閆艷華，曹慧慧，董李學(xué)，杜瑞煥 ，鄭百芹,李愛(ài)軍*

(1. 唐山市食品藥品綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河北 唐山 063000；2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 唐山 063000；3. 唐山市功能性農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 唐山 063000)

近年來(lái)，我國(guó)畜牧業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展，其所帶來(lái)的畜禽污染物(主要包含畜禽糞便、尿液和沖洗水)造成的環(huán)境問(wèn)題不容忽視。畜禽糞便中攜帶的病原微生物主要包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲等，其中致病微生物的種類及數(shù)量最為豐富，且對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的健康及其產(chǎn)品存在極大的威脅。隨著第2代高通量測(cè)序技術(shù)在微生態(tài)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，越來(lái)越多的領(lǐng)域通過(guò)該方法解決了以往難以解決的科學(xué)問(wèn)題[1]。李紅梅等[2]采用16S rDNA高通量測(cè)序方法揭示了四川省邛崍市金利豬場(chǎng)的空氣微生物群落結(jié)構(gòu)，假單胞菌屬、放線菌屬和鏈球菌屬是優(yōu)勢(shì)微生物。孫翠麗等[3]采用高通量測(cè)序方法檢測(cè)了位于內(nèi)蒙古不同城市的10個(gè)規(guī)模化羊場(chǎng)的空氣微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，指導(dǎo)羊場(chǎng)疾病防控。但是利用該技術(shù)研究奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境菌群的還鮮見(jiàn)報(bào)道。

原料乳中微生物來(lái)源廣、種類多，奶牛的飼養(yǎng)環(huán)境、榨乳間的衛(wèi)生條件、原料乳的運(yùn)輸過(guò)程等都可能對(duì)原料乳中微生物的種類和數(shù)量產(chǎn)生影響。原料乳中的微生物菌群組成和數(shù)量直接影響乳制品質(zhì)量與安全。劉洋等[4]、劉瀟憶等[5]、馬園等[6]通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)榨乳過(guò)程會(huì)在原料乳中產(chǎn)生多種微生物污染，奶牛的乳房、榨乳設(shè)備、環(huán)境衛(wèi)生狀況都會(huì)直接影響原料乳中的微生物數(shù)量和種類。

本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)中糞便、沖洗和養(yǎng)殖用水、榨乳設(shè)備、運(yùn)乳罐和牛乳房擦拭樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行研究，可對(duì)原料乳中可能出現(xiàn)的微生物種類進(jìn)行預(yù)判，對(duì)控制原料乳中微生物污染來(lái)源，有針對(duì)性地對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行消毒滅菌來(lái)保證奶牛的健康提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與動(dòng)物

本研究在唐山市郊規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)(存欄奶牛1 500余頭)進(jìn)行，奶牛品種為荷斯坦奶牛。

1.1.2 牛體(C1)采樣

隨機(jī)選取3頭榨乳間奶牛，在每頭牛靠近乳房處選擇2處約9 cm2面積，用無(wú)菌脫脂棉球蘸取0.9%生理鹽水各涂抹3次，檢樣編號(hào)標(biāo)記為C1.1～C1.6(C1代表牛體)，涂抹后的棉拭子迅速放入已滅菌的10 mL生理鹽水試管中，投入液氮罐保存?zhèn)錂z。

1.1.3 榨乳設(shè)備(E)樣本采集

根據(jù)榨乳設(shè)備位置分布，選取能覆蓋全場(chǎng)的6個(gè)設(shè)備將無(wú)菌脫脂棉球用0.9%無(wú)菌生理鹽水沾濕，在設(shè)備檢驗(yàn)表面涂抹，1個(gè)檢樣用3個(gè)無(wú)菌脫脂棉球涂抹，涂抹完后立即放入裝有10 mL生理鹽水的試管中并依次編號(hào)為E1～E6，投入液氮罐保存?zhèn)錂z。

1.1.4 牛糞便(F)樣本采集

選取養(yǎng)殖場(chǎng)中南北方向長(zhǎng)條形運(yùn)動(dòng)場(chǎng)的6個(gè)采樣點(diǎn)：南1、東2、東3、西4、西5、北6。每個(gè)點(diǎn)選中后撥開(kāi)表層，采集無(wú)尿液等雜質(zhì)的糞便1 g左右，用無(wú)菌鑰匙放入無(wú)菌試管中并依次編號(hào)為F1～F6，投入液氮罐保存?zhèn)錂z。

1.1.5 養(yǎng)牛場(chǎng)水體(W)樣本采集

選擇清洗用水(W1～W3)、養(yǎng)殖用水(W4～W6)進(jìn)行采樣，每個(gè)樣品采集>10 L水過(guò)濾后將濾膜(濾膜剪下或拆下)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中保存?zhèn)錂z。

1.1.6 運(yùn)乳罐(E2)樣本采集

對(duì)運(yùn)乳罐的內(nèi)壁和出奶罐口用無(wú)菌脫脂棉球(0.9%無(wú)菌生理鹽水沾濕)進(jìn)行涂抹取樣，涂抹完后立即放入裝有10 mL生理鹽水的試管中并標(biāo)記編號(hào)為E2.1～E2.6，投入液氮罐保存?zhèn)錂z。

1.2 基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

根據(jù)細(xì)菌DNA抽提試劑盒(E.Z.N.A. Stool DNA Kit，Omega)說(shuō)明書進(jìn)行各樣本的細(xì)菌總DNA提取，以提取的DNA作為PCR模板，擴(kuò)增16S rRNA基因的V3～V4高變區(qū)。PCR反應(yīng)的正反向引物分別為341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-TAATCTWTGGGVHCATCAGG-3′)，純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，通過(guò)HiSeq2500平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(華大基因公司進(jìn)行)。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析處理

對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初次質(zhì)控，將2條序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)的末端重疊區(qū)進(jìn)行拼接，拼接時(shí)要求去除含有N的序列、引物和接頭序列，得到原始標(biāo)簽序列(Tags)數(shù)據(jù) (Raw Tags)[7-8]，然后使用FLASH軟件對(duì)原始Tags進(jìn)行截取、過(guò)濾和去嵌合體序列等處理，得到最終的高變區(qū)有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)[9]。利用UPARSE 軟件對(duì)全部樣品的有效Tags進(jìn)行聚類，按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)聚類成為分類單位(operational taxonomic units，OTUs)[10]，在聚類過(guò)程中利用UCHIME (v4.2.40)軟件將PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的嵌合體從得到的OTUs代表序列去除[9]。采用RDP Classifier 貝葉斯算法[11]對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在門、綱、目、科、屬階元水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成及物種的豐度分布情況。利用QIIME(v1.80)軟件計(jì)算樣品的Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)的Alpha多樣性值[12]，使用R語(yǔ)言工具繪制稀釋型曲線、Venn圖，得到樣品內(nèi)物種豐富度和多樣性信息及其共有和特有OTUs信息等。根據(jù)Beta多樣性距離對(duì)樣品細(xì)菌群落進(jìn)行聚類分析，使用Weighted UniFrac距離矩陣做UPGMA聚類分析，構(gòu)建樹(shù)狀結(jié)構(gòu)，用于樣品的物種組成及差異的直觀分析。用PCoA主坐標(biāo)分析法研究樣本群落組成的相似性或差異性[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測(cè)序結(jié)果及取樣深度驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)的糞便、沖洗和飲用水、牛體與采奶、貯奶設(shè)備中細(xì)菌基因組16Sr RNA(V3～V4區(qū))進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得了其微生物群落結(jié)構(gòu)的組成。每個(gè)樣品的序列信息如表1所示，共讀取到原始序列條數(shù)為1 640 803條，拼接后得到1 633 370條Tags，拼接率為99.55%，Tag平均長(zhǎng)度為(414±6)bp(去接頭)，測(cè)序深度均超過(guò)99.4%，拼接的Tags經(jīng)過(guò)優(yōu)化得到1 599 416條，根據(jù)barcode和引物區(qū)分樣本，在對(duì)初始序列進(jìn)行去冗余處理后，在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTUs，統(tǒng)計(jì)得到各個(gè)樣品在不同OTUs中的豐度信息，30個(gè)樣品共產(chǎn)生26 337個(gè)OTUs。其中奶牛乳房擦拭樣品(C1)、榨乳設(shè)備(E)和奶牛糞便(F)樣品中的OTUs數(shù)目普遍高于養(yǎng)殖用水和運(yùn)乳罐樣品，說(shuō)明C1、E、F樣品微生物多樣性較高。生乳運(yùn)輸罐(E2)樣品的OTUs數(shù)目和微生物多樣性最低。

30個(gè)樣品的稀釋曲線如圖1所示，所有曲線已趨于平緩，即再增大數(shù)據(jù)量對(duì)OTUs的發(fā)現(xiàn)也沒(méi)有影響，可以說(shuō)樣本的OTUs覆蓋度已基本飽和，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，更大的測(cè)序量不會(huì)引起物種多樣性的顯著增長(zhǎng)，基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)量的分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表1 樣本的序列信息

圖1 各樣本的稀釋性曲線

2.2 奶牛場(chǎng)不同采樣點(diǎn)細(xì)菌群落之間的差異性和多樣性

2.2.1 樣品OTUs聚類分析

從圖2可以看出，5種樣本共有的OTUs為585個(gè)，占各樣品OTUs總數(shù)的7.7%～27.7%，數(shù)據(jù)顯示C1、E、F樣本微生物群落豐富且重疊性較大，分析原因可能是與奶牛受糞尿等污物的污染且不能及時(shí)清理有關(guān)，造成奶牛臥床時(shí)乳房與地面、污物的接觸機(jī)會(huì)增多導(dǎo)致牛體自身微生物增多，榨乳時(shí)乳房未徹底清潔即接觸采奶設(shè)備導(dǎo)致的交叉污染。另外每種樣本特有的OTUs分別為178、233、44、319和139個(gè)，表明不同樣本的細(xì)菌組成存在一定差異。

圖2 5種樣本的細(xì)菌OTUs維恩分析

2.2.2 Alpha多樣性分析

不同樣本的Alpha多樣性指數(shù)如表2所示，C1、E、F樣本Chao指數(shù)分別達(dá)到1 510、1 489和1 116，明顯大于W、E2樣本，表明牛體、糞污和采奶設(shè)備微生物群落的總體豐富度較高。由表2綜合分析可知，E和F的 Shannon指數(shù)明顯高于其他組樣本，說(shuō)明采奶設(shè)備和糞污的細(xì)菌群落具有較高的多樣性，其次為C1，運(yùn)乳罐E2的物種多樣性最差。

表2 樣本中Alpha多樣性指數(shù)

2.2.3 細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異分析

由圖3聚類樹(shù)分析可見(jiàn)，所采集樣本的微生物群落根據(jù)進(jìn)化關(guān)系聚類為兩大分支：樣本E、F、C1聚類構(gòu)成一個(gè)大支，群落相似性較高，另外此大支內(nèi)包含1個(gè)W和2個(gè)E2樣品，推測(cè)可能是相鄰空間微生物氣溶膠擴(kuò)散導(dǎo)致；樣本E2與W中細(xì)菌群落相似度較高構(gòu)成另一大支。

圖3 樣本物種相似度聚類樹(shù)

2.3 樣品細(xì)菌群落的組成與豐度分析

基于OTUs的物種分類分析，在相似性為0.97水平上，30個(gè)樣本中的細(xì)菌種類共注釋到35個(gè)門，79個(gè)綱，119個(gè)科，127個(gè)目，436個(gè)屬，210個(gè)種。由圖4可見(jiàn)，在門水平上，豐度最高的包括變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、螺旋菌門、軟壁菌門和梭桿菌門。其中，變形菌門在所有樣本細(xì)菌類群中所占比例極高，尤其是養(yǎng)殖用水(W)樣本中變形菌門占比81.8%；牛體乳房擦拭樣品(C1)中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群與采奶設(shè)備(E)和糞便(F)樣本相似，豐度最高的細(xì)菌均是厚壁菌門，但所占比例不同，分別占各樣本細(xì)菌總量的32.4%、44.7%和53.4%；運(yùn)乳罐(E2)所采樣本中豐度最高的細(xì)菌是放線菌門，占比56.4%。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)(圖5)，30個(gè)樣本中在屬水平上已注釋到的物種豐度前10位分別為不動(dòng)桿菌屬、節(jié)桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、巨球菌屬、棒狀桿菌屬、諾爾氏菌屬、普雷沃菌屬、嗜冷菌屬、瘤胃桿菌屬、梭菌屬。在C1和E樣本中菌群組成最為相似，占比例較高的均為變形菌門的不動(dòng)桿菌屬和放線菌門的節(jié)桿菌屬，檢測(cè)出的棒狀桿菌屬和嗜冷菌屬也主要存在于C1和E樣本中，推測(cè)是牛乳房與榨乳設(shè)備接觸后不能及時(shí)清洗和消毒造成交叉?zhèn)鞑?；F樣本細(xì)菌類群的優(yōu)勢(shì)菌屬為擬桿菌門的普雷沃菌屬和厚壁菌門的梭菌屬； 養(yǎng)殖用水(W)樣本與其他樣本相比，在屬分類階元細(xì)菌多樣性較低，不動(dòng)桿菌屬占有極大比例；而運(yùn)乳罐(E2)的優(yōu)勢(shì)菌屬則為具有有機(jī)污染物降解作用的考克氏菌屬。

圖4 樣本中細(xì)菌在門分類水平的比較

圖5 樣本中細(xì)菌在屬分類水平的豐度

3 討論

規(guī)?；B(yǎng)殖是目前奶牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要方式之一，而養(yǎng)殖環(huán)境的好壞直接影響奶牛的健康和原料乳的品質(zhì)。外界環(huán)境因素會(huì)因應(yīng)激引起牛體免疫力下降、內(nèi)環(huán)境改變，從而導(dǎo)致機(jī)體感染病原微生物或其他致炎因子，影響奶牛的健康和生產(chǎn)能力，甚至還會(huì)導(dǎo)致傳染病的流行。目前有關(guān)奶牛腸道微生物研究較多[14]，而針對(duì)牛場(chǎng)環(huán)境和牛乳接觸設(shè)備及牛體自身細(xì)菌類群多樣性和關(guān)聯(lián)性的研究卻鮮有報(bào)道。本文基于16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定了唐山地區(qū)規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)糞污以及榨乳設(shè)備等的微生物群落結(jié)構(gòu)特征，分析了它們的微生物組成、多樣性以及差異信息，所采集的30個(gè)樣品共注釋到35個(gè)門，79個(gè)綱，119個(gè)科，127個(gè)目，436個(gè)屬，210個(gè)種，表明唐山地區(qū)規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的糞污及牛乳設(shè)備細(xì)菌種群豐富且多樣，是潛在的病原菌傳播源。

在所有樣本中檢出的微生物大部分物種是一致的。這說(shuō)明一些微生物能夠在同一環(huán)境下競(jìng)爭(zhēng)后成為此環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌種，并且保持一定的繁殖和代謝能力，成為影響奶牛養(yǎng)殖環(huán)境的關(guān)鍵微生物。分析發(fā)現(xiàn)變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、螺旋菌門、軟壁菌門和梭桿菌門是牛體、牛場(chǎng)糞便、污水、榨乳設(shè)備和貯奶設(shè)備樣品中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門，這與相關(guān)研究結(jié)果[15-17]基本一致。變形菌門是養(yǎng)殖用水(W)樣本中的優(yōu)勢(shì)類群，厚壁菌門是E、F的優(yōu)勢(shì)菌門，放線菌門則是E2樣本的優(yōu)勢(shì)菌門。不同取樣點(diǎn)的物種多樣性存在差異，可能與各空間環(huán)境衛(wèi)生狀況、牛體是否及時(shí)清潔擦拭、榨乳設(shè)備消毒狀況和氣溶膠污染傳播等因素有關(guān)。但值得注意的是以上優(yōu)勢(shì)菌在牛乳房擦拭樣品(C1)中均有大量存在，這表明養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境因素及榨乳、運(yùn)乳等設(shè)備所含細(xì)菌都可能通過(guò)接觸或氣溶膠形式感染奶牛，進(jìn)而影響原料乳品質(zhì)。Okuda等[18]和Saito等[19]研究發(fā)現(xiàn)，梭桿菌門在結(jié)腸癌細(xì)胞中生長(zhǎng)較為旺盛，并且與結(jié)腸炎發(fā)病有關(guān)；Swidsinski 等[20]的研究認(rèn)為，梭桿菌門中的各種梭菌都與急性闌尾炎有關(guān)。曾學(xué)琴等[21]研究發(fā)現(xiàn)，奶牛乳房炎的發(fā)生與梭桿菌門細(xì)菌密切相關(guān)。

本試驗(yàn)對(duì)30個(gè)樣本的菌群豐度進(jìn)行檢測(cè)，奶牛乳房附近及采奶設(shè)備樣本中亦鑒定出豐度較高的鞘氨醇桿菌屬、巨球菌屬、嗜冷菌屬，通過(guò)榨乳過(guò)程進(jìn)入生乳中，分解乳品蛋白和脂肪，降低乳品品質(zhì)。鞘氨醇桿菌屬、棒狀桿菌屬、普雷沃菌屬、梭菌屬等均屬于機(jī)會(huì)致病菌。隨著畜牧業(yè)的迅猛發(fā)展，疫病更加復(fù)雜化，原來(lái)不被重視的條件致病菌引起的損失也越來(lái)越大[22]。值得注意的是，巨球菌屬是牛體樣本中豐度較高的菌屬，其在自然環(huán)境中廣泛存在，通常不會(huì)引起人類或動(dòng)物疾病。然而，據(jù)報(bào)道1株高致病多重耐藥的超級(jí)細(xì)菌——巨球菌在商品肉雞中暴發(fā)，死亡率高達(dá)25%，主要引起顱腔內(nèi)干酪樣滲出、腦炎、腦壞死、以及其他器官的出血和炎癥[23]。 結(jié)果分析中養(yǎng)殖環(huán)境尤其是牛乳房周圍和糞便中豐度最高的為不動(dòng)桿菌屬。來(lái)自環(huán)境的不動(dòng)桿菌聚集在奶牛潮濕的乳房周圍，造成乳房感染引發(fā)奶牛乳房炎。不動(dòng)桿菌屬包含的細(xì)菌多為條件致病菌，這些條件致病菌將對(duì)人和動(dòng)物的健康及環(huán)境造成嚴(yán)重威脅[24]。近年來(lái)，作為條件致病菌的不動(dòng)桿菌已經(jīng)變成重要的感染致病菌之一，可引起肺部、腸胃等多個(gè)系統(tǒng)的感染，尤其是感染感染免疫功能低下、小兒、手術(shù)后及患有其他基礎(chǔ)疾病的患者[25]，是人類公共衛(wèi)生安全的潛在風(fēng)險(xiǎn)源。通過(guò)牛的運(yùn)動(dòng)或空氣流動(dòng)，這些條件致病菌可在動(dòng)物機(jī)體、養(yǎng)殖場(chǎng)糞污和環(huán)境設(shè)備間交叉轉(zhuǎn)移[26-27]，甚至是這些細(xì)菌攜帶的耐藥基因也會(huì)隨之傳播[28]。由此可見(jiàn)，如果養(yǎng)殖場(chǎng)糞污不經(jīng)科學(xué)有效處理就排放到環(huán)境中，將會(huì)增加細(xì)菌性傳染病的發(fā)生概率，從而威脅人與動(dòng)物的健康[29]。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)HiSeq2500高通量測(cè)序技術(shù)分析了奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)部分環(huán)境因素及奶牛乳房處的細(xì)菌多樣性與差異性，30個(gè)樣品均有相對(duì)較高的細(xì)菌多樣性，并發(fā)現(xiàn)榨乳罩杯涂抹樣本與奶牛乳房處樣本微生物相似性最高，不動(dòng)桿菌屬、節(jié)桿菌屬和嗜冷菌屬是2種樣本的優(yōu)勢(shì)菌群，表明榨乳設(shè)備受到了環(huán)境污染或者是接觸牛乳房導(dǎo)致交叉?zhèn)鞑?。因此控制微生物污染必須?yán)格執(zhí)行養(yǎng)殖場(chǎng)衛(wèi)生管理規(guī)范。此外，具體污染來(lái)源還需進(jìn)一步擴(kuò)大采樣點(diǎn)范圍進(jìn)行深入研究。