石璐璐 王哲奇 徐元慶 毛晨羽 郭世偉 金 曉 史彬林

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，呼和浩特010018)

環(huán)境溫度是影響畜禽生產(chǎn)的重要外部因素。低溫是一種常見的應激源，能增加動物的應激水平，動物為維持體溫恒定，機體會通過改變行為、生理、代謝、內(nèi)分泌等一系列反應增加產(chǎn)熱，從而對畜體的正常生理活動和生產(chǎn)性能產(chǎn)生影響。動物長期處于寒冷刺激下的應激反應會破壞機體的生理平衡，導致其生產(chǎn)性能下降、免疫和抗氧化功能受損、抗病力降低、死亡率升高[1-4]。這嚴重制約了高寒地區(qū)動物生產(chǎn)力的發(fā)展，降低了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益。研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦奶牛在冬季慢性寒冷應激(-20～-4 ℃)條件下CD3+T淋巴細胞和CD21+B淋巴細胞比例下降，奶牛的特異性免疫功能受到抑制[3]。Thompson等[5]研究指出，將弗里斯蘭綿羊在1 ℃條件下冷暴露48 h后，其泌乳量顯著降低。彭孝坤等[6]研究表明，綿羊在舍外冷暴露(-23.8～-16.5 ℃)12 h后，血清白細胞介素(IL)-4和免疫球蛋白(Ig)G含量顯著下降，表明在急性冷應激條件下綿羊的免疫功能受損。

綿羊具有較寬的等熱區(qū)(5～25 ℃)，因其具備抗旱耐寒的特性，一直以來在畜牧生產(chǎn)中都占據(jù)極為重要的地位[7]。但在極端氣候條件下，它們的生理功能和生產(chǎn)性能仍會受到負面影響。2008—2018年內(nèi)蒙古羊存欄量為5 125.3萬～6 001.9萬只，占全國羊養(yǎng)殖總量的18.25%～20.20%，而內(nèi)蒙古地區(qū)屬溫帶大陸性季風氣候，冬季嚴寒漫長且晝夜溫差極大，極端最低氣溫可達-37.4 ℃，因此，綿羊過冬這一無法回避的生產(chǎn)環(huán)節(jié)會嚴重限制該地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[8]。目前關于畜禽寒冷應激的研究較為匱乏，有關寒冷應激對綿羊體增重、血清免疫和抗氧化機能影響的研究鮮見報道。因此，本試驗擬通過測定冬季不同溫度條件下綿羊生長性能指標、血清免疫和抗氧化指標及相關基因表達的變化，探究慢性寒冷應激對其體增重、血清免疫和抗氧化機能的影響，為科學健康養(yǎng)殖綿羊提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗于2016年12月31日至2017年1月27日在內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學試驗牧場開展。選取體重為(55.50±0.80) kg、毛叢長度為(11.60±1.47) cm的3歲健康杜蒙雜交母羊18只，隨機分為3組，每組6只。不同組的試驗羊飼養(yǎng)于不同羊舍，且各試驗羊單欄飼喂。其中舍內(nèi)加熱組(對照組)綿羊舍內(nèi)安置電暖氣，調(diào)節(jié)舍內(nèi)溫度處于舒適范圍；舍內(nèi)組綿羊處于舍內(nèi)自然溫度條件下；舍外組綿羊處于舍外接受冷暴露。試驗共28 d，第1～14天為試驗前期，第15～28天為試驗后期。試驗羊自由飲水，由于舍外環(huán)境溫度較低，因此每隔2 h換水1次，保證舍外組綿羊飲水自由。每天于08:00和15:00飼喂全混合日糧顆粒料1次，每次保證有5%的剩余料量，按照NRC(2007)飼養(yǎng)標準配制基礎飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)

1.2 樣品采集

分別于試驗第14和28天08:00空腹采集頸靜脈血樣于非抗凝采血管和含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝采血管中，3 000×g離心20 min后分別收集血清和白細胞。血清-20 ℃保存，白細胞中加入Trizol(TaKaRa)混勻并存于-80 ℃，用于總RNA的提取和后續(xù)指標的測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 環(huán)境溫度的測定

試驗期間，于羊舍中部和羊舍外距地面1 m處(畜體高度)懸掛日記型自記式溫度記錄儀(ZJI-2A型，上海隆拓儀器設備有限公司)，避免試驗羊觸碰。分別監(jiān)測并計算3組試驗前期(第1～14天)和試驗后期(第15～28天)的整點平均環(huán)境溫度。在試驗前期(圖1)，對照組的溫度為5.57～10.51 ℃，全天平均溫度為6.84 ℃；舍內(nèi)組的溫度為0.94～6.53 ℃，全天平均溫度為2.79 ℃；舍外組的溫度為-18.81～2.64 ℃，全天平均溫度為-10.62 ℃。在試驗后期(圖2)，對照組的溫度為5.51～10.25 ℃，全天平均溫度為7.18 ℃；舍內(nèi)組的溫度為0.53～4.83 ℃，全天平均溫度為2.05 ℃；舍外組的溫度為-25.60～-0.45 ℃，全天平均溫度為-15.49 ℃。

圖1 試驗前期(第1～14天)不同羊舍環(huán)境溫度日變化曲線

圖2 試驗后期(第15～28天)不同羊舍環(huán)境溫度日變化曲線

1.3.2 生長性能的測定

每次飼喂前稱取給料量，第2天晨飼前稱量并記錄料槽中剩余量，計算各組試驗羊的平均日采食量(ADFI)。試驗第1、14和28天晨飼前對所有試驗羊空腹稱重，計算平均日增重(ADG)。

1.3.3 血清免疫指標的測定

血清中IgA、IgG、IgM、IL-1、IL-12及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(瑞星生物科技有限公司)測定，按照制造商說明書要求進行。

1.3.4 血清抗氧化指標的測定

血清中總抗氧化能力(T-AOC)與過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量采用比色法通過南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.3.5 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR反應

采用Trizol法從白細胞中提取總RNA，紫外分光光度法測定總RNA的濃度和純度。按照Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)說明書進行反轉(zhuǎn)錄，采用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)進行實時熒光定量PCR反應，程序如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，退火60 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。綿羊IL-1β、IL-2、TNF-α、CAT、GPx、超氧化物歧化酶1(SOD1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、核轉(zhuǎn)錄因子2(Nrf2)和內(nèi)參β-肌動蛋白(β-actin)引物序列及參數(shù)如表2所示，由北京六合華大基因科技有限公司合成，各目的基因的相對表達量根據(jù)2-△△Ct法計算。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著。結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 慢性寒冷應激對綿羊生長性能的影響

由表3可知，試驗前期各組綿羊的ADG均為負值。試驗后期各組綿羊的ADG為正值，且與對照組相比，舍外組綿羊的ADG下降45.73%(P<0.05)。從試驗全期來看，舍外組綿羊的ADG與對照組相比降低189.81%(P<0.05)，且舍外組綿羊的ADG為負值。各組間綿羊的體重和ADFI在試驗各階段差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 慢性寒冷應激對綿羊血清免疫指標及白細胞中相關基因表達的影響

由表4可知，在試驗第14天，舍內(nèi)組和舍外組綿羊血清IL-1含量較對照組分別降低42.04%和47.78%(P<0.05)，而各組間其他血清免疫指標差異不顯著(P>0.05)。在試驗第28天，舍外組綿羊血清IgG含量較對照組下降27.63%(P<0.05)，而血清TNF-α含量較對照組升高89.72%(P<0.05)。此外，與對照組相比，舍內(nèi)組和舍外組綿羊血清IL-2含量分別降低25.73%和45.13%(P<0.05)。

表3 慢性寒冷應激對綿羊生長性能的影響

表4 慢性寒冷應激對綿羊血清免疫指標的影響

由表5可知，在試驗第14天，與對照組相比，舍內(nèi)組和舍外組綿羊白細胞中IL-1β基因相對表達量分別下調(diào)25.00%和33.00%(P<0.05)，且舍外組綿羊白細胞中IL-2基因相對表達量下調(diào)52.00%(P<0.05)。在試驗第28天，舍外組綿羊白細胞中IL-2基因相對表達量較對照組下調(diào)24.00%(P<0.05)，而白細胞中TNF-α基因相對表達量上調(diào)25.00%(P<0.05)；各組間白細胞中IL-1β基因相對表達量差異不顯著(P>0.05)。

2.3 慢性寒冷應激對綿羊血清抗氧化指標及白細胞中相關基因表達的影響

由表6可知，在試驗第14天，舍外組綿羊血清GPx和T-SOD活性較對照組分別下降28.82%和25.97%(P<0.05)；舍內(nèi)組和舍外組綿羊血清MDA含量較對照組分別升高64.38%和91.78%(P<0.05)。在試驗第28天，舍內(nèi)組和舍外組綿羊血清CAT活性較對照組分別降低31.91%和48.09%(P<0.05)，而舍外組較舍內(nèi)組降低23.75%(P<0.05)；舍內(nèi)組和舍外組綿羊血清T-AOC較對照組分別下降12.00%和38.00%(P<0.05)，而舍外組較舍內(nèi)組降低29.55%(P<0.05)；此外，與對照組相比，舍外組綿羊血清GPx和T-SOD活性分別下降43.85%和41.94%(P<0.05)，而血清MDA含量升高51.28%(P<0.05)。

表5 慢性寒冷應激對綿羊白細胞中IL-1β、IL-2和TNF-α基因相對表達量的影響

表6 慢性寒冷應激對綿羊血清抗氧化指標的影響

由表7可知，在試驗第14天，舍外組綿羊白細胞中GPx和SOD1基因相對表達量較對照組分別下調(diào)26.00%和25.00%(P<0.05)。在試驗第28天，與對照組相比，舍外組綿羊白細胞中Nrf2基因相對表達量上調(diào)68.00%(P<0.05)，而白細胞中GPx和SOD2基因相對表達量分別下調(diào)27.00%和39.00%(P<0.05)。此外，舍內(nèi)組綿羊白細胞中CAT基因相對表達量下調(diào)31.00%(P<0.05)，而舍外組綿羊白細胞中CAT基因相對表達量上調(diào)34.00%(P<0.05)。

3 討 論

我國北方高寒地區(qū)冬季氣溫普遍較低，且寒冷期普遍偏長。這種長期的寒冷刺激或者突降大雪、寒潮突襲等短暫性強降溫對動物的正常生長和機體健康都有很大影響，會降低家畜的生產(chǎn)力和抗病力。不同畜禽的等熱區(qū)或適宜溫度范圍不同，其中綿羊的等熱區(qū)為5～25 ℃,最適溫度為-3～23 ℃[7,14]。此外，羊的最適環(huán)境溫度范圍受其被毛性狀的影響。Acharya等[15]研究表明，相較于長毛羊，暴露在太陽輻射下的短毛羊直腸溫度、皮膚溫度和呼吸頻率會大幅升高，采食量則會降低。而在寒冷的冬季，被毛作為綿羊的保溫絕熱層，在減少體熱散失、維持冬季正常體溫方面發(fā)揮較大作用。本試驗中各組的環(huán)境溫度均較穩(wěn)定，其中對照組試驗全期平均溫度為7.01 ℃，舍內(nèi)組試驗全期平均溫度為2.42 ℃。而舍外組試驗全期平均溫度為-13.05 ℃，且試驗后期平均溫度為-15.49 ℃，較試驗前期-10.62 ℃下降4.87 ℃，這表明舍外組綿羊遭受寒冷應激的程度最為嚴重。

表7 慢性寒冷應激對綿羊白細胞中CAT、GPx、SOD1、SOD2和Nrf2基因相對表達量的影響

3.1 慢性寒冷應激對綿羊生長性能的影響

研究表明，動物在寒冷應激條件下為維持自身體溫恒定和正常的生命活動，需要消耗更多的飼糧能量。如果攝入的營養(yǎng)少于消耗部分，那么將消耗部分體脂，最終導致發(fā)育緩慢、體重下降。谷英等[16]研究表明，鄂爾多斯細毛羊冬季體重會出現(xiàn)負增長。張士軍[17]研究發(fā)現(xiàn)，-17 ℃冷暴露組羔羊(6月齡)相較于5 ℃對照組羔羊ADG顯著下降。本試驗結(jié)果與前人研究結(jié)果相似，試驗前期各組綿羊均處于減重狀態(tài)，試驗后期雖有所回升，但舍外組綿羊的ADG顯著下降，且從試驗全期來看，舍外組綿羊的體重并未恢復到試驗開始水平，處于減重狀態(tài)，而對照組和舍內(nèi)組綿羊的體重均有所升高。這可能是由于綿羊在舍外寒冷應激條件下需要消耗更多的能量，甚至消耗部分體脂來保證體溫恒定，從而減少了脂肪的沉積。值得注意的是，在本試驗中，寒冷應激雖然降低了綿羊的ADG，但各組綿羊的體重并無顯著差異，這可能是由于個體差異大或樣本數(shù)少而沒有達到差異顯著水平。此外，De等[18]研究表明，Malpura羔羊(3～5月齡)在寒冷應激條件下干物質(zhì)采食量增加，而在本試驗中各組綿羊的ADFI差異不顯著。這可能是由于寒冷應激對成年動物采食量的影響要小于幼年動物。郭春華等[19]的試驗結(jié)果，20～40 kg的小豬在低溫時的采食量增加要高于60～80 kg的大豬，也印證了這一推測。

3.2 慢性寒冷應激對綿羊血清免疫指標及白細胞中相關基因相對表達量的影響

由于機體免疫系統(tǒng)和應激系統(tǒng)的復雜性，關于寒冷應激對畜禽免疫功能影響的研究結(jié)論不一而足，這可能與動物種屬、刺激強度和持續(xù)時間等因素有關。但一般認為短期急性寒冷應激能夠增強機體的免疫應答能力，而長期慢性寒冷應激則會抑制機體免疫功能，且多數(shù)研究表明冷刺激對畜體免疫功能的影響主要呈免疫抑制作用[2,20-22]。血清免疫球蛋白能夠與抗原特異性結(jié)合，刺激抗體的產(chǎn)生，發(fā)揮特異性免疫效應，其含量是反映機體體液免疫功能的重要指標之一[23]。IgG作為Ig的主要組成部分，在促進免疫細胞吞噬病原體、中和病毒和細菌毒素等過程中發(fā)揮重要作用[24]。高靜雯等[25]將阿勒泰公羔羊置于2個不同的溫度組，即常溫對照組(15～20 ℃)和低溫冷應激組(-35～-30 ℃)，發(fā)現(xiàn)冷應激4 d時羔羊血清IgG含量相較常溫對照組顯著下降。與前人研究結(jié)果相似，本試驗發(fā)現(xiàn)舍外組綿羊血清IgG含量顯著低于對照組，這表明在寒冷應激條件下綿羊的Ig含量下降，機體體液免疫功能受到抑制。

細胞因子水平是衡量機體免疫功能的重要指標。其中IL-1能夠刺激T細胞和抗原呈遞細胞(APC)活化，IL-2可以促進T細胞生長、刺激B細胞增殖分化并產(chǎn)生抗體，二者均在反芻動物免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[26-27]。在本試驗中，寒冷應激顯著降低了試驗前期綿羊血清IL-1含量和白細胞中IL-1β、IL-2基因相對表達量，以及試驗后期綿羊血清IL-2含量和白細胞中其基因相對表達量，該結(jié)果與魏殿華等[26]、楊莉等[21]研究結(jié)果相似。魏殿華等[26]研究表明，阿勒泰羔羊在-20～-10 ℃條件下，外周血白細胞中IL-1 mRNA的表達量低于常溫對照組(10～20 ℃)；楊莉等[21]研究發(fā)現(xiàn)，阿勒泰羊在-30～-15 ℃條件下，血清IL-2含量呈下降趨勢，IL-4含量顯著下降。這表明寒冷應激可能通過降低IL-1β和IL-2的基因相對表達量來減少二者的分泌量，抑制機體免疫功能。此外，TNF-α作為炎癥早期反應的主要前炎性因子，能夠與多種免疫細胞上的受體結(jié)合，發(fā)揮免疫調(diào)控作用，但隨著其分泌量的增加，機體的炎癥反應會加劇，最終造成組織損傷，降低機體免疫功能。本研究結(jié)果表明，試驗后期舍外組綿羊在寒冷應激條件下血清TNF-α含量和白細胞中其基因相對表達量顯著升高，這與Shini等[28]的研究結(jié)果一致。該結(jié)果可能是由于應激條件下過量生成的活性氧(ROS)作為第二信使，通過泛素化和磷酸化核因子-κB(NF-κB)的抑制蛋白IκB，釋放細胞質(zhì)的NF-κB二聚體到細胞核中，從而促進了下游TNF-α等相關基因的轉(zhuǎn)錄，加速了機體的炎癥反應[29]。值得注意的是，本試驗舍內(nèi)組綿羊試驗前期血清IL-2、試驗后期血清TNF-α和試驗全期血清IgG含量與對照組綿羊相比差異不顯著，這可能與寒冷應激的強度較低且機體本身具有一定抵抗或適應不利環(huán)境的能力有關。

3.3 慢性寒冷應激對綿羊血清抗氧化指標及白細胞中相關基因相對表達量的影響

Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1-核因子E2相關因子2-抗氧化反應元件(Keap1-Nrf2-ARE)信號通路是機體抵抗氧化應激關鍵的防御性轉(zhuǎn)導通路[36]。但也有研究表明，持續(xù)的Nrf2激活反而會加重組織細胞的氧化損傷[37]。本研究測定了寒冷應激期間綿羊白細胞中Nrf2基因相對表達量，結(jié)果表明在試驗第28天，舍外組綿羊白細胞中Nrf2基因相對表達量顯著升高。此外，本研究發(fā)現(xiàn)試驗后期舍外組綿羊白細胞中CAT基因相對表達量顯著高于其他2個組，而血清CAT活性顯著低于其他各組，這可能是由于ROS通過修飾Keap1上的半胱氨酸殘基，激活Nrf2入核并與ARE結(jié)合，進而啟動了下游CAT基因的表達，但隨著寒冷應激嚴重程度和持續(xù)時間的增加，大量CAT、GPx和SOD被堆積的ROS消耗，最終導致抗氧化酶活性下降。

4 結(jié) 論

在本研究中，與對照組相比，舍外組綿羊的體增重下降，且舍外組和舍內(nèi)組綿羊血清IL-1和IL-2的含量降低，白細胞中IL-1β基因相對表達量下調(diào)，血清CAT活性以及白細胞中CAT基因相對表達量降低，血清T-AOC降低，而MDA含量升高。這表明慢性寒冷應激能夠降低綿羊的體增重，抑制其血清免疫和抗氧化水平，而安置供暖設備的保溫圈舍可以顯著緩解這種負面影響。