唐瓔 黃佳 鄧展瑞 楊曉楠

（甘肅省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，蘭州 730050）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFT）是一類(lèi)對(duì)肝臟及免疫系統(tǒng)有強(qiáng)抑制性，對(duì)人畜有高致癌、致突變、致畸性的真菌毒素［1］。其中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是已發(fā)現(xiàn)的AFT中毒性及致癌性最強(qiáng)的，1993年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）將AFB1劃分為I類(lèi)致癌物［2］。AFB1分子有3個(gè)毒性結(jié)構(gòu)，分別是呋喃環(huán)雙鍵，香蘭素內(nèi)脂環(huán)和戊烯酮環(huán)［3-4］。目前，食品中常用的AFB1吸附方法有物理法，化學(xué)法，生物法及基因干預(yù)4種方法。生物法去除AFB1效率最高，特異性最強(qiáng)，污染最小。生物利用本身特異性結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物吸附、修飾、破壞AFB1毒性分子結(jié)構(gòu)，達(dá)到去除毒素的效果［5-6］。

目前對(duì)生物降解AFB1產(chǎn)物分析較少，邵帥等［7］分析篩選到的霉菌HSK8降解AFB1后，AFB1熒光減弱，產(chǎn)生新的熒光物質(zhì)，菌株降解AFB1后產(chǎn)物也具有熒光特性。Samuel等［8］通過(guò)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀及傅里葉紅外光譜儀發(fā)現(xiàn)惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）降解AFB1后產(chǎn)物產(chǎn)生低毒性化合物AFD1，AFD2和AFD3，菌株降解AFB1結(jié)構(gòu)中呋喃、內(nèi)脂環(huán)和戊烯酮環(huán)等結(jié)構(gòu)。Eshelli等［9］發(fā)現(xiàn)紅平紅球菌菌株（Rhodococcus erythropolis）降解AFB1途徑是經(jīng)過(guò)脂肪酸代謝和糖發(fā)酵積累中間體形成分子式為C13H16O4的芳香族化合物。張曉雪等［10］篩選的新型黑曲霉FS-UV1（Aspergillus Niger FSUVI）降解產(chǎn)物通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明降解產(chǎn)物為低毒性化合物。但是綜上研究對(duì)菌株降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)研究較少，不能明確降解產(chǎn)物的究竟是哪種化合物，以及分子結(jié)構(gòu)，也不能有效分析菌株降解AFB1的機(jī)制，且對(duì)產(chǎn)物毒性分析研究不足。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期篩選的一株可降解AFB1的枯草芽孢桿菌WTX1（Bacillus subtilis WTX1）為研究對(duì)象，利用液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-MS/MS）及核磁共振氫譜（1H NMR）檢測(cè)菌株WTX1降解AFB1產(chǎn)物，兩種方法互相驗(yàn)證，明確降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)菌株WTX1降解機(jī)制，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，評(píng)估降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞代謝毒性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞來(lái)源 實(shí)驗(yàn)室前期采集青藏高原牦牛糞，從中分離出一株AFB1降解率為83.5%（AFB1濃度為10 μg/mL的培養(yǎng)液）的芽孢桿菌屬菌株WTX1，該菌株4℃保藏于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面。

L-02（正常人體肝細(xì)胞）細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞保存庫(kù)傳代保存。

1.1.2 主要試劑

（1）培養(yǎng)基與試劑。胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基TSA（CM168），胰蛋白胨大豆肉湯 TSB（CM301），磷 酸 緩 沖 鹽 溶 液（phosphate buffer saline，PBS）（CM1022）由北京陸橋提供。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基（Cat No：27016021）美國(guó)Gibco；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Cat No：26140），美國(guó) Gibco；0.05%trypsin-EDTA（Cat No：25300054）美國(guó) Gibco。

（2）UPLC-MS/MS試 劑。 乙 晴（ 色 譜 純，sigma）；二氯甲烷（色譜純，sigma）；甲醇（色譜純，sigma）；苯（色譜純，sigma）。

（3）核磁共振氫譜（1H NMR）：氘代氯仿-D 0.03%TMS（僑怡生物科技（上海）有限公司）。

（4）AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液（色譜純，sigma）；AFB1-MRS/RPMI 1640溶液（濃度10 μg/mL）：將AFB1加入滅菌后的MRS/RPMI 1640培養(yǎng)基中，濃度為10 μg/mL。

北京綠林認(rèn)證有限公司是中國(guó)林產(chǎn)工業(yè)協(xié)會(huì)授權(quán)的首批第二方認(rèn)定機(jī)構(gòu)，已全面開(kāi)展了無(wú)醛人造板及其制品的認(rèn)定工作。在無(wú)醛認(rèn)定基礎(chǔ)上，北京綠林認(rèn)證有限公司結(jié)合無(wú)醛人造板及其制品認(rèn)定規(guī)則及人造板行業(yè)的實(shí)際情況，制定了無(wú)醛人造板及其制品的追溯體系，并開(kāi)發(fā)了北京綠林認(rèn)證有限公司專(zhuān)有的溯源平臺(tái)。

1.1.3 儀器設(shè)備 超高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（QTRAP 4500），SCIEX；核磁共振波譜儀（AVANCE III 400），瑞士布魯克，蘭州大學(xué)功能有機(jī)分子化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；立式蒸汽滅菌器（LDZF-50KB-II），上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；電子天平（TLE204E102），瑞士梅特勒托利多；恒溫培養(yǎng)箱（MIR-H163-PC），日本松下；超凈工作臺(tái)（SWCJ），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床（Stab Mini），上海潤(rùn)度生物科技有限公司；倒置顯微鏡（TS100），日本尼康；細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀（Vi-CELL XR），貝克曼庫(kù)爾特。

1.2 方法

1.2.1 菌株降解液檢測(cè) 將純化的WTX1菌株，制備濃度為107CFU/mL菌懸液（PBS，pH7.4），取50 mL接種于500 mL AFB1-TSB培養(yǎng)液中（10 μg/mL），30℃避光發(fā)酵72 h后，收集上清液（12 000 r/min，15 min，4℃）。取1 mL上清液，用等體積二氯甲烷渦旋振蕩萃取3次，萃取液在55℃條件下氮吹干燥。用1 mL甲醇（GR）溶解沉淀，0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，渦旋混勻進(jìn)樣。用UPLC-MS/MS方法檢測(cè)上清液中殘留的AFB1含量，測(cè)量菌株AFB1降解率。利用公式［11-12］：

S：菌株AFB1降解率，%；C：接種菌株發(fā)酵一段時(shí)間后樣品中剩余AFB1對(duì)應(yīng)峰面積；F：對(duì)照樣品中（未接種菌株發(fā)酵）AFB1對(duì)應(yīng)峰面積。

1.2.2 UPLC-MS/MS質(zhì)譜條件 參照唐瓔等［11］方法條件。色譜條件：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱箱溫度：40℃；流動(dòng)相（乙酸銨/甲醇）液相色譜梯度洗脫。質(zhì)譜條件：電離方式：電噴霧電離（electrospray i-onization，ESI+）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（multi-polyreaction monitoring，MRM）；氣簾氣（CUR）：35 psi；碰撞氣（CAD）：medium；離子化電壓（IS）：5 500V；離子源溫度：550℃；噴霧氣（GSI）：55 psi；輔助 加熱器（GS2）：60 psi，以不含AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液發(fā)酵液做對(duì)照，扣除降解產(chǎn)物圖譜中基質(zhì)的干擾。

1.2.3 菌株WTX1降解產(chǎn)物分析 優(yōu)化李文明等［13］方法，取30℃發(fā)酵72 h菌株降解AFB1降解液，離心（8 000 r/min，15 min，4℃）分離上清液。上清液前處理同1.2.1中步驟。采用UPLC-MS/MS檢測(cè)菌株WTX1降解上清液，采集降解液總離子流圖，將總離子流圖峰值頂點(diǎn)的質(zhì)譜圖，導(dǎo)入NTST MS search 2.2軟件，降解液中化合物質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)比，分析降解產(chǎn)物可能的結(jié)構(gòu)，初步預(yù)測(cè)菌株WTX1的降解機(jī)制。

1.2.4 菌株降解產(chǎn)物核磁共振波譜法（1H NMR）檢測(cè) 參考楊登輝等［14］方法，取20 μL降解液于玻璃離心管中，加入氘代氯仿-D 0.03%TMS溶液0.5 mL，震蕩均勻，待測(cè)。核磁共振條件：測(cè)試溫度25℃，以TMS內(nèi)標(biāo)物校準(zhǔn)化學(xué)位移零點(diǎn)，掃描次數(shù)=64，譜線(xiàn)寬度=0.4 Hz，采集時(shí)間：8 min 50 s，工作頻率為400.14 MHz，光譜寬度為8 023.75 Hz。采用1H NMR法測(cè)定AFB1及菌株降解產(chǎn)物譜圖，并用TopSpin軟件扣除產(chǎn)物中AFB1標(biāo)物圖譜，分析產(chǎn)物中主要物質(zhì)結(jié)構(gòu)，與UPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果做驗(yàn)證。

1.2.5 菌株降解產(chǎn)物毒性分析 取第一次WTX1菌株降解液，進(jìn)行二次降解，確保在菌株降解產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)胞毒理試驗(yàn)之前，降解液中無(wú)原始添加的AFB1標(biāo)液殘留量，避免影響評(píng)估降解產(chǎn)物的細(xì)胞毒性。用UPLC-MS/MS檢測(cè)降解液中AFB1含量，降解液中AFB1含量低于檢出限（＜0.03 μg/L）。

1.2.5.1 細(xì)胞倍增時(shí)間檢測(cè) 正常的L-02人體肝細(xì)胞倍增時(shí)間為20 h，細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中受誘導(dǎo)突變的化合物影響，倍增時(shí)間會(huì)發(fā)生改變，檢測(cè)菌株WTX1降解AFB1降解液是否對(duì)細(xì)胞具有誘變性［15］。參照組：用RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)L-02標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞；對(duì)照組：AFB1-RPMI 1640溶液（AFB1濃度10 μg/mL）培養(yǎng)L-02標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞；試驗(yàn)組：100 mL RPMI 1640培養(yǎng)液中加入10 mL菌株WTX1降解液培養(yǎng)L-02標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞；計(jì)算3組實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的倍增時(shí)間。L-02細(xì)胞接種密度為5×104/ cm2，在24 孔板中先每個(gè)孔加入有血清的培養(yǎng)物，然后每個(gè)孔加入100 μL（細(xì)胞濃度0.1×106cells/mL），并且同時(shí)接3塊24孔板，分別在37℃，5%CO2，培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)第1、2、3天消化計(jì)數(shù)，以細(xì)胞總數(shù)為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，計(jì)算不同培養(yǎng)物中L-02細(xì)胞倍增時(shí)間。細(xì)胞倍增時(shí)間用公式（2）計(jì)算［16］。

1.2.5.2 細(xì)胞形態(tài)分析 在培養(yǎng)第1、2、3天，取接種培養(yǎng)在24孔板的參照組、對(duì)照組和試驗(yàn)組細(xì)胞，在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，比較3組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.5.3 細(xì)胞活性分析 利用細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀，在計(jì)數(shù)的同時(shí)，計(jì)算活細(xì)胞占比，比較參照組，對(duì)照組和試驗(yàn)組3種培養(yǎng)物對(duì)細(xì)胞活性的影響。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用minitab與Excel軟件進(jìn)行極差、單因素方差分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，采用單因素方差分析數(shù)據(jù)間差異，顯著性水平設(shè)定為 P＜0.05［17］。

2 結(jié)果

2.1 菌株WTX1降解AFB1產(chǎn)物結(jié)構(gòu)

采用UPLC-MS/MS方法，分析菌株WTX1降解AFB1產(chǎn)物成分，降解液總離子流圖中有6個(gè)明顯峰值，如圖1所示。將降解液總離子流圖與AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液培養(yǎng)物總離子流圖做對(duì)比，用不添加AFB1的發(fā)酵液扣除基質(zhì)影響，AFB1標(biāo)準(zhǔn)品譜圖如圖2所示。根據(jù)保留時(shí)間及峰值頂點(diǎn)的質(zhì)譜圖，總離子流圖中第6個(gè)峰代表化合物AFB1。其余峰值頂點(diǎn)質(zhì)譜圖與NTST MS search 2.2軟件標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)做對(duì)比，根據(jù)保留時(shí)間和碎片離子大小，產(chǎn)物1-5與AFB1有若干相同碎片離子，如39，51，63，77等，AFB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總離子流圖中保留時(shí)間5.3 min的峰與菌株降解液總離子流圖中相近時(shí)間產(chǎn)物2峰的全質(zhì)譜圖比較，兩者為不同物質(zhì)，且無(wú)重疊。據(jù)此可以判斷，降解液總離子流圖中峰值高的化合物1-5是菌株WTX1降解AFB1的產(chǎn)物，且有較高的同源性。根據(jù)NTST MS search 2.2軟件質(zhì)譜圖對(duì)比結(jié)果，產(chǎn)物1-5可能的結(jié)構(gòu)如圖3所示，分別是產(chǎn)物1：C3H4，m/z：40.0313；產(chǎn)物2：C6H6，m/z：78.0469；產(chǎn)物3：C7H8O2，m/z：78.0469；產(chǎn) 物 4：C8H6O2，m/z：134.03677；產(chǎn)物5：C11H10O4，m/z：206.057909。

圖1 菌株降解液總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of strain degradation fluid

圖2 AFB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)總離子流圖（A）及質(zhì)譜圖（B）Fig.2 Total ion flow chromatogram（A）and mass spectrum（B）of AFB1 standard material

圖3 降解上清液提取質(zhì)譜圖及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Mass spectrogram of degradation supernatant extracts and product structure

2.2 菌株降解產(chǎn)物核磁共振波譜（1H NMR）分析

采用1H NMR法測(cè)定AFB1及菌株降解產(chǎn)物譜圖，并用TopSpin軟件扣除產(chǎn)物中AFB1標(biāo)物圖譜，分析產(chǎn)物中主要物質(zhì)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)主要是碳?xì)鋯捂湥▓D4中結(jié)構(gòu)式1-2），亞甲基（圖4中結(jié)構(gòu)式3），苯環(huán)（圖4中結(jié)構(gòu)式4），苯環(huán)與呋喃環(huán)（圖4中結(jié)構(gòu)式5）。將核磁共振氫譜譜圖結(jié)果與UPLC-MS/MS軟件預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)比，菌株降解AFB1主要產(chǎn)物結(jié)構(gòu)兩者基本一致，僅產(chǎn)物3結(jié)構(gòu)略有不同，核磁共振氫譜譜圖中C=O位置處多2個(gè)-H鍵。核磁共振氫譜譜圖能更好的反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)以核磁共振結(jié)果為準(zhǔn)。但是UPLC-MS/MS方法可以通過(guò)質(zhì)譜分析離子碎片，佐證降解液中主要產(chǎn)物1-5與AFB1之間離子的同源性，確認(rèn)降解液中1-5化合物是菌株分解AFB1的產(chǎn)物。

圖4 菌株降解液核磁共振氫譜譜圖及主要物質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.4 1H nuclear magnetic resonance spectrum of strain degradation fluid and schematic diagram of main material structures

2.3 預(yù)測(cè)菌株WTX1降解AFB1機(jī)制

通過(guò)軟件比對(duì)WTX1降解AFB1產(chǎn)物質(zhì)譜圖，得到5種含量較高產(chǎn)物可能的結(jié)構(gòu)式，在這5種產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中不存在AFB1致毒性強(qiáng)的呋喃環(huán)雙鍵，香蘭素內(nèi)脂環(huán)和戊烯酮環(huán)結(jié)構(gòu)。推測(cè)WTX1降解機(jī)制是轉(zhuǎn)化AFB1中致毒性強(qiáng)的結(jié)構(gòu)，達(dá)到降解毒素的效果。預(yù)測(cè)菌株降解AFB1機(jī)制如圖5所示，菌株降解AFB1是通過(guò)2次裂解完成的，一級(jí)裂解是將AFB1結(jié)構(gòu)中香蘭素內(nèi)脂環(huán)（10，11，15位點(diǎn)）和戊烯酮環(huán)（14位點(diǎn)）結(jié)構(gòu)直接從AFB1母體上裂解，同時(shí)將8，9位的呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)破壞修飾，形成產(chǎn)物5（C11H10O4）；二次裂解是將產(chǎn)物5中苯環(huán)和-C=C-C=O-鏈斷開(kāi)，形成產(chǎn)物4（C8H6O2）和產(chǎn)物3（C7H8O2）；一二級(jí)裂解會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物即產(chǎn)物1（C3H4）和產(chǎn)物2（C6H6）。為驗(yàn)證AFB1因毒性結(jié)構(gòu)被破壞，達(dá)到降低毒性的效果，對(duì)WTX1菌株降解液進(jìn)行細(xì)胞毒理試驗(yàn)。

圖5 預(yù)測(cè)菌株WTX1降解AFB1機(jī)制Fig. 5 Predictive mechanism of strain WTX1 degrading AFB1

2.4 菌株WTX1降解AFB1產(chǎn)物毒性分析

2.4.1 WTX1菌株AFB1降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 利用細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀，在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d分別對(duì)3組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)表1所示，實(shí)驗(yàn)組與參照組相比，參照組培養(yǎng)的L-02細(xì)胞倍增時(shí)間約21 h-22 h，試驗(yàn)組細(xì)胞倍增時(shí)間也為21 h-22 h，兩組之間倍增時(shí)間無(wú)差異性（P＞0.05），細(xì)胞增長(zhǎng)量無(wú)差異（P＞0.05），說(shuō)明WTX1菌株降解AFB1產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞不具有誘變性。試驗(yàn)組與對(duì)照組相比較，對(duì)照組隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，倍增時(shí)間增加，細(xì)胞增長(zhǎng)緩慢，從培養(yǎng)第2天開(kāi)始，細(xì)胞大量凋亡，說(shuō)明AFB1對(duì)細(xì)胞有強(qiáng)致毒和變異性；菌株WTX1降解AFB1產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞影響不顯著，達(dá)到顯著解毒效果。

表1 降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞L-02細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Table 1 Effects of degraded products on the growth of L-02 cells

2.4.2 WTX1菌株AFB1降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d時(shí)，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，如圖6所示。參照組細(xì)胞形態(tài)呈上皮樣細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)，具有橋粒和張力厚纖維。試驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)無(wú)變化，與參照組培養(yǎng)的L-02細(xì)胞一致。對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)率減緩，培養(yǎng)第2天，細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯增長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)變長(zhǎng)，有溶解現(xiàn)象，細(xì)胞活力變?nèi)?。培養(yǎng)第3天，細(xì)胞自然凋亡。說(shuō)明AFB1毒素對(duì)細(xì)胞毒性很強(qiáng)，能促使細(xì)胞變異死亡，而菌株降解AFB1的產(chǎn)物，毒性大大降低，對(duì)細(xì)胞基本無(wú)毒害。

圖6 不同培養(yǎng)基下細(xì)胞形態(tài)變化Fig.6 Morphological changes of cells in different media

2.4.3 WTX1菌株降解AFB1產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞活性的影響 在培養(yǎng)1 d、2 d、3 d時(shí)，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀數(shù)據(jù)，比較參照組，試驗(yàn)組，對(duì)照組細(xì)胞活力。參照組細(xì)胞具有較好活力（98%-99%）。試驗(yàn)組細(xì)胞活力很好（98%），與參照組培養(yǎng)的L-02細(xì)胞活力相似。對(duì)照組細(xì)胞活力逐漸減弱，第3 天細(xì)胞活力只有23%，細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中逐漸凋亡，如圖7所示。菌株WTX1菌株降解AFB1的產(chǎn)物不影響細(xì)胞活力，細(xì)胞可以正常生長(zhǎng)。

圖7 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞活性比較Fig.7 Comparison of cell activities in different media

3 討論

趙春霞等［18］研究AFB1有3個(gè)致毒、致變異的結(jié)構(gòu)，分別是呋喃環(huán)雙鍵、香豆素內(nèi)脂環(huán)、環(huán)戊烯酮結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)菌株降解AFB1，破壞這3個(gè)致毒、致畸變結(jié)構(gòu)后，產(chǎn)物毒性減弱，明確菌株WTX1的致毒機(jī)理。

Rao等［19］用篩選到的CFR1地衣芽孢桿菌（bacillus licheniformis CFR1）降解AFB1，等到的產(chǎn)物通過(guò)HPLC、高效液相色譜法和ESI-MS分析，降解產(chǎn)物熒光消失，證明AFB1被轉(zhuǎn)化無(wú)其他未知物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)用UPLC-MS/MS檢驗(yàn)方法延伸Rao等［19］的實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)采集菌株WTX1降解AFB1產(chǎn)物的總離子流圖和質(zhì)譜圖，創(chuàng)新用NTST MS search 2.2軟件進(jìn)行比對(duì)，明確產(chǎn)物種類(lèi)和結(jié)構(gòu)，并分析菌株降解機(jī)制，證實(shí)菌株將AFB1的3個(gè)毒性結(jié)構(gòu)降解，產(chǎn)生小分子化合物，達(dá)到降解的效果。

參考張丹楓，楊登輝等［14，20］，利用核磁共振氫譜檢驗(yàn)手段確定化合物結(jié)構(gòu)，并驗(yàn)證UPLC-MS/MS質(zhì)譜結(jié)果，結(jié)果表明兩者檢測(cè)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)基本相同，核磁共振氫譜檢驗(yàn)更準(zhǔn)確，但是UPLC-MS/MS質(zhì)譜可以通過(guò)分析質(zhì)譜離子碎片，溯源降解液中化合物和AFB1化合物之間的同源性，佐證降解液中化合物是AFB1的降解產(chǎn)物。

Samuel等［8］篩選的惡臭假單菌（Pseudomonas putida）降解AFB1產(chǎn)物采用氣相色譜-質(zhì)譜和紅外光譜檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)AFB1的脫毒機(jī)制是通過(guò)呋喃，內(nèi)脂環(huán)的修飾和戊烯酮環(huán)丟失，轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)不同且毒性較低的新化合物（AFD1，AFD2和AFD3）。這與本實(shí)驗(yàn)研究的WTX1菌株脫毒機(jī)制略微不同。WTX1菌株是通過(guò)生物降解AFB1，將致突變結(jié)構(gòu)呋喃雙鍵，香豆素內(nèi)脂環(huán)及戊烯酮環(huán)結(jié)構(gòu)破壞，重新成為小分子的化合物。經(jīng)過(guò)細(xì)胞毒理試驗(yàn)，降解后的小分子產(chǎn)物無(wú)細(xì)胞毒性。

本實(shí)驗(yàn)用L-02細(xì)胞為研究對(duì)象，驗(yàn)證菌株WTX1降解AFB1產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒性。因?yàn)锳FB1毒素對(duì)肝臟細(xì)胞損害最多［21］，所以研究選用正常人體肝細(xì)胞L-02作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，更靈敏反應(yīng)降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞的毒性。并且實(shí)驗(yàn)前，進(jìn)行二次降解，確保前期添加的AFB1無(wú)殘留，避免影響降解產(chǎn)物細(xì)胞毒理分析。實(shí)驗(yàn)用AFB1降解菌株是前期從青藏高原牦牛糞中篩選到的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該類(lèi)菌株為食品中常用的發(fā)酵菌株，是食品級(jí)微生物，相較多數(shù)研究篩選的嗜麥芽窄食單胞菌［22］、假蜜環(huán)菌［23］、孢霉［24］、紅躥紅球菌［25］及綠色木霉等菌株［26］，本實(shí)驗(yàn)用菌株更具有食品安全性。

Wang等［27］從一株YK-624白腐真菌（Phanerochaete sordida）中純化的錳過(guò)氧化物酶，通過(guò)降解AFB1的8，9-不飽和碳-碳鍵生成AFB1-二氫二醇，達(dá)到脫毒的效果。本實(shí)驗(yàn)篩選到的WTX1枯草芽孢桿菌通過(guò)降解AFB1中3個(gè)毒性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生無(wú)毒的降解產(chǎn)物，達(dá)到脫毒目的，后期會(huì)分離純化菌株及代謝產(chǎn)物，明確菌株脫毒起主要作用的物質(zhì)。

4 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期篩選到的枯草芽孢桿菌WTX1為研究對(duì)象，通過(guò)UPLC-MS/MS及1H NMR方法，分析菌株降解AFB1產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，得到菌株WTX1降解AFB1的機(jī)制是通過(guò)兩次裂解，破壞AFB1結(jié)構(gòu)中的呋喃雙鍵，香豆素內(nèi)脂環(huán)及戊烯酮環(huán)，產(chǎn)生小分子化合物。對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)胞毒理實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)WTX1降解AFB1的產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞無(wú)致突變性，無(wú)毒性。