余琴 馬現(xiàn)永 鄧盾 王永飛

（1. 暨南大學(xué)生物工程學(xué)系，廣州 510632；2. 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所 畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣東省動(dòng)物育種與營(yíng)養(yǎng)公共實(shí)驗(yàn)室 廣東畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評(píng)定工程技術(shù)研究中心，廣州 510640）

吲哚又名苯并吡咯，是一種存在于自然界中的氮雜環(huán)芳香族化合物［1］。吲哚及其衍生物是一種重要的化工原料，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、印染等行業(yè)［2］。在醫(yī)藥業(yè)，吲哚衍生物具有抗炎性、抗菌性、以及抗腫瘤性等生物活性，如雙吲哚類藥物具有抗菌抗炎的作用，而吲哚美辛類藥物具有抗腫瘤作用［3-4］；在農(nóng)業(yè)中，吲哚類植物激素被用來刺激植物生物和促進(jìn)植物繁育，如吲哚乙酸、吲哚丁酸等［5］；在印染行業(yè)，吲哚是吲哚菁、靛藍(lán)等染料的合成底物［6］?？梢?，吲哚及其衍生物有多種功能，但在服務(wù)工業(yè)生產(chǎn)和人類生活的同時(shí)，環(huán)境中也產(chǎn)生了大量吲哚廢棄物，其中焦化廢水吲哚含量范圍為2.6-5.4 mg/L［7］，而制藥企業(yè)廢水中吲哚含量可高達(dá) 133.3-150.9 mg /L［8］。

然而相對(duì)工業(yè)中吲哚污染問題，農(nóng)業(yè)廢棄物中吲哚污染問題常常被人忽略。實(shí)際上許多農(nóng)業(yè)廢棄物中含有較多吲哚，特別是養(yǎng)殖廢棄物中吲哚的含量，其濃度通?？蛇_(dá)到0.03-0.13 mg/L［9］。雖然其濃度小于工業(yè)廢棄物，但是由于農(nóng)業(yè)廢棄物規(guī)模十分龐大，其總量仍十分巨大。據(jù)農(nóng)村農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年畜禽糞污產(chǎn)生量高達(dá)38億t，據(jù)此測(cè)算殘留的吲哚量最高可達(dá)4.94×105kg［10］。這些吲哚及其衍生物的存在不僅影響人類健康也嚴(yán)重破壞生態(tài)平衡［11］。高濃度的吲哚及其衍生物可向生物體內(nèi)聚積，對(duì)動(dòng)植物和微生物都有毒害作用［12-13］，其主要的毒性表現(xiàn)在：加速腫瘤的形成和擴(kuò)散并具有遺傳毒性效應(yīng)［14］；可以引起腸道炎癥、貧血、溶血反應(yīng)和血紅蛋白尿性腎病等疾?。?5］；干擾微生物蛋白質(zhì)表達(dá)和引起微生物DNA損傷，抑制微生物的生長(zhǎng)［16］。吲哚屬于含氮芳烴，被認(rèn)為是一類難以根除的有毒環(huán)境污染物。目前對(duì)于此類化合物的去除主要有物理化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法兩類［17］。物理化學(xué)法，包括超聲波法、臭氧氧化等，雖然物理化學(xué)法具有較好的吲哚去除效率，但是運(yùn)行費(fèi)用高、能耗大，且會(huì)產(chǎn)生毒性更大的持久性有機(jī)污染物，對(duì)于二次污染的治理，無疑又增加了治理費(fèi)用［18］。而微生物轉(zhuǎn)化在吲哚污染系統(tǒng)修復(fù)中具有高效、價(jià)廉且環(huán)境友好的特點(diǎn)，被廣泛用于環(huán)境污染物的處理中［19］。

雖然近年來吲哚的生物降解得到了比較深入的研究，但菌種資源還較少，并且研究重點(diǎn)大多為吲哚降解中間產(chǎn)物的鑒定及降解途徑的推測(cè)，而目前已報(bào)道的能降解吲哚的微生物主要有假單胞菌（Psedomonas）、產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes）、貪銅菌（Cupriavidus）和伯克霍爾德菌（Burkholderia）等［20］。通過對(duì)上述菌屬吲哚的降解途徑進(jìn)行總結(jié)，靛紅和鄰氨基苯甲酸是吲哚降解途徑中重要的中間產(chǎn)物［21］。然而前期對(duì)吲哚降解的分子機(jī)制研究一直尚不明確，直到2017年，Sadauskas等［22］首次報(bào)道了不動(dòng)桿菌Alcaligenes sp.O153在吲哚加氧酶（iif基因簇）的作用下生成鄰氨基苯甲酸，后來Qu等［23］通過對(duì)貪銅菌Cupriavidus sp.SHE研究發(fā)現(xiàn)吲哚在吲哚加氧酶IndA作用下生成靛紅，由此為微生物降解吲哚分子研究打下基礎(chǔ)。

不同吲哚好氧降解菌的吲哚去除速率有一定差異，Alcaligenes sp. YBY在12 h內(nèi)能完全降解100 mg/L吲哚，達(dá)到目前報(bào)道的最高降解效率［17］，然而大多數(shù)的吲哚降解菌至少需要1-36 d的時(shí)間才能完全降解100 mg/L吲哚［20］。此外，將吲哚降解菌株直接應(yīng)用于豬糞吲哚降解的研究較少，其降解效果也不夠高效，如邵栓等［24］將豬糞中篩選得到的克雷伯氏菌（Klebsiella）、貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）等菌分別直接作用于豬糞，吲哚的去除率最高只能達(dá)到59.12%，因此利用微生物直接降解豬糞水中吲哚仍需要進(jìn)一步研究。在前期的研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一株高效的吲哚降解菌株IDO5，本文研究了其直接降解豬糞中吲哚的能力，并探討了菌株降解吲哚可能的途徑，以期望對(duì)用微生物降解養(yǎng)殖廢水中吲哚污染物提供一定的參考和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

吲哚標(biāo)準(zhǔn)品購自上海佰曄生物科技中心，色譜級(jí)乙腈、色譜級(jí)甲醇購自上海阿拉丁試劑有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購自生工生物工程（上海）。使用的主要儀器：恒溫培養(yǎng)箱，高速低溫冷凍離心機(jī)（Multifuge-X1R 美國(guó) Thermo），高效液相 色 譜 儀（high-performance liquid chromatography，HPLC）（Waters E2695 美國(guó) Waters），三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（triple quadrupole gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）（TQ8040 日本島津企業(yè)）。

用于吲哚降解實(shí)驗(yàn)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）配方（g/L）：Na2HPO4·12H2O 3.28，（NH4）2SO42.0，KH2PO42.0，F(xiàn)eCl30.000 25，pH自然，1×105Pa，滅菌20 min；用于菌株培養(yǎng)的LB培養(yǎng)基配方（g/L）：蛋白胨 10.0，酵母粉 5.0，NaCl 10.0，pH 7.3，瓊脂粉10.0（固體培養(yǎng)基），1×105Pa滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌體形態(tài)觀察 將菌株IDO5接種到滅菌后的100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h備用。取2 mL菌液，8 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入戊二醛水溶液（2.5%）固定2 h，然后用乙醇梯度脫水（30%、50%、70%、90%、95%、100%），最后臨界點(diǎn)干燥和離子濺射金后用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察菌株IDO5的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2 菌株16S rRNA基因序列測(cè)定 利用菌株IDO5的DNA作為模板，以16S rRNA基因的通用引物作為擴(kuò)增引物，上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′； 下 游 引 物1492R ：5′-GGTTAC- CTTGTTACGACTT-3′。 對(duì) 菌 株IDO5的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括DNA模板1 μL，上游引物27F 2 μL，下游引物 1492R 2 μL，Taq 酶 0.8 μL，20 μmol/L dNTP 4 μL，10×Buffer緩 沖 液 5 μL， 無 菌 ddH2O 35.2 μL。PCR克隆擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性10 min，30個(gè)循環(huán)（94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s），最后72℃延伸5 min。PCR完成之后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收并送公司測(cè)序。

1.2.3 吲哚檢測(cè) 取10 mL甲醇至5 mL吲哚反應(yīng)體系中，充分震蕩混勻，混合液經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾注射到進(jìn)樣瓶中。采用高效液相色譜-光化學(xué)反應(yīng)器-熒光檢測(cè)器（high performance liquid chromatography-photoelectric reactor-fluorescence detector，HPLC-PHR-FLD）完成吲哚的檢測(cè)。色譜條件：色譜柱為XBridgeTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈∶水=60∶40（V/V），流速1 mL/min，柱溫35℃，洗脫時(shí)間15 min，熒光激發(fā)光波長(zhǎng)270 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)350 nm。

1.2.4 菌株IDO5的底物譜 將菌株IDO5接種到滅菌后的100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h備用。取上述菌液2 mL到離心管中，4℃，12 000 r/min離心10 min，去上清，取沉淀到10 mL無機(jī)培養(yǎng)基中，分別加入吲哚類似物5-溴二氫吲哚（5-bromoindoline）、3-甲 基 吲 哚（3-methylindole）、2-甲基吲哚（2-methylindole）、色氨酸（tryptamine）和常見的芳香族化合物對(duì)甲酚（p-Cresol）和苯酚（phenol）為碳源（100 mg/L），研究菌株IDO5的底物譜。反應(yīng)條件：溫度37℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，pH 7，反應(yīng)24 h。以吲哚為唯一底物的實(shí)驗(yàn)組作為對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 菌株IDO5降解豬糞廢水吲哚條件的優(yōu)化 豬糞廢水采自與廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所動(dòng)物養(yǎng)殖基地，豬糞廢水高壓滅菌后，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫糜诳疾觳煌瑮l件對(duì)IDO5降解吲哚的影響。將菌株IDO5接種到滅菌后的100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h備用，按照以下條件優(yōu)化豬糞廢水中吲哚的降解條件。

1.2.5.1 溫度 取1 mL菌液到離心管，4℃，12 000 r/min離心10 min，去上清，取沉淀到10 mL豬糞廢水中，分別在溫度為20℃、30℃、37℃、40℃和50℃下研究不同溫度對(duì)菌株IDO5降解吲哚的影響。反應(yīng)條件：轉(zhuǎn)速200 r/min，pH 7，反應(yīng)24 h。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.5.2 轉(zhuǎn)速 取1 mL菌液到離心管，4℃，12 000 r/min離心10 min，去上清，取沉淀到10 mL豬糞廢水中，分別在轉(zhuǎn)速為 0、50 r/min、100 r/min、170 r/min、200 r/min和250 r/min下研究不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌株IDO5降解吲哚的影響。反應(yīng)條件：溫度37℃，pH7，反應(yīng)24 h。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.5.3 pH 取1 mL菌液到離心管，4℃，12 000 r/min離心10 min，去上清，取沉淀到10 mL豬糞廢水中，分別在pH 3、pH 5、pH 7、pH 9和pH 11下研究不同pH對(duì)菌株IDO5降解吲哚的影響。反應(yīng)條件：溫度37℃，轉(zhuǎn)速170 r/min，反應(yīng)24 h。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.5.4 碳源 取1 mL菌液到離心管，4℃，12 000 r/min離心10 min，去上清，取沉淀到10 mL豬糞廢水中，分別加入葡萄糖（glecose）、酵母提取物（yeast extract）、檸檬酸鈉（sodium citrate）和色氨酸（tryptophan）研究不同碳源（100 mg/L）對(duì)菌株IDO5降解吲哚的影響。反應(yīng)條件：溫度37℃，轉(zhuǎn)速170 r/min，pH 9，反應(yīng)24 h。以吲哚為唯一底物的實(shí)驗(yàn)組作為對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 不同時(shí)間下菌株IDO5對(duì)豬糞廢水中吲哚的降解能力 將菌株IDO5接種到滅菌后的100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。取上述菌液1 mL到離心管中，4℃，12 000 r/min離心10 min，去上清，加入10 mL上述豬糞廢水中，震蕩搖勻。反應(yīng)條件：溫度37℃，轉(zhuǎn)速170 r/min，pH 9，反應(yīng)24 h。每隔4 h取樣，對(duì)樣品進(jìn)行萃取和液相分析。以不加菌的實(shí)驗(yàn)組為對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.7 不同濃度吲哚對(duì)菌株IDO5降解能力的影響 向豬糞廢水中添加終濃度為100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L的吲哚，將菌株IDO5接種到滅菌后的100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，170 r/min培養(yǎng)24 h備用，取上述菌液1 mL到離心管，4℃，12 000 r/min離心10 min，去上清，取沉淀到10 mL豬糞廢水中。反應(yīng)條件：溫度 37℃、pH 9、轉(zhuǎn)速170 r/min，反應(yīng)24 h，每4 h取樣，對(duì)樣品進(jìn)行萃取和液相分析。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.8 菌株IDO5降解吲哚產(chǎn)物分析 將菌株IDO5接種到滅菌后的100 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，170 r/min培養(yǎng)24 h備用。取4 mL菌液到離心管，4℃，12 000 r/min離心10 min，去上清，取沉淀到5 mL MSM培養(yǎng)基中，加入10 mg/mL吲哚50 μL（反應(yīng)體系終濃度100 mg/L），在菌株IDO5降解吲哚的0 h，10 h和24 h分別取樣，取10 mL乙酸乙酯至5 mL吲哚反應(yīng)體系中，充分震蕩混勻，取上層有機(jī)相經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾注射到進(jìn)樣瓶中。采用三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（triple quadrupole gas chromatographymass spectrometry）完成吲哚及其降解產(chǎn)物的檢測(cè)。色譜條件：色譜柱為DB-5MS（30 m，0.25 mm，0.25 μm），柱溫60℃，離子源溫度為230℃，接口溫度為250℃。采用不分流恒定線速度進(jìn)樣，升溫程序：60℃保持5 min后每分鐘升溫5℃-80℃，之后每分鐘升溫10℃-290℃，最后保持5 min。采集方式Q3 scan，間隔時(shí)間為0.3 s。

2 結(jié)果

2.1 菌體形態(tài)和菌株16S rRNA基因測(cè)序鑒定

從實(shí)驗(yàn)室篩選而來的一株能以吲哚為碳源生長(zhǎng)的菌株，命名為IDO5。菌株IDO5在LB固體培養(yǎng)基上的菌落形貌如圖1-A 所示，菌落呈白色圓點(diǎn)狀，為點(diǎn)狀凸起，邊緣整齊，表面光滑易挑起。通過掃描電鏡觀察，如圖1-B所示，菌株呈鏈球狀，長(zhǎng)度約5 μm，無鞭毛。將菌株IDO5的16S rRNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，菌株IDO5的16S rRNA基因序列與海氏腸球菌（Enterococcus hirae）菌屬的相似性高達(dá)99%，通過MEGA7.0處理分析后構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，IDO5與E.hirae聚為一類（圖2），結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，將菌株IDO5鑒定為海氏腸球菌（E.hirae）IDO5。

圖1 IDO5形態(tài)學(xué)特征Fig. 1 Morphological characteristics of IDO5

圖2 IDO5-16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequence of IDO5

2.2 IDO5對(duì)吲哚和吲哚類似物的降解能力

實(shí)驗(yàn)初步測(cè)定了菌株IDO5對(duì)100 mg/L吲哚的降解能力。圖3為對(duì)照組和菌株IDO5在吲哚-MSM（100 mg/L）中分別培養(yǎng)12 h和24 h后用HPLC測(cè)定的吲哚含量，吲哚的HPLC出峰時(shí)間為11.3 min。由圖3可知，在以吲哚為碳源的情況下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)吲哚的峰面積不斷減少，12 h的降解率為44.4%，24 h后的降解率為93%。

圖3 IDO5菌液處理吲哚及對(duì)照的HPLC結(jié)果Fig. 3 HPLC results of treated indole by IDO5 bacterial solution and control

實(shí)際上的養(yǎng)殖和工業(yè)廢水中還可能包含有多種污染物，實(shí)驗(yàn)比較了菌株IDO5利用5-溴二氫吲哚（5-Bromoindoline）、3-甲 基 吲 哚（3-Methylindole）、2-甲基吲哚（2-Methylindole）、色氨酸（Tryptophan）和常見的芳香族化合物對(duì)甲酚（p-Cresol）、苯酚（Phenol）的能力。由表1可知，除吲哚外，菌株IDO5對(duì)上述物質(zhì)均有一定的降解能力。對(duì)吲哚類衍生物5-溴二氫吲哚、3-甲基吲哚、2-甲基吲哚和色氨酸的降解率分別為39%、70%、33%和67%。對(duì)甲酚和苯酚的降解率也60%和74%。菌株IDO5能夠?qū)ΤＲ姷倪胚犷愌苌镔|(zhì)和苯環(huán)類物質(zhì)均有降解能力，說明菌株IDO5具有較廣的底物譜。

表1 菌株IDO5的底物廣譜性Table 1 Substrate spectrum of strain IDO5

2.3 不同條件下菌株IDO5降解豬糞廢水中吲哚的效率

2.3.1 溫度 實(shí)驗(yàn)比較了20-50℃范圍內(nèi)，溫度對(duì)IDO5降解吲哚效率的影響。由圖4可知，不同溫度條件下，菌株IDO5都具有較強(qiáng)的吲哚降解能力。在20℃時(shí)IDO5對(duì)吲哚的降解率最小，為54.6%，在37℃條件下，IDO5對(duì)吲哚的降解率最大，為77.5%，在溫度為50℃時(shí)，IDO5對(duì)吲哚的降解率還有61.0%。因此總體而言，菌株IDO5在20-50℃范圍內(nèi)吲哚降解率都能達(dá)到54.6%以上，說明IDO5具有較強(qiáng)的溫度適應(yīng)能力。

圖4 溫度對(duì)IDO5降解豬糞廢水中吲哚的影響Fig. 4 Effects of temperature on the degradation of indole in pig anure wastewater by IDO5

2.3.2 轉(zhuǎn)速 轉(zhuǎn)速對(duì)IDO5降解吲哚的效率有較大影響。由圖5可知，在靜止的情況下，IDO5對(duì)吲哚的降解率僅為17.6%；在50-170 r/min范圍內(nèi)轉(zhuǎn)速越高，吲哚降解率越高，在170 r/min能達(dá)到80.3%；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到250 r/min時(shí)，吲哚降解率反而有所下降，只有45.7%。因此IDO5降解100 mg/L吲哚最佳的轉(zhuǎn)速為170 r/min，降解率可達(dá)80.3%。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)IDO5降解豬糞廢水中吲哚的影響Fig. 5 Effect of rotating speed on the degradation of indole in pig manure wastewater by strain IDO5

2.3.3 pH 本研究比較了不同pH對(duì)IDO5降解吲哚效率的影響。由圖6可知，接種24 h后，pH為3-7時(shí)吲哚降解率由55.7%-75.5%范圍內(nèi)逐漸升高，pH為11時(shí)菌株對(duì)吲哚的去除率可達(dá)88.3%，而pH為9時(shí)降解速率最高，為93.7%，說明菌株不僅在堿性環(huán)境下具有更強(qiáng)的吲哚降解性質(zhì)，而且在酸性范圍內(nèi)也能保持較好的吲哚降解活性，具備較高的pH適應(yīng)能力。

圖6 pH對(duì)IDO5降解豬糞廢水中吲哚的影響Fig. 6 Effect of pH on the degradation of indole in pig manure wastewater by strain IDO5

2.3.4 外加碳源 比較了4種不同碳源對(duì)IDO5降解吲哚效率的影響。由圖7可知，加入其它碳源后，菌株的吲哚降解能力均呈下降態(tài)勢(shì)，其中檸檬酸鈉和葡萄糖對(duì)菌株吲哚降解能力影響較大，分別下降了55.7%和47.2%。這說明在有檸檬酸鈉和葡萄糖等碳源存在的情況下，菌株IDO5優(yōu)先利用其它碳源，對(duì)吲哚的利用排在之后，從而影響了吲哚的降解。

圖7 外加碳源對(duì)IDO5降解豬糞廢水中吲哚的影響Fig. 7 Effect of exogenous carbon source on the degradation of indole in pig manure wastewater by strain IDO5

由于所選擇的幾種碳源物質(zhì)對(duì)吲哚的降解均起到抑制作用，因此IDO5降解豬糞廢水中吲哚最佳的條件為pH 9、溫度37℃和轉(zhuǎn)速170 r/min。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)考察在此條件下IDO5對(duì)豬糞廢水吲哚的降解情況。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)菌株IDO5降解吲哚的影響

在優(yōu)化的條件下，本文比較了不同時(shí)間下菌株IDO5降解豬糞水中吲哚的影響。由圖8可知，24 h內(nèi)未加IDO5的豬糞廢水中吲哚濃度幾乎不變，維持在0.12 mg/L。但是加入菌株IDO5到豬糞水中后，從8 h開始吲哚的濃度即開始下降，豬糞水中的吲哚含量在24 h內(nèi)幾乎完全降解，降解率超過98.2%，說明IDO5對(duì)豬糞水中吲哚有很高的去除效果，具有較大的應(yīng)用前景。

圖8 菌株IDO5降解豬糞水中吲哚在24 h內(nèi)的變化情況Fig. 8 Variation of indole degradation in pig manure water by strain IDO5 during 24 h

2.5 底物濃度對(duì)菌株IDO5降解吲哚的影響

為考察菌株IDO5對(duì)吲哚的最大降解能力，實(shí)驗(yàn)比較了在豬糞廢水中額外添加100、200和400 mg/L吲哚情況下IDO5的降解能力。由圖9可知，菌株IDO5對(duì)于不同濃度的吲哚均有一定的降解能力。但是隨著底物濃度的增加，吲哚的降解率也不斷減少，菌株IDO5在100 mg/L吲哚的條件下對(duì)吲哚的去除率最高，24 h內(nèi)達(dá)到93.7%，對(duì)200 mg/L和400 mg/L吲哚降解率明顯低于100 mg/L，分別達(dá)到70.5%和41.5%。

圖9 菌株IDO5對(duì)不同濃度吲哚在24 h內(nèi)的降解情況Fig.9 Variation of indole degradation in different concentrations by strain IDO5 during 24 h

2.6 菌株IDO5降解產(chǎn)物分析

對(duì)菌株IDO5降解吲哚的中間產(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析，如表2所示，在菌株IDO5降解10 h和24 h后，反應(yīng)體系中產(chǎn)生了很多中間產(chǎn)物，一些物質(zhì)的含量隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，信號(hào)值不斷增大。其中含苯環(huán)的物質(zhì)包括 1，3-二叔丁基苯（benzene，1，3-bis）、α-羥基異丁酰苯（2-hydroxy-2-methylpropiophenone）和鄰甲基苯甲醛（2-methylbenzaldehyde）。鄰甲基苯甲醛與吲哚具有相同的苯環(huán)基團(tuán)，而且和已發(fā)現(xiàn)的吲哚降解產(chǎn)物鄰氨基苯甲酸結(jié)構(gòu)高度相似，因此推測(cè)IDO5降解吲哚可能是通過鄰氨基苯甲酸途徑。除此之外，在吲哚降解過程中還發(fā)現(xiàn)了一些開環(huán)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)出現(xiàn)，如4-甲基癸烷（4-Methyldecane）、1-壬醇（1-Nonanol）和2-十一烯（2-Undecene）等可能是吲哚的深度降解產(chǎn)物。

表2 菌株IDO5降解吲哚GC-MS目標(biāo)組分譜Table 2 Target component spectrum of indole degrading GC-MS by strain IDO5

3 討論

目前關(guān)于吲哚降解的微生物種類并不多見，而且不同的吲哚降解菌對(duì)吲哚的降解效率有較大差異，由表3可知Pseudomonas aeruginosaGs降解58.5-175 mg/L吲哚大約需要36 d，Comamonas sp. IDO1與Xenophilus sp. IDO4 降解100 mg/mL吲哚需要160 h，而Cupriavidus sp. SHE能夠在24 h完全降解100 mg/mL吲哚。本實(shí)驗(yàn)中的海氏腸球菌（Enterococcus hirae）IDO5是一株新型的吲哚降解菌株，不僅能夠直接應(yīng)用于豬糞降解，而且能在24 h內(nèi)降解100 mg/mL吲哚高達(dá)93.7%，和上述菌株相比，降解能力相當(dāng)。但是菌株IDO5能夠在更復(fù)雜、更極端的環(huán)境下保持穩(wěn)定且高效的吲哚降解作用，且菌株IDO5具有底物廣譜性，不僅能高效降解吲哚，對(duì)其他污染物的降解也能保持在較高的水平，說明菌株IDO5是一株性能良好且穩(wěn)定的有毒污染物降解菌株。

表3 吲哚降解菌資源Table 3 Resources of indole degrading bacteria

根據(jù)前期對(duì)吲哚好氧降解菌的研究中發(fā)現(xiàn)，目前已知的研究較為透徹的吲哚降解途徑主要有：吲哚→靛紅→鄰氨基苯甲酸→水楊酸→鄰苯二酚途徑和吲哚→靛紅→鄰氨基苯甲酸→龍膽酸途徑［30］。許多研究證明靛紅和鄰氨基苯甲酸是微生物降解吲哚過程中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，也說明了細(xì)菌通過吲哚→靛紅→鄰氨基苯甲酸可能是微生物降解吲哚普遍存在的機(jī)制。本研究在觀察產(chǎn)物顏色的過程中發(fā)現(xiàn)，降解產(chǎn)物呈明顯的紅色，說明菌株IDO5也可能是通過吲哚→靛紅途徑降解吲哚。除此之外，對(duì)菌株IDO5降解吲哚進(jìn)行產(chǎn)物GC-MS分析，檢測(cè)到了鄰甲基苯甲醛的出現(xiàn)。因此如圖10所示，菌株IDO5可能是通過吲哚→靛紅→鄰氨基苯甲酸→鄰甲基苯甲醛途徑降解吲哚。但是本文并沒有檢測(cè)出鄰甲基苯甲醛進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物，這可能和所選用的儀器條件不適合這些物質(zhì)的檢測(cè)有關(guān)。在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步深入分析降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，確定其降解途徑。

圖10 菌株IDO5降解吲哚途徑推測(cè)Fig.10 Pathway of indole degradation by strain IDO5

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)一株高效吲哚降解菌IDO5，經(jīng)鑒定為海氏腸球菌（Enterococcus hirae），其降解吲哚最佳條件為：溫度37℃，轉(zhuǎn)速170 r/min，pH 9，在此條件下能夠在24 h內(nèi)對(duì)豬糞廢水中吲哚的降解效率高達(dá)98%，在豬糞廢水中額外添加100 mg/L吲哚，去除效率仍然可達(dá)到93.7%。除吲哚外，菌株IDO5能夠降解多種吲哚衍生物和有機(jī)污染物，展現(xiàn)出較寬泛的底物譜。利用GC-MS分析菌株IDO5降解吲哚的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，得出吲哚可能是通過吲哚→靛紅→鄰氨基苯甲酸→鄰甲基苯甲醛途徑降解。綜上，菌株IDO5在畜禽廢水處理中具有一定的應(yīng)用潛能。