王仁杰 賀 宇 張云常 雷 燕 呂繼蓉 王曉龍 武振龍*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京100193；2.成都大帝漢克生物科技有限公司，成都611130；3.河南銀發(fā)牧業(yè)有限公司，鄭州451100)

我國是世界第一豬肉生產(chǎn)國和消費國，但我國養(yǎng)豬業(yè)整體水平明顯低于歐美等養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)國家[1]。以每頭母豬每年提供的斷奶仔豬數(shù)(PSY)為例，歐美國家在2012年已達(dá)到25頭，丹麥甚至達(dá)到了30頭，而我國規(guī)模化養(yǎng)豬場在2018年才達(dá)到24頭[2]。因此，通過品種改良、營養(yǎng)調(diào)控和加強飼養(yǎng)管理等手段提高母豬的繁殖性能及其子代健康水平就顯得尤為重要。

動物的胃腸道中棲息著大量的微生物，它們對宿主的養(yǎng)分利用和生理代謝都有重要的調(diào)節(jié)作用[3-4]。同時，腸道微生物會受到宿主遺傳背景、生理狀態(tài)、營養(yǎng)、疾病、藥物的使用和生活環(huán)境等諸多因素的影響[4]。腸道微生物與母豬的繁殖性能密切相關(guān)，Shao等[5]研究了母豬的繁殖性能與腸道微生物的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，與低產(chǎn)仔數(shù)(窩仔數(shù)≤7頭)母豬相比，高產(chǎn)仔數(shù)(窩仔數(shù)≥15頭)母豬在妊娠后期腸道微生物多樣性較低，普雷沃氏菌屬相對豐度較高，瘤胃球菌屬相對豐度較低，但在泌乳早期腸道微生物的多樣性較高，瘤胃球菌屬相對豐度增加。除影響繁殖性能外，母豬腸道微生物還會影響仔豬的生長發(fā)育和健康。Cao等[6]研究表明，在母豬妊娠后期和泌乳期飼糧中添加0.2%的丁酸梭菌，妊娠后期母豬腸道中擬桿菌門相對豐度升高，變形菌門的相對豐度下降，且提高了泌乳期母豬及仔豬的抗氧化水平及仔豬的生長性能。Li等[7]研究了母豬飼糧中纖維成分對妊娠母豬及其仔豬的影響，發(fā)現(xiàn)飼糧中不可溶解纖維與可溶解纖維的比例下降，母豬妊娠后期腸道中軟壁菌門的相對豐度增加，變形菌門的相對豐度減少，母豬及其仔豬抗氧化水平和抗炎能力提高。母豬的腸道微生物是如何影響仔豬生長發(fā)育的尚不清楚，李浩等[8]推測這可能是由于妊娠期和泌乳期母體腸道微生物通過胎盤、產(chǎn)道和乳汁進(jìn)入子代腸道定植，從而直接或間接影響子代生長發(fā)育。這些研究提示，妊娠期與泌乳期母豬的腸道微生物可能是影響母豬繁殖性能及仔豬生長發(fā)育的重要因素。因此，深入了解妊娠期與泌乳期母豬腸道微生物的組成及變化情況，有利于通過優(yōu)化腸道微生物組成提高母豬繁殖性能。

Koren等[9]的臨床研究表明，從妊娠前期至妊娠后期，婦女腸道微生物的多樣性下降，變形菌門和放線菌門的相對豐度升高，而且這種現(xiàn)象會持續(xù)到分娩后1個月。Kong等[10]在環(huán)江香豬上的研究發(fā)現(xiàn)，從妊娠前期至妊娠后期，母豬腸道微生物多樣性明顯下降，但變形菌門和放線菌門的相對豐度隨著妊娠的進(jìn)程而降低。Cheng等[11]發(fā)現(xiàn)，從妊娠后期到泌乳前期，長白母豬腸道微生物多樣性下降，變形菌門和梭桿菌門的相對豐度增加，產(chǎn)丁酸菌屬的相對豐度下降。然而，Ji等[12]研究表明，從妊娠前期至泌乳期，二元(大白×長白)母豬腸道微生物多樣性上升，擬桿菌門、脫硫弧菌屬和普雷沃氏菌屬的數(shù)量先增加后降低。造成這些研究結(jié)果并不一致的確切原因并不清楚，可能與研究對象選取、遺傳背景、妊娠或泌乳階段生理狀況的差異及腸道微生物的動態(tài)變化等因素有關(guān)。本試驗以大白母豬為研究對象，通過高通量測序技術(shù)，研究妊娠后期和泌乳期母豬腸道微生物的多樣性及變化規(guī)律，為通過調(diào)控腸道微生物改善母豬繁殖性能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

選取6頭健康、背膘厚與分娩日期相近的第2胎次大白母豬。試驗于妊娠期第90天開始，至產(chǎn)后第25天結(jié)束。妊娠期第90～107天飼喂妊娠期飼糧，妊娠期第108天至產(chǎn)后第25天飼喂泌乳期飼糧，飼糧參照NRC(2012)豬營養(yǎng)需要量配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 母豬妊娠期和泌乳期飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))

飼養(yǎng)試驗在河南銀發(fā)牧業(yè)眾品養(yǎng)豬場進(jìn)行。母豬妊娠期第90～107天，每天分別在06:00和14:00投料，每天飼喂2.8 kg妊娠期飼糧。預(yù)產(chǎn)期前1周將母豬轉(zhuǎn)入徹底消毒的產(chǎn)仔舍，更換泌乳期飼糧，分娩前每天飼喂2.8 kg。舍內(nèi)保持清潔干燥，通風(fēng)良好，舍內(nèi)溫度保持在25 ℃左右，全程自由飲水。臨產(chǎn)前用0.1%的高錳酸鉀水溶液將其外陰和乳房清洗消毒。分娩當(dāng)天不喂料，分娩后第2天飼喂2.0 kg，以后每天增加0.5 kg，至產(chǎn)后第7天讓母豬自由采食。自由采食階段每天分別在06:00、12:00和18:00投料，自由采食時期保持食槽內(nèi)飼糧略有剩余。

1.2 樣品采集

每頭母豬分別于妊娠期第93天(G93)和第100天(G100)以及泌乳期第14天(L14)及第21天(L21)采集新鮮未被污染的直腸糞樣，-20 ℃凍存，然后轉(zhuǎn)到-80 ℃凍存?zhèn)溆?，用于微生物區(qū)系的分析。

1.3 微生物DNA提取、測序及數(shù)據(jù)分析

母豬直腸糞樣微生物DNA使用糞便DNA提取試劑盒(QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit)進(jìn)行提取。使用引物341F(5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACVVGGGTATCTAATC-3′)，擴(kuò)增細(xì)菌核糖體RNA基因的V3～V4區(qū)，得到500 bp左右的擴(kuò)增片段。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，執(zhí)行30個循環(huán)；最后72 ℃維持5 min。PCR反應(yīng)體系為：2×KAPA Library Amplification ReadyMix 15 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA為50 ng，加雙蒸水(ddH2O)補齊30 μL。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，再使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences，美國)切膠回收。用擴(kuò)增片段構(gòu)建文庫，文庫質(zhì)檢合格后，采用HiSeq平臺PE250策略(Illumina，美國)進(jìn)行測序。測序服務(wù)由上海銳翌生物科技有限公司完成。使用UPARSE根據(jù)97%相似度進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類，并使用Userach鑒定和移除嵌合體序列。每個OTU都有1個代表性的序列，使用RDP數(shù)據(jù)庫，置信度閾值設(shè)置為0.8，利用RDP Classifer將每個代表性序列進(jìn)行物種注釋。OTU profiling table以及alpha和beta多樣性分析通過Qiime的python腳本實現(xiàn)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

首先檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布再進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較使用Tukey法檢驗。對于alpha多樣性和微生物的相對豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行非參數(shù)檢驗中的Kruskal-Wallis檢驗。數(shù)據(jù)分析使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 測序質(zhì)量及OTU分析

6頭母豬在4個時間點共采集了24份直腸糞樣，通過Illumina Hiseq平臺進(jìn)行Paired-End測序，得到平均長度為416 bp左右的有效序列875 732條，平均每個樣品有效序列36 488.83條。Observed species指數(shù)的稀釋曲線在測到15 000條序列時已基本達(dá)到平臺期(圖1-A)，Goods coverage指數(shù)的稀釋曲線已經(jīng)到平臺期(圖1-B)，說明測序深度足夠，可以反映樣品中絕大多數(shù)微生物的信息。利用UPARSE根據(jù)97%相似度進(jìn)行OTU聚類，并使用Userach鑒定和移除嵌合體序列得到1 298個OTU，分別有1 181和429個OTU可以注釋到門和屬水平。由表2可知，4個時間點所測得的有效序列數(shù)差異不顯著(P>0.05)。妊娠后期(G93和G100)的OTU數(shù)顯著高于泌乳期(L14和L21)的OTU數(shù)(P<0.05)，但G93和G100、L14和L21之間的OTU數(shù)無顯著差異(P>0.05)。

2.2 alpha多樣性分析

由表2可知Chao1、Observed species、Shannon和Simpson指數(shù)在G93、G100和L14時無顯著差異(P>0.05)；Chao1、Observed species、Shannon和Simpson指數(shù)在L14和L21時也無顯著差異(P>0.05)；但與G100時相比，Chao1、Observed species、Shannon指數(shù)在L21時顯著下降(P<0.05)。就Shannon指數(shù)而言，L21時顯著低于G93和G100時(P<0.05)，L21時與L14時無顯著差異(P>0.05)。與G93時相比，L21時Simpson指數(shù)顯著降低(P<0.05)。由上述結(jié)果可知，與妊娠后期(G93和G100)相比，泌乳期(L14和L21)的alpha多樣性減小。

圖1 Observed species指數(shù)(A)和Goods coverage指數(shù)(B)的稀釋曲線

表2 母豬糞便微生物alpha多樣性分析

2.3 beta多樣性分析

主坐標(biāo)分析結(jié)果見圖2。通過圖中的樣品點的距離來判斷個體或群體間的差異，樣品點距離越遠(yuǎn)說明樣品間微生物群落組成差異越大，距離越近說明樣品間微生物群落組成越相似。G93和G100時的微生物群落組成相似，L14和L21時的微生物群落組成相似，但妊娠后期(G93和G100)和泌乳期(L14和L21)的微生物群落組成差異較大。

圖2 母豬糞便微生物的主坐標(biāo)分析圖

2.4 共有OTU分析

Venn圖可以反映樣本組間共有和特有的OTU數(shù)，從而直觀地反映樣本組間微生物群落的相似程度。從圖3可知，4個時間點的直腸糞樣中共有微生物OTU 809個，占微生物OTU總數(shù)的62.33%，809個共有OTU分別注釋到13個門和69個屬。而G93、G100、L14和L21還各有30、52、17和16個特有的OTU。G93和G100間共有OTU 1 040個，G100和L14間共有OTU 967個，L14和L21間共有OTU 873個。

圖3 母豬糞便微生物Venn圖

2.5 腸道微生物的組成及相對豐度

如圖4所示，各個時間點的直腸糞樣微生物可以注釋到18個菌門，排名前10的菌門見表3，其中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(相對豐度為45.72%～52.55%)、擬桿菌門(相對豐度為36.80%～39.19%)和螺旋菌門(相對豐度為5.04%～11.70%)，以上3個菌門的菌數(shù)占各時間點總菌數(shù)的93.20%以上。廣古菌門的相對豐度在G93、G100和L14時差異不顯著(P>0.05)，但G93時的相對豐度顯著高于L21時(P<0.05)。其余菌門在各時間點的相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

相對豐度排名前10的菌屬見表4。普雷沃氏菌屬、乳酸菌屬和密螺旋體屬是母豬直腸糞樣中相對豐度較高的菌屬，在各時間點分別占菌群總數(shù)的11.37%～17.39%、1.64%～22.21%和4.06%～10.75%。乳酸菌屬的相對豐度在L21時顯著高于G93時(P<0.05)。梭狀芽胞桿菌屬ⅩⅣa的相對豐度在G93時顯著高于L14和L21時(P<0.05)，但在G100、L14和L21之間無顯著差異(P>0.05)。其余菌屬在各時間點的相對豐度無顯著差異(P>0.05)。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Spirochaetes：螺旋菌門；Proteobacteria：變形菌門；Euryarchaeota：廣古菌門；Actinobacteria：放線菌門；Fibrobacteres：纖維桿菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Elusimicrobia：迷蹤菌門；Synergistetes：互養(yǎng)菌門；Lentisphaerae：黏膠球形菌門；Deferribacteres：脫鐵桿菌門；Fusobacteria：梭桿菌門；Cyanobacteria/Chloroplast：藍(lán)細(xì)菌門/葉綠體；Planctomycetes：浮霉菌門；Deinococcus-Thermus：異常球菌-棲熱菌門；Other:其他。

3 討 論

Illumina高通量測序技術(shù)是研究微生物群落的穩(wěn)定性、多樣性以及微生物與宿主之間相互關(guān)系的常用技術(shù)手段[9,13-14]。本試驗通過高通量測序技術(shù)，總共得到有效序列875 732條，平均每個樣品有效序列36 488.83條，測序深度均大于99.39%，說明測序結(jié)果對母豬糞便樣品中的微生物覆蓋率高，可滿足微生物多樣性的分析需求。關(guān)于微生物多樣性，本研究中，從妊娠后期到泌乳期大白母豬直腸糞樣微生物alpha多樣性下降。Leblois等[15]分析了妊娠期第106天和產(chǎn)后第15天的長白母豬糞便微生物后發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)后母豬糞便微生物的alpha多樣性降低，本試驗結(jié)果與其一致。Liu等[16]的研究也發(fā)現(xiàn)從妊娠期到泌乳期長白母豬糞便微生物的alpha多樣性有下降趨勢，但在相同條件下，榮昌母豬的糞便微生物alpha多樣性卻不受妊娠期和泌乳期的影響。由于腸道微生物會受到宿主遺傳背景和生理狀態(tài)等諸多因素的影響[4]，所以上述研究中母豬微生物alpha多樣性變化不一致，可能是母豬遺傳背景不同所致。

表3 母豬糞便微生物中排名前10的菌門的相對豐度

表4 母豬糞便微生物中排名前10的菌屬的相對豐度

豬腸道微生物不僅影響著營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收與代謝，還影響著宿主的生理狀態(tài)及疾病的發(fā)生和發(fā)展[17]。盡管腸道中微生物數(shù)量和種類繁多，但有研究表明仔豬、生長豬、育肥豬及母豬的腸道微生物中厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門[13-14,18-20]。本試驗中，妊娠后期及泌乳期母豬腸道微生物中的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門和擬桿菌門，與前人的研究結(jié)果一致。厚壁菌門和擬桿菌門參與碳水化合物的降解與發(fā)酵，在大腸中發(fā)酵的產(chǎn)物為短鏈脂肪酸[21]。有研究表明，短鏈脂肪酸可為機(jī)體提供10%～15%的能量[17]，說明厚壁菌門和擬桿菌門在宿主能量代謝中發(fā)揮著重要作用。本試驗中，從妊娠后期到泌乳期，大白母豬腸道微生物中廣古菌門的相對豐度降低，這與Leblois等[15]的研究結(jié)果相似，但廣古菌門的相對豐度與母豬生理階段的關(guān)系還有待研究。姬玉嬌等[22]研究表明，與飼喂低營養(yǎng)水平飼糧(消化能=12.24 MJ/kg，粗蛋白質(zhì)含量=9.77%)相比，飼喂高營養(yǎng)水平飼糧(消化能=14.73 MJ/kg，粗蛋白質(zhì)含量=13.11%)會減少豬腸道中廣古菌門的相對豐度。本試驗中，大白母豬腸道微生物中廣古菌門的相對豐度在泌乳期低于妊娠后期，這可能是由于泌乳期飼糧營養(yǎng)水平高于妊娠期飼糧所致。這提示我們，飼糧在腸道微生物組成變化中可能發(fā)揮著重要作用。

Huang等[23]發(fā)現(xiàn)妊娠期及泌乳早期母豬腸道優(yōu)勢菌屬為乳酸菌屬和普雷沃氏菌屬，Ji等[12]發(fā)現(xiàn)妊娠期及泌乳期母豬腸道的優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬。本試驗中，妊娠后期和泌乳期的母豬腸道優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬和乳酸菌屬，與前人的研究一致。普雷沃氏菌屬細(xì)菌可以降解纖維類多糖，如纖維素和木質(zhì)素，發(fā)酵產(chǎn)生乙酸和丙酸[24]，乙酸和丙酸可被轉(zhuǎn)運至肝臟分別參與脂肪和葡萄糖的合成[25]。前人的研究表明從妊娠期到泌乳期母豬腸道中乳酸菌屬的相對豐度增加[15,23]，本試驗中從妊娠期第93天到泌乳期第21天，乳酸菌屬的相對豐度顯著提升，與前人結(jié)果相同。乳酸菌屬細(xì)菌可以提高母豬健康水平和繁殖性能[26]，還可以提高仔豬健康水平和生長性能，抑制病原菌和降低腹瀉率[27-28]。這提示泌乳期乳酸菌屬的相對豐度提高有利于提高母豬及其仔豬的健康水平和生產(chǎn)性能。在妊娠后期母體會經(jīng)歷免疫和代謝狀態(tài)的變化[29]，而且這種變化還可能引起腸道菌群失衡。梭狀芽孢桿菌屬ⅩⅣa屬于條件性致病菌[30]，本試驗發(fā)現(xiàn)泌乳期母豬直腸糞樣中梭狀芽孢桿菌屬ⅩⅣa的相對豐度從妊娠后期到泌乳期呈下降趨勢，這種變化有利于母豬恢復(fù)健康進(jìn)入下一個繁殖周期。

綜上所述，從妊娠后期到泌乳期母豬腸道微生物多樣性下降，梭狀芽孢桿菌屬ⅩⅣa的相對豐度下降，乳酸菌屬的相對豐度增加，但優(yōu)勢菌群相對穩(wěn)定，這種變化可能有利于母豬及其子代健康。

4 結(jié) 論

① 與妊娠后期相比，泌乳期母豬腸道微生物多樣性下降。

② 妊娠后期與泌乳期母豬的腸道優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、擬桿菌門和螺旋菌門，其組成相對穩(wěn)定；優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬、乳酸菌屬和密螺旋菌屬。