品95℃變性10 min后上樣至12% SDS-PAGE膠內(nèi)，濃縮膠電流90 mA，20 min后轉(zhuǎn)電流110 mA，90 min直至分離膠底部；（2）180 mA，70-150 min恒流中將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上（時間視轉(zhuǎn)印蛋白分子大小而定）；（3）TBST 洗滌膜5次，每次5 min 之后，采用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1.5-2 h；（4）將封閉后的PVDF膜置于目的一抗反應(yīng)液中4℃孵育10-16 h；（5）TBST洗滌膜5次，每次3-5 min后進行室溫二抗液中孵育1-2 h；（6）用TBST 洗滌膜5次，每次3-5 min；最后置于發(fā)光液中浸泡5 s，并采用Alpha多色熒光和化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中呈像。所用PEDV N蛋白及CLND 1 蛋白一抗均購自CST（ThermFisher，美國）。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0進行分析，Duncan法進行多重比較，兩兩比較采用t-test檢驗方法。

2 結(jié)果

2.1 豬乳exosome抑制PEDV對IPEC-J2細胞活力的影響

2.1.1 細胞表型顯微鏡觀察 顯微鏡觀察結(jié)晶紫染色后細胞狀態(tài)顯示，在3種不同處理方式下，對照組細胞呈現(xiàn)空泡狀，數(shù)量明顯減少，且活細胞數(shù)量較少（藍色部分，圖1左）；而處理組添加豬乳exosome處理后，各組細胞布滿視野，細胞數(shù)量和存活率明顯高于對照組（藍色部分，圖1右）；提示豬乳exosome能夠抑制PEDV病毒對細胞的感染能力，且不受作用方式的影響（即乳外泌體添加順序）。

圖1 結(jié)晶紫染色細胞形態(tài)學(xué)觀察Fig. 1 Crystal violet staining and cell morphology observation

2.1.2 結(jié)晶紫染色統(tǒng)計 為確定豬乳exosome抑制PEDV對細胞的感染效果，在細胞表型觀察結(jié)果基礎(chǔ)上進一步進行細胞存活數(shù)定量分析，結(jié)果顯示，在IPEC-J2細胞中，豬乳exosome與PEDV處理的3種方式均顯著抑制PEDV對細胞的感染，增加細胞存活力（P＜0.05）（圖 2）。

圖2 細胞存活力統(tǒng)計Fig. 2 Cell survival activity statistics

2.1.3 MTT檢測結(jié)果 經(jīng)MTT法檢測PEDV對細胞活力的影響，結(jié)果（圖3）表明在IPEC-J2細胞中，豬乳exosome與PEDV作用的3種處理方式均顯著抑制PEDV對細胞活力的影響（P＜0.05），提示豬乳外泌體可增強IPEC-J2細胞活力，抑制PEDV對細胞的感染。

圖3 MTT檢測細胞活力Fig. 3 Cell activity detected by MTT

2.2 豬乳exosome抑制PEDV在IPEC-J2細胞中的復(fù)制

為探索豬乳exosome抑制PEDV對IPEC-J2細胞感染的機理，采用絕對定量分析3種處理方式下，IPEC-J2細胞中PEDV相關(guān)基因的表達水平。結(jié)果顯示，在3種處理方式下豬乳exosome均極顯著下調(diào)PEDV 病毒 M（圖 4-A）、N（圖 4-B）、ORF3（圖 4-C）、Spike（圖 4-D）、RNA polymerase（圖 4-E）和 E（圖4-F）蛋白等基因在IPEC-J2細胞中的表達量（P＜0.01），提示豬乳exosome可能通過抑制PEDV病毒相關(guān)基因在IPEC-J2細胞內(nèi)表達，從而降低PEDV在細胞內(nèi)的復(fù)制。

圖4 豬乳exosome對PEDV相關(guān)基因在IPEC-J2細胞內(nèi)表達的影響Fig. 4 Expressions of PEDV-related genes treated with porcine milk-derived exosome in IPEC-J2 cells

2.3 豬乳exosome抑制PEDV在細胞上清中的復(fù)制

同樣，對各處理組細胞上清中的PEDV病毒相關(guān)基因絕對定量結(jié)果顯示，3種處理方式下，細胞上清中PEDV病毒的M（圖5-A）、N（圖5-B）、ORF3（圖 5-C）、Spike（圖 5-D）、RNA polymerase（圖5-E）和E蛋白基因（圖5-F）的表達量也極顯著下調(diào)（P＜0.01），提示豬乳exosome還可在細胞外抑制PEDV病毒相關(guān)基因表達，減少病毒對IPEC-J2細胞的感染。

圖5 豬乳exosome對PEDV相關(guān)基因在IPEC-J2細胞上清中表達的影響Fig. 5 Expressions of PEDV-related genes treated with porcine milk-derived exosome in IPEC-J2 cells supernatant

2.4 豬乳exosome抑制IPEC-J2細胞凋亡基因及PEDV N蛋白表達

蛋白表達水平檢測PEDV感染的標志性N蛋白及細胞凋亡相關(guān)的CLDN1蛋白，結(jié)果顯示，在3種不同處理方式下，豬乳exosome均明顯抑制PEDV N蛋白及IPEC-J2細胞內(nèi)CLDN1蛋白的表達（圖6），推測豬乳exosome可能通過抑制PEDV病毒中N蛋白的表達降低病毒粒子對細胞的感染性，同時降低細胞CLDN1基因表達對細胞凋亡的影響，從而提高細胞活力來抵抗PEDV病毒的入侵。

圖6 PEDV病毒及細胞凋亡相關(guān)蛋白表達Fig. 6 Expressions of apoptosis-related and PEDV-related proteins

2.5 豬乳exosome對IPEC-J2細胞免疫相關(guān)基因表達

對IPEC-J2細胞感染PEDV后免疫相關(guān)基因的表達結(jié)果（圖7）顯示，3種處理方式下，豬乳exosome極顯著抑制細胞內(nèi)pAPN基因表達（P＜0.01），而對NF-κB基因的表達無顯著影響（P＞0.05）。此外，處理方式1（預(yù)防作用）極顯著提高IFN-α基因表達（P＜0.01），同時極顯著抑制IRF3基因表達（P＜0.01）；而在處理方式2（殺毒作用）和處理方式3（修復(fù)作用）作用下，豬乳exosome分別對IFN-α及IRF3基因表達影響不明顯（P＞0.05），提示不同作用方式下，豬乳exosome抑制PEDV病毒可能激活的細胞信號通路不同。

圖7 豬乳exosome對IPEC-J2細胞免疫相關(guān)基因表達的影響Fig. 7 Expressions of immune-related genes treated with porcine milk-derived exosome in IPEC-J2 cells

3 討論

本文通過3種不同的處理方式探討了豬乳exosome對PEDV病毒感染仔豬腸道上皮IPEC-J2細胞的作用效果，即預(yù)防、殺滅和修復(fù)3種作用方式。結(jié)果顯示，豬乳exosome無論以何種方式添加，對小豬腸道上皮細胞感染PEDV后均有提高細胞存活數(shù)量和活力的作用；進一步分析其可能的機理顯示，豬乳exosome可直接降低細胞內(nèi)和細胞上清中PEDV病 毒 M、N、ORF3、Spike、RNA polymerase和 E蛋白相關(guān)基因的表達；同時對細胞內(nèi)增殖凋亡相關(guān)的CLDN1蛋白及病毒感染相關(guān)的N蛋白具有明顯的抑制作用；而對細胞內(nèi)免疫相關(guān)IFN-α、NF-κB、IRF3、pAPN基因的表達除處理方式2（殺滅）與3（修復(fù)）對IFN-a和IRF3基因的調(diào)節(jié)作用與其他基因不一致外，其他各處理方式對IFN-α、NF-κB、IRF3、pAPN基因的表達調(diào)節(jié)效果均統(tǒng)一，推測不同作用方式下，豬乳exosome在細胞內(nèi)抑制PEDV可能激活的信號分子和通路存在差異。

PEDV屬于冠狀病毒，有囊膜，包含單股正鏈RNA基因組，病毒的表面由核衣殼蛋白（N），纖突糖蛋白（S）、膜蛋白（M）、小膜蛋白（E）構(gòu)成［13］，復(fù)制酶多聚蛋白1ab（ORF1ab）和輔助蛋白（ORF3）是 PEDV 主要的非結(jié)構(gòu)蛋白，它們僅在病毒侵染和復(fù)制過程中表達，ORF3是PEDV 中唯一的輔助蛋白，與病毒毒力有關(guān)［14-15］。有研究利用異位表達研究發(fā)現(xiàn)，E、N 和M 表現(xiàn)出抑制干擾素β（IFN-β）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）活性的能力。此外還參與宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和NF-κB 的激活反應(yīng)［16］。從本研究結(jié)果7中顯示，感染PEDV病毒的各組NF-κB表達量無明顯差異，而處理方式1（預(yù)防）和2（殺滅）極顯著抑制IRF3的活性，說明豬乳exosome在腸道細胞中預(yù)防和殺滅PEDV的過程可能不是通過激活NF-κB及其通路來發(fā)揮作用。干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF-3）和 NF-κB 是誘導(dǎo) IFN-β 發(fā)生轉(zhuǎn)錄的兩個關(guān)鍵因子，PEDV 感染能激活 NF-κB，但不能激活I(lǐng)RF-3。PEDV 感染能明顯抑制 dsRNA 誘導(dǎo)的 IRF-3核轉(zhuǎn)位及 IFN-β的產(chǎn)生［17］。有研究在豬小腸上皮細胞（IECs）上探究PEDV 感染抑制 IRF-3 激活的分子機制顯示，IRF-3的上游TANK 結(jié)合激酶1（TBK1）或抑制性κB 激酶ε（IKKε）介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生并不受 PEDV 感染的影響，而是通過干擾RIG-I 信號通路中的線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）的活性來抑制 IFN-β的產(chǎn)生實現(xiàn)的［17］，本研究中處理方式1和2中經(jīng)豬乳exosome處理后，感染PEDV后細胞中IRF-3的表達量顯著下調(diào)，提示豬乳exosome抑制PEDV感染腸道上皮細胞的調(diào)節(jié)機制可能與上述研究類似。

棘突蛋白S 是存在于病毒粒子表面的I 型糖蛋白，決定病毒的宿主范圍和組織嗜性［18］，病毒入侵細胞時借助于S 蛋白與宿主細胞表面受體結(jié)合并通過膜融合的形式進入胞內(nèi)。有研究表明在PEDV感染的腸細胞中，S 蛋白有削弱宿主I 型干擾素應(yīng)答的潛能［19］，而I 型干擾素被抑制后，能促進病毒感染［20］，本研究中添加豬乳exosome后，細胞上清中S蛋白的表達量明顯降低，提示與宿主表面受體結(jié)合的PEDV病毒數(shù)量可能明顯減少；同時相比對照組細胞內(nèi)的病毒S蛋白基因也極顯著降低，證明豬乳exosome有顯著抑制PEDV病毒進入腸道細胞內(nèi)的作用。病毒侵入時，所有的有核細胞受到刺激會產(chǎn)生 I型干擾素（IFN-I），干擾素的功能多樣，不但能提高一些內(nèi)在蛋白的表達，而且還可以誘導(dǎo)病毒感染細胞凋亡，抵抗病毒感染［21］，研究表明，PEDV可在機體內(nèi)形成持續(xù)性感染來抵抗IFN-I（包括 IFN-α、IFN-β、IFN-κ、IFN-ω 4 種成員）的抗病毒作用［22］。另有研究表明，PEDV感染細胞后可通過降解STAT1影響IFN-α介導(dǎo)的抗病毒作用，從而促進病毒復(fù)制［23］。本研究結(jié)果顯示，處理方式1和3有促進IFN-α表達的效果，推測其可能通過上述類似機制來抵抗病毒入侵，但仍需進一步驗證。對比3種處理方式IFN-α表達量可知，在處理方式1中IFN-α表達量極顯著升高，提示豬乳exosome可能在預(yù)防腸道細胞感染PEDV的過程中效果要優(yōu)于其他兩種方式。

E 蛋白在病毒感染過程中主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在PEDV 出芽過程中扮演重要的角色［24］。該蛋白能夠通過上調(diào)宿主葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose-regulated protein 78，GRP78）的表達誘導(dǎo)感染細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，同時激活NF-κB 活性并上調(diào)炎癥因子IL-8 和抗凋亡分子Bcl-2 的表達［25］。該研究推測E 蛋白通過激活 NF-κB 上調(diào) IL-8 和 Bcl-2 的表達分別促進細胞炎性反應(yīng)和限制細胞凋亡，維持病毒在細胞中增殖。本研究中E蛋白表達量極顯著降低，NF-κB在各處理條件下無影響，而細胞活性升高，證明豬乳exosome能很好的抑制PEDV病毒在細胞內(nèi)外增殖，提高細胞活力，但其可能的抑制機制并不是通過激活NF-κB來實現(xiàn)的。

膜蛋白M定位于整個宿主細胞中，主要參與病毒粒子的組裝和出芽?？烧T導(dǎo)宿主產(chǎn)生IFN-α 和特異性抗體，還能介導(dǎo)細胞融合［26］。報道顯示，M蛋白能夠抑制豬腸道上皮細胞（IEC）周期素A（cyclin A）阻礙腸道上皮細胞生長使其停滯在細胞周期的S期，進而通過干擾細胞周期促進病毒的增殖［26］。在本研究中，經(jīng)豬乳exosome處理后活細胞數(shù)量上升，細胞內(nèi)M蛋白表達量下降，與上述研究結(jié)果類似，說明豬乳外泌體可能通過干預(yù)病毒粒子在細胞內(nèi)的形成過程，從而促進細胞的增殖及活性。而定位于宿主細胞質(zhì)中，且參與病毒基因組轉(zhuǎn)錄和合成、病毒粒子組裝以及宿主應(yīng)激和免疫反應(yīng)的N蛋白［17］在本研究中表達量也顯著下調(diào)，更進步證明，豬乳exosome有抑制PEDV病毒在細胞內(nèi)形成的作用。

ORF3 是PEDV 唯一的輔助蛋白，可與S 蛋白相互作用調(diào)節(jié)病毒復(fù)制［27］，與病毒的毒力強弱和復(fù)制密切相關(guān)。同時與結(jié)構(gòu)蛋白M 和N 相似，也表現(xiàn)出調(diào)控宿主細胞周期的能力。Ye 等［28］利用構(gòu)建穩(wěn)定表達ORF3 蛋白的Vero 細胞證實，ORF3 通過延長細胞周期的S 期和促進囊泡形成的方式以利于病毒增殖，同時相比強毒株的PEDV，穩(wěn)定表達ORF3的Vero 細胞更利于弱毒株的增殖。此外，ORF3 還具有抑制PEDV 誘導(dǎo)的細胞凋亡功能而促進病毒的復(fù)制［29］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)豬乳exosome處理后ORF3表達量下調(diào)，細胞活力明顯增強，進一步證明豬乳exosome有抑制病毒復(fù)制的能力。

多項報道顯示，pAPN為PEDV感染的功能性受體，PEDV利用pAPN作為主要的受體進入細胞［30-32］，本研究結(jié)果顯示，添加豬exosome后pAPN表達量極顯著降低，提示豬乳exosome可能通過作用于腸道細胞的功能性受體，從而阻止病毒進入并感染細胞。

CLDN1是細胞緊密連接蛋白claudin家族的一個成員，也是構(gòu)成緊密連接結(jié)構(gòu)TJs的一個組分。研究表明，CLDN1在體內(nèi)外可以通過激發(fā)自噬促進食管鱗狀細胞癌ESCC細胞的增殖和遷移［33］。同時研究也表明，敲低CLDN1將直接導(dǎo)致肝癌細胞的增殖和遷移能力下調(diào)［34］，而在APCmin小鼠中過表達CLDN1能顯著促進結(jié)腸癌的生長和大小（4倍），并降低小鼠的存活率［35］。CLDN1在胃癌病變中顯著上調(diào)，其表達率的高低與術(shù)后存活率密切相關(guān)［36］。由此可見，CLDN1與細胞癌變和活性密切相關(guān)，本研究顯示在經(jīng)PEDV處理細胞后，細胞形態(tài)脫落嚴重，活力降低，CLDN1蛋白表達上調(diào)，而經(jīng)豬乳exosome處理后，以上結(jié)果均有緩解，表明豬乳exosome能抑制腸道細胞跨膜蛋白CLDN1的表達，從而增強細胞的抗感染能力，進而提高細胞活性。

4 結(jié)論

豬乳exosome能抑制PEDV病毒對腸道上皮IPEC-J2細胞的入侵能力，其可能的機制為：一方面通過直接抑制PEDV病毒感染相關(guān)的基因和蛋白的表達發(fā)揮作用，另一方面可能是通過調(diào)節(jié)腸道細胞本身關(guān)鍵受體基因或免疫相關(guān)基因表達發(fā)揮作用，或通過兩種作用機制協(xié)同從而達到降低PEDV感染力，提高腸道細胞的活力，實現(xiàn)豬乳exosome對腸道細胞的保護作用。