熊雪 李鵬 張貴合 向準(zhǔn) 陶文廣 周光燕 和耀威

（1. 貴州省生物研究所，貴陽(yáng) 550009；2. 貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，貴陽(yáng) 551400）

香菇（Lentinula edodes）是世界上第二大食用菌類(lèi)別［1］，因其獨(dú)特的鮮香口感，豐富的維生素和氨基酸，并皆具多種保健功能一直被大眾喜愛(ài)［2］，市場(chǎng)價(jià)值極高。尤其在“十三五”期間，聚焦國(guó)內(nèi)“脫貧攻堅(jiān)”、“產(chǎn)業(yè)扶貧”等政策，食用菌產(chǎn)業(yè)被列為脫貧主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)大力發(fā)展之后，香菇作為我國(guó)生產(chǎn)區(qū)域最廣、總產(chǎn)最高、影響最大的菇類(lèi)，也隨之成為南北方貧困地區(qū)實(shí)施產(chǎn)業(yè)精準(zhǔn)扶貧的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，其栽培規(guī)模更是成倍增長(zhǎng)。據(jù)調(diào)查，作為西南山區(qū)貧困代表的貴州省，2018年香菇總產(chǎn)量已達(dá)42.4萬(wàn)t，占貴州省食用菌總產(chǎn)量的47%?，F(xiàn)被貴州引種栽培的香菇品種繁多，但較為適宜貴州山區(qū)氣候的品種且栽培面積較廣的有香菇808及慶科系列香菇，如慶科212、慶科R20等。

香菇在自然界中是一類(lèi)重要的白腐真菌，廣泛的分布在林區(qū)落葉闊葉樹(shù)的腐木上，具有較強(qiáng)的木質(zhì)纖維素降解能力。漆酶作為主要的木質(zhì)素降解酶，參與香菇生長(zhǎng)發(fā)育的每一個(gè)階段［3］，在一定程度上可以反映為菌株生長(zhǎng)和菌絲對(duì)基質(zhì)的利用率［4］。在現(xiàn)行國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，香菇菌棒以木屑為主，麥麩、玉米芯或棉籽殼等為輔進(jìn)行不同比例搭配而成，不同的菌棒配方香菇的產(chǎn)量和品質(zhì)差異較大［5-7］。故本文選用貴州主栽品種香菇808、慶科R20以及貴州特有馬桑香菇為研究對(duì)象，初步研究了香菇菌株間的區(qū)別性差異，并以香菇袋料栽培常用基質(zhì)麥麩、玉米芯和青杠木屑、馬桑木屑為誘導(dǎo)基質(zhì)進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，初步探討香菇不同菌株產(chǎn)漆酶能力，旨在得到高產(chǎn)漆酶的栽培基質(zhì)，從而為提高和改善香菇的產(chǎn)量和品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)，助推貴州香菇產(chǎn)業(yè)振興。

1 材料與方法

1.1 材料

馬桑香菇、香菇808及慶科R20菌株由貴州省食用菌工程技術(shù)研究中心提供，現(xiàn)保存于貴州省生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 固體活化培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖 20 g，KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，維生素B110 mg，瓊脂粉20 g，去離子水1 L，pH自然。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，去離子水1 L，pH自然。

種子液培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g、酵母膏10 g，定容至1 L，121℃滅菌30 min。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以葡萄糖10 g，蛋白胨2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4·3H2O 1 g、KH2PO40.46 g，定容至1 L，為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。分別于100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入3 g孔徑粒度為20-60目的馬桑木屑（BM+MS）、青杠木屑（BM+QG）、玉米芯（BM+YMX）、麥麩（BM+MF）誘導(dǎo)物，121℃滅菌30 min。

1.2.2 香菇菌株間的區(qū)別性鑒定 將保存的馬桑香菇、香菇808、慶科R20分別接種于活化培養(yǎng)基上，25℃恒溫活化8 d，備用。

（1）拮抗試驗(yàn)。接種組合為2組。第一組：同種供檢菌種，于同一PDA平板上各接種1個(gè)接種塊；第二組：3種供檢菌種，于同一PDA平板上各接種1個(gè)接種塊，每組3個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)。

（2）建立香菇系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。采取購(gòu)買(mǎi)的生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取分離純化3種香菇菌株基因組DNA，提取之后的DNA選用真菌通用引 物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用25 μL的PCR反應(yīng)體系：基因組DNA（基因組20-50 ng/μL）0.5 μL ；10×buffer（ 含 Mg2+）；dNTP（各 2.5 mmol/L）1 μL；Taq酶 0.2 μL；正向引物 F（10 μmol/L）0.5 μL ；反 向 引 物 R（10 μmol/L）0.5 μL；加去離子水至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min，94℃變性45個(gè)循環(huán)，55℃退火45個(gè)循環(huán)，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸8 min，4℃終止反應(yīng)保存。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序后登陸GenBank對(duì)比，通過(guò)BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，下載最相近菌株的ITS rDNA序列，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

（3）不同溫度生長(zhǎng)速度測(cè)定。按照國(guó)家農(nóng)業(yè)部頒布的中國(guó)人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2560-2014《 植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 香菇》中香菇菌絲生長(zhǎng)階段的測(cè)定方法對(duì)3種香菇菌株菌絲進(jìn)行不同溫度生長(zhǎng)測(cè)試。

取3種香菇備用活化平板，使用打孔器打取直徑5 mm接種物，接種于PDA平板上，分別置于10、15、20、25、30℃下培養(yǎng)，觀(guān)察菌絲生長(zhǎng)情況。菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定采用“十”字交叉法，從菌絲萌發(fā)開(kāi)始，每24 h測(cè)量一次，同時(shí)記錄菌絲萌發(fā)時(shí)間，菌絲日均生長(zhǎng)速度以吃料后菌落平均每日直徑增長(zhǎng)量統(tǒng)計(jì)。菌絲鋪滿(mǎn)平板時(shí)，觀(guān)察記錄菌落的菌絲形態(tài)、色澤、菌落形狀、菌絲長(zhǎng)勢(shì)和邊緣特征等，用“+”、“-”表示菌絲的長(zhǎng)勢(shì)，“+”越多表示菌絲生長(zhǎng)得越好、越健壯、均勻，“-”表示菌絲不生長(zhǎng)。

1.2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)及漆酶活測(cè)定方法 取備用活化平板，使用打孔器打取直徑5 mm接種物，每100 mL種子培養(yǎng)基中無(wú)菌條件下放入5個(gè)接種物，25℃、150 r/min搖床避光培養(yǎng)。8 d后取勻漿機(jī)將三角瓶?jī)?nèi)的菌絲球攪拌30 s使其成均質(zhì)體。分別向100 mL含不同基質(zhì)培養(yǎng)料的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（BM+MS、BM+QG、BM+YMX、BM+MF）中加入3 mL攪拌均勻的香菇均質(zhì)體，于25℃、150 r/min搖床避光培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

發(fā)酵液經(jīng)雙層濾紙抽濾后，并于5℃低溫條件下12 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

漆酶活性的測(cè)定：3 mL反應(yīng)體系中含1 mL 1 mmol/L 2，2′-連氮 - 雙（3-乙基苯并噻唑 -6-磺酸）［2，2′-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonicacid），ABTS］底物、1.9 mL 50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 4.2）和100 μL適當(dāng)稀釋的酶液，于420 nm處測(cè)定5 min內(nèi)的吸光值變化。定義每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol ABTS所需的酶量為一個(gè)活性單位（U）。ABTS在420 nm處摩爾吸光系數(shù)為3.6×104L（/mol·cm）。從培養(yǎng)后第2天開(kāi)始測(cè)定其漆酶活性，連續(xù)測(cè)至培養(yǎng)12 d。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 利用EXCEL和SPSS 18.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，并進(jìn)行顯著性分析和雙因素方差檢驗(yàn)（two-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 香菇菌株間的區(qū)別性鑒定

2.1.1 拮抗試驗(yàn) 拮抗是檢測(cè)自身同其他種間是否有差異的傳統(tǒng)手段，親緣關(guān)系較近的菌株之間無(wú)拮抗或拮抗不明顯，而親緣關(guān)系較為疏遠(yuǎn)、不同遺傳背景的菌株之間則拮抗作用十分明顯［8-9］。由表1和圖1可知，馬桑香菇、香菇808、慶科R20菌株自身均無(wú)拮抗反應(yīng)，馬桑香菇同慶科R20和香菇808之間存在明顯的色素沉淀和拮抗溝，說(shuō)明馬桑香菇同慶科R20和香菇808之間拮抗作用明顯，即馬桑香菇菌株同慶科R20和香菇808菌株間存在差異。而慶科R20和香菇808之間雖然存在溝型，但并無(wú)明顯色素產(chǎn)生，說(shuō)明慶科R20和香菇808間拮抗作用不明顯。

圖1 3種香菇拮抗反應(yīng)Fig. 1 Antagonistic reaction of 3 kinds of L. edodes strain

表1 3種香菇拮抗試驗(yàn)對(duì)比Table 1 Antagonistic reaction of 3 kinds of L. edodes strain

2.1.2 建立香菇系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 3種香菇菌株的DNA提取結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，香菇菌株DNA條帶清晰，DNA的濃度、純度以及產(chǎn)率均比較高，可用于PCR擴(kuò)增。

圖2 3種香菇菌株rDNA ITS區(qū)段的PCR產(chǎn)物Fig. 2 PCR products of the rDNA ITS segments of the 3 kinds of L. edodes strain

經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，結(jié)果顯示3種香菇菌株rDNA ITS區(qū)段長(zhǎng)度均在700-800 bp之間，且所得序列經(jīng)Blast搜索，擊中結(jié)果均為L(zhǎng)entanula edodes，下載其相近序列10條，并結(jié)合香菇屬下其他種rDNA序列：Lentinula aciculospora、L. boryana、L. lateritia、L. madagasiksrensis、L. novaezelandiae、L.raphanica（每種隨機(jī)挑選2條），共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，3種供試菌株均為有機(jī)香菇Lentanula edodes，與其他香菇屬下種有本源差異，且3種香菇分別為有機(jī)香菇下的不同分支，且分支較遠(yuǎn)，說(shuō)明菌株間有差異。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的香菇系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of L. edodes constructed based on ITS sequence

2.1.3 不同溫度條件對(duì)3種香菇生長(zhǎng)的影響 結(jié)合表2和圖4可知，在所設(shè)溫度范圍內(nèi)，供試馬桑香菇、香菇808和慶科R20菌株菌落均呈絨毛狀白色圓形菌落，其日均生長(zhǎng)速度隨溫度升高均呈先增后減的趨勢(shì)，且在P＜0.05水平上有差異，峰值均在25℃條件下，分別為0.89、0.85和0.89 cm/d。

圖4 不同溫度條件下香菇菌絲日均生長(zhǎng)速度Fig. 4 Average daily growth rate of L. edodes under different temperature conditions

表2 不同溫度條件對(duì)3種香菇菌株生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of different temperature conditions on the growths of 3 kinds of L. edodes strain

馬桑香菇在所設(shè)溫度范圍內(nèi)菌絲日均生長(zhǎng)速度依次為 25℃＞20℃＞30℃＞15℃＞10℃，且在 15-30℃下菌落長(zhǎng)勢(shì)較好，其中20-25℃下最佳。說(shuō)明馬桑香菇菌絲適宜溫度范圍較廣，最適溫度為25℃，且中低溫較中高溫條件下菌絲生長(zhǎng)更好。香菇808在所設(shè)溫度范圍內(nèi)菌絲日均生長(zhǎng)速度依次為 25℃＞20℃＞30℃＞15℃＞10℃，且在 20-30℃下菌落長(zhǎng)勢(shì)較好，其中25-30℃下最佳。說(shuō)明香菇808菌絲適宜溫度范圍較廣，最適溫度為25℃，且中高溫條件下菌落長(zhǎng)勢(shì)較好。慶科R20在所設(shè)溫度范圍內(nèi)菌絲日均生長(zhǎng)速度依次為25℃＞20℃＞15℃＞30℃＞10℃，且在 15-25℃下菌落長(zhǎng)勢(shì)較好，最佳為25℃，且該溫度下菌絲生長(zhǎng)也最快。說(shuō)明慶科R20最適溫度為25℃，且中低溫條件較中高溫條件生長(zhǎng)更好且更快。

綜上，說(shuō)明3種香菇菌株菌絲生長(zhǎng)速度受溫度影響較大，但菌落長(zhǎng)勢(shì)受溫度影響較小，且雖然不同菌株的最適溫度均為25℃，但對(duì)中高溫和中低溫有不同的傾向性。

2.2 不同香菇菌株對(duì)漆酶活性的影響

雙因素方差檢驗(yàn)結(jié)果顯示，香菇不同菌株在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)漆酶能力各不相同，且在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，香菇液體產(chǎn)漆酶活性受菌株遺傳差異和不同栽培基質(zhì)的影響均為極顯著（P＜0.001）。

由表3、圖5可知，連續(xù)12 d培養(yǎng)中，同一誘導(dǎo)培養(yǎng)基上3種香菇菌株液體產(chǎn)漆酶活性有差異，且菌株對(duì)香菇液體產(chǎn)漆酶活性皆具有極顯著的影響（P＜0.001）。

圖5 3種香菇菌株在不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基上液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶活性對(duì)比Fig.5 Comparison of the laccase production activities of 3 kinds of L. edodes strains in liquid fermentation on different induction media

表3 4種栽培基質(zhì)對(duì)不同香菇漆酶活性的影響Table 3 Effects of 4 cultivation substrates on the laccase activities of different L. edodes

整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，不同菌株在相同的培養(yǎng)基上產(chǎn)漆酶活性有差異，所有菌株在連續(xù)培養(yǎng)12 d的漆酶活性變化趨勢(shì)均為先升后降，且培養(yǎng)前期活性較低，后期漆酶旺盛。具體表現(xiàn)為培養(yǎng)期前6 d，在所有誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，菌株香菇808和馬桑香菇均能檢測(cè)到相對(duì)較弱的漆酶活性，但不穩(wěn)定，且呈波浪狀上升；而慶科R20僅在含玉米芯（BM+YMX）、麥麩（BM+MF）誘導(dǎo)培養(yǎng)基中能檢測(cè)到較弱的漆酶活性，而在含馬桑木屑（BM+MS）誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，前6 d均未能檢測(cè)到漆酶活性，在含青杠木屑（BM+QG）誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，直至第6天才檢測(cè)出微弱的漆酶活性，平均酶活僅為0.16 U/L。

而對(duì)整個(gè)培養(yǎng)期而言，香菇808產(chǎn)漆酶能力在含馬桑木屑（BM+MS）、青杠木屑（BM+QG）及玉米芯（BM+YMX）的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上較馬桑香菇和慶科R20具有明顯優(yōu)勢(shì)，其漆酶活性最大分別達(dá)到238.64、288.94和464.06 U/L，且該峰值分別出現(xiàn)在第8天、第10天和第9天。此外，在BM+MS培養(yǎng)基上，慶科R20產(chǎn)酶能力最低，酶活性峰值出現(xiàn)在第11天，達(dá)41.75 U/L；在BM+YMX培養(yǎng)基上，所有菌株產(chǎn)漆酶能力均較高，其中最低的是馬桑香菇，酶活性峰值達(dá)237.15 U/L，也于培養(yǎng)第11天出現(xiàn)；而在BM+QG培養(yǎng)基上，馬桑香菇菌株較慶科R20先檢測(cè)到酶活，但培養(yǎng)8 d后，產(chǎn)酶能力開(kāi)始略低于慶科R20，最大酶活僅為22.08 U/L比慶科R20峰值（35.82 U/L）低13.74 U/L。在BM+MF培養(yǎng)基中，慶科R20較其他2種菌株產(chǎn)漆酶優(yōu)勢(shì)明顯，并于培養(yǎng)第10天達(dá)到峰值，酶活達(dá)265.07 U/L；香菇808產(chǎn)酶能力略低于慶科R20，最大酶活峰值于培養(yǎng)第9天出現(xiàn)，酶活達(dá)205.44 U/L；馬桑香產(chǎn)酶能力最低，但在培養(yǎng)第6-10天之間快升快降，酶活峰值出現(xiàn)在第8天，達(dá)161.83 U/L。

綜上可知，誘導(dǎo)基質(zhì)相同時(shí)，不同香菇菌株液體產(chǎn)漆酶的能力強(qiáng)弱不同，相對(duì)菌株馬桑香菇和慶科R20，香菇808在含馬桑木屑、青杠木屑及玉米芯的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中液體產(chǎn)漆酶能力最強(qiáng)；而基質(zhì)麥麩對(duì)慶科R20的誘導(dǎo)力更強(qiáng)；馬桑木屑對(duì)馬桑香菇的誘導(dǎo)力僅低于香菇808，青杠木屑誘導(dǎo)下，馬桑香菇和慶科R20的產(chǎn)酶能力相當(dāng)，說(shuō)明菌株的遺傳差異對(duì)漆酶活性大小有影響，同雙因素方差檢驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 不同栽培基質(zhì)對(duì)香菇產(chǎn)漆酶活性的影響

由表3、圖6可知，連續(xù)12 d培養(yǎng)中，在4種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上同一菌株液體產(chǎn)漆酶活性有差異，且培養(yǎng)基對(duì)香菇液體產(chǎn)漆酶活性皆具有極顯著的影響（P＜0.001）。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，菌株馬桑香菇、香菇808和慶科R20在4種不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)漆酶活性均隨培養(yǎng)時(shí)間呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)，但出現(xiàn)達(dá)到峰值的時(shí)間有差異，主要集中在第8-11天之間。

在不同培養(yǎng)階段，4種栽培基質(zhì)誘導(dǎo)對(duì)馬桑香菇產(chǎn)漆酶能力強(qiáng)弱不同，BM+MS、BM+QG培養(yǎng)下，馬桑香菇酶活峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)后期（第10天），酶活性分別為108.61和22.08 U/L，且整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程馬桑木屑均表現(xiàn)出強(qiáng)于青杠木屑的誘導(dǎo)力。4種基質(zhì)中，以BM+MF培養(yǎng)下馬桑香菇漆酶活性變化最為劇烈，且酶活峰值最高，出現(xiàn)在培養(yǎng)中期（第8天），值為161.83 U/L，且在7-9 d酶活遠(yuǎn)高于BM+MS培養(yǎng)。而在BM+YMX培養(yǎng)下前10 d，馬桑香菇漆酶活性均較BM+MS、BM+MF培養(yǎng)基低，在第10天后其活性遠(yuǎn)高于BM+MF培養(yǎng)基，第11天后略高于BM+MS培養(yǎng)基，酶活峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)后期（第11天），酶活為117.81 U/L。

菌株香菇808在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中其誘導(dǎo)產(chǎn)漆酶活性表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)的是BM+YMX培養(yǎng)基，其變化峰值出現(xiàn)在第9天，活性為464.06 U/L。而整個(gè)培養(yǎng)期，香菇808在培養(yǎng)基BM+MS、BM+QG及BM+MF培養(yǎng)下的產(chǎn)漆酶能力變化趨勢(shì)相互交錯(cuò)（圖6），其酶活峰值分別出現(xiàn)在培養(yǎng)期第8、9和10天，酶活分別為238.64、205.44和288.94 U/L；且在培養(yǎng)前9 d，培養(yǎng)基BM+MS誘導(dǎo)力優(yōu)勢(shì)明顯，培養(yǎng)基BM+QG誘導(dǎo)力最低，培養(yǎng)9 d后，培養(yǎng)基BM+QG誘導(dǎo)力優(yōu)勢(shì)明顯，培養(yǎng)基BM+MS最低。

圖6 不同栽培基質(zhì)對(duì)香菇液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶活性的影響Fig.6 Effects of different cultivation substrates on laccase production activities of different L. edodes strains

培養(yǎng)過(guò)程中，菌株慶科R20在BM+MF培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶活性較其他培養(yǎng)基優(yōu)勢(shì)明顯，其次為BM+YMX培養(yǎng)基，其最高酶活性分別為265.07和237.15 U/L。BM+QG和BM+MS分別于培養(yǎng)第6天和第7天后方才檢測(cè)出微弱的漆酶活性，且整個(gè)培養(yǎng)期兩種培養(yǎng)基的最高酶活僅為35.82和41.75 U/L。

綜上可知，同一菌株在受到不同的栽培基質(zhì)誘導(dǎo)時(shí)，液體產(chǎn)漆酶活性有差異。4種栽培基質(zhì)中，除青杠木屑外，其他基質(zhì)均對(duì)馬桑香菇產(chǎn)漆酶有較強(qiáng)的誘導(dǎo)力，且基質(zhì)麥麩對(duì)誘導(dǎo)馬桑香菇產(chǎn)漆酶的時(shí)間最為集中且反應(yīng)迅速，但高水平誘導(dǎo)力更持久的是馬桑木屑，而基質(zhì)玉米芯對(duì)香菇808的產(chǎn)漆酶誘導(dǎo)力最強(qiáng)，麥麩對(duì)慶科R20產(chǎn)漆酶的誘導(dǎo)力麥麩最強(qiáng)。這表明，栽培基質(zhì)的差異能直接影響菌株漆酶的分泌情況，同雙因素方差檢驗(yàn)結(jié)果一致。

3 討論

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，主要存在于植物和真菌中，其中植物漆酶主要參與形成木質(zhì)素，而真菌漆酶的作用則是降解木質(zhì)素［10］，也是分解木質(zhì)素的三大酶類(lèi)中最具代表性的酶類(lèi)［11-12］。漆酶在食用菌生產(chǎn)中可以直接反映木質(zhì)素降減情況［13］，間接反映食用菌菌絲活力、產(chǎn)量和品質(zhì)［14-16］。本試驗(yàn)以貴州香菇主栽品種香菇808、慶科R20以及貴州特有馬桑香菇為研究對(duì)象，初步研究了香菇菌株間的區(qū)別性差異及不同栽培基質(zhì)誘導(dǎo)下3種香菇液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶活性連續(xù)12 d的變化。研究表明馬桑香菇、香菇808和慶科R20雖均同為香菇屬的下屬分支，但菌株間是有區(qū)別的，存在一定種源差異。此外，香菇液體產(chǎn)漆酶活性受菌株遺傳差異和不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的影響均為極顯著，但各處理漆酶整體變化規(guī)律均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。這說(shuō)明菌株和誘導(dǎo)物的差異僅對(duì)漆酶活性大小有影響，但不改變漆酶的變化規(guī)律。這一結(jié)果在諸多漆酶變化研究中均有體現(xiàn)［17-19］。

3種菌株在培養(yǎng)初期所有處理檢測(cè)到的酶活性均較低，慶科R20在兩種木屑誘導(dǎo)培養(yǎng)基上甚至無(wú)法檢測(cè)到漆酶活性，這除了同菌株間的遺傳差異有關(guān)外，很大因素可能是因?yàn)橄愎骄z在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收順序有一定選擇性造成的。一般來(lái)說(shuō)，香菇菌絲吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，會(huì)將淀粉、纖維素、半纖維素先降解吸收，最后才降解木質(zhì)素［3，20-21］。香菇808作為開(kāi)發(fā)較為成熟且全國(guó)栽種廣泛的香菇品種，在含馬桑木屑、青杠木屑及玉米芯的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中液體產(chǎn)漆酶能力均是最強(qiáng)，其中以玉米芯誘導(dǎo)力最強(qiáng)，且在含麥麩的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上產(chǎn)酶能力也僅低于慶科R20，這說(shuō)明香菇808對(duì)4種基質(zhì)木質(zhì)素都有較強(qiáng)的降解能力。慶科R20是低溫型香菇品種，在含麥麩、玉米芯的培養(yǎng)基上產(chǎn)漆酶能力明顯優(yōu)于兩種木屑培養(yǎng)基，其中基質(zhì)麥麩對(duì)其產(chǎn)漆酶誘導(dǎo)力最強(qiáng)。在以往香菇漆酶的研究中，明確指出漆酶參與香菇生長(zhǎng)發(fā)育的每一個(gè)階段，是香菇生長(zhǎng)關(guān)鍵酶，其活性越高，香菇轉(zhuǎn)色時(shí)間越早，出菇時(shí)間也越早，并且其活性與香菇產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)［3，14］。這表明香菇808、慶科R20在制種過(guò)程中用馬桑木屑或青杠木屑作原料時(shí)，香菇808應(yīng)比慶科R20長(zhǎng)勢(shì)更佳，但添加玉米芯或麥麩，都是能促進(jìn)兩種香菇菌絲對(duì)木質(zhì)素的降解吸收的。而馬桑香菇菌株是由生長(zhǎng)于馬桑樹(shù)上的貴州特有野生香菇選育而來(lái)的，其味道比一般香菇更鮮香，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也更為豐富［22-23］，但目前栽培上不管是椴木栽培還是袋料栽培，其主要原料均基于馬桑木材。本文所選4種基質(zhì)中，除青杠木屑外，其他基質(zhì)均對(duì)馬桑香菇產(chǎn)漆酶有較強(qiáng)的誘導(dǎo)力，且基質(zhì)麥麩對(duì)誘導(dǎo)馬桑香菇產(chǎn)漆酶的時(shí)間最為集中且反應(yīng)迅速，但高水平誘導(dǎo)力更持久的是馬桑木屑，這說(shuō)明，馬桑香菇對(duì)馬桑木屑具有一定的偏好性，栽培基質(zhì)中適當(dāng)添加可以提高菌絲體的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量，這與徐彥軍等的研究結(jié)果一致［24］。而基質(zhì)麥麩和玉米芯對(duì)馬桑香菇產(chǎn)漆酶的誘導(dǎo)力同馬桑木屑差距不大，理論上是可以適量增加這些基質(zhì)在配方中的占比，從而減少馬桑香菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展對(duì)馬桑木材帶來(lái)的用料壓力的，但具體用量比例需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

馬桑香菇、香菇808和慶科R20雖均同為香菇屬的下屬分支，但菌株間存在一定種源差異。此外，香菇液體產(chǎn)漆酶活性受菌株遺傳差異和不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基的影響均為極顯著。香菇808在含玉米芯、馬桑木屑及青杠木屑的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中液體產(chǎn)漆酶能力均為最強(qiáng)，最大酶活分別為464.06、238.64、288.94 U/L。而麥麩對(duì)慶科R20的誘導(dǎo)力更強(qiáng)，最大酶活達(dá)265.07 U/L；麥麩對(duì)誘導(dǎo)馬桑香菇產(chǎn)漆酶能力短時(shí)間內(nèi)最強(qiáng)，最大酶活達(dá)161.83 U/L，但高水平誘導(dǎo)力更持久的是馬桑木屑，最大酶活達(dá)108.61 U/L。綜上，從產(chǎn)漆酶水平上看，香菇808、慶科R20和馬桑香菇對(duì)4種基質(zhì)木質(zhì)素降解吸收能力差異較大，最佳基質(zhì)分別為玉米芯、麥麩和馬桑木屑。