牟春堂 楊文軍 王鵬舉 任國棟 劇 浩 張暄梓 張建新 郝小燕

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，晉中030801)

由于季節(jié)性和地區(qū)性的優(yōu)質(zhì)粗飼料資源缺乏，高精料飼糧在我國反芻動物生產(chǎn)中應(yīng)用非常普遍。長期飼喂高精料飼糧容易造成反芻動物瘤胃代謝異常，進而發(fā)生瘤胃酸中毒，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)產(chǎn)生并積累大量的異常代謝物，包括D-乳酸、組胺、色胺和脂多糖(LPS)等[1]。反芻動物長期攝入高精料飼糧，瘤胃和后腸道中低pH和高濃度LPS會導(dǎo)致細胞上皮結(jié)構(gòu)受損，細胞間緊密連接的屏障功能受到破壞，游離的LPS會遷移至循環(huán)系統(tǒng)[2]。LPS進入循環(huán)系統(tǒng)中會引起動物氧化應(yīng)激和免疫活化，增加動物對病原的易感性。Nagaraja等[3]報道，發(fā)生瘤胃酸中毒后，外周血中中性粒細胞比例增加，淋巴細胞比例降低。吳永霞[4]研究也表明，高精料飼糧組較低精料飼糧組奶牛的外周血中白細胞和中性粒細胞數(shù)量顯著升高。

細胞免疫是動物免疫系統(tǒng)的重要組成部分，而T細胞在細胞免疫中至關(guān)重要。T細胞的過度增殖和活化均不利于機體健康。白細胞分化抗原(cluster of differentiation，CD)是存在于T細胞膜表面的主要標志物，其中CD4和CD8分別存在于輔助性T細胞和細胞毒性T細胞的膜表面。機體CD4+T細胞比例高時，能夠迅速啟動免疫系統(tǒng)抵抗外源性病原微生物的入侵，不易感染疾病。當(dāng)機體CD8+T細胞比例高時，說明機體遭受外源感染的程度更嚴重，機體自身的免疫功能降低，需要依靠外源藥物抵抗病原[5]。因此，機體T淋巴細胞中CD4+和CD8+的細胞比例及二者的比值高低與動物機體的免疫功能密切相關(guān)。

葡萄籽原花青素(GSPs)廣泛存在于葡萄枝葉、果皮、果肉和籽實中，由不同數(shù)量的黃烷醇單體聚合而成。研究表明，植物多酚和黃酮類化合物可以增強動物機體抗氧化力，調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，改善動物健康狀況，促進機體生長發(fā)育[6]。邢文麗等[7]研究表明，GSPs能夠上調(diào)大鼠血清白細胞介素-12(IL-12)含量，促進CD4+T細胞的活化，提高機體免疫功能。茅婷婷等[8]報道，GSPs可以促進體外培養(yǎng)的大鼠脾臟淋巴細胞增殖，具有提高細胞抗氧化和細胞免疫的作用。沙蔥黃酮對綿羊免疫功能有調(diào)控作用，可以提高綿羊外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，上調(diào)CD4+T細胞比例及CD4+/CD8+比值，下調(diào)CD8+T細胞比例[9]，同時促進淋巴細胞增殖[10]。目前，關(guān)于GSPs在反芻動物的中應(yīng)用研究主要集中在對機體抗氧化能力和瘤胃內(nèi)環(huán)境調(diào)控等方面，而對于反芻動物免疫功能調(diào)控作用方面的研究很少。本試驗在高精料飼糧舍飼條件下給羔羊飼喂不同水平GSPs，旨在探究GSPs對羔羊外周血淋巴細胞亞群、淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和凋亡率、細胞因子水平的影響，旨在為開發(fā)綿羊功能性免疫佐劑提供理論指導(dǎo)，為舍飼羔羊健康、高效養(yǎng)殖提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及動物管理

GSPs購自南京某生物科技有限公司，其主要成分為原花青素(96.4%)、兒茶素(0.533%)、表兒茶素(0.239%)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(0.225%)、表兒茶素沒食子酸酯(0.171%)。

本試驗在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系飼料資源崗位試驗基地進行，選取48只4月齡、體重[(22.75±1.20) kg]相近的杜寒雜交一代公羔羊，嚴格檢疫。試驗開始前對羊舍進行全面的清洗、消毒，對試驗羊進行羊痘、口蹄疫和小反芻獸疫疫苗免疫。采用單因素完全隨機試驗設(shè)計，將48只試驗羊隨機分成4組，每組12只羊。各組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0(對照組)、10(10GSPs組)、20(20GSPs組)、40 mg/(kg BW·d)(40GSPs組)的GSPs。試驗期共60 d，其中預(yù)試期15 d，正試期45 d。

GSPs的飼喂量在正試期每周根據(jù)體重調(diào)整1次，提前用分析天平準確稱取每只羔羊每日GSPs的飼喂量，在晨飼前與100 g粉狀飼料混合后，逐只一次性飼喂，確保每只羊完全采食GSPs后再投喂飼料。基礎(chǔ)飼糧精粗比例為70∶30，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。所有羔羊單欄(3.0 m×0.8 m)飼養(yǎng)，每日飼喂2次(07:00和19:00)，自由采食、飲水，記錄每只羔羊日采食量。分別于正試期第1和45天晨飼前稱量試驗羊體重，計算平均日增重。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

分別于正試期第1、15、30和45天晨飼前頸靜脈采集血液于5 mL肝素鈉采血管中，迅速帶回實驗室，待測淋巴細胞亞群。第45天同時采集2份5 mL血液，一份用于測定淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和凋亡率；另一份用常規(guī)方法分離血清后-20 ℃保存，待測細胞因子和免疫球蛋白含量。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 飼糧營養(yǎng)水平的測定

飼料原料及基礎(chǔ)飼糧經(jīng)粉碎后過1 mm篩，制成風(fēng)干樣品待測。干物質(zhì)、粗灰分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量參照AOAC(2000)[12]的方法測定。中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量參照Van Soest等[13]的方法，采用Ankom 220纖維分析儀(美國ANKOM公司)測定。

1.3.2 外周血淋巴細胞亞群CD4+、CD8+T細胞比例的測定

外周血淋巴細胞亞群檢測參考木其爾[9]的測定方法，即取60 μL血液于流式管中，加入MOUSE ANTI SHEEP CD4∶TITC和MOUSE ANTI SHEEP CD8∶RPE抗體，室溫避光孵育20 min。再加入1×紅細胞裂解液(索萊寶生物科技有限公司，No.：R1010)2 mL，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。300×g離心5 min，棄上清。再加入4 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，300×g離心5 min，棄上清。加入300 μL流式細胞儀上機液(或PBS)，上流式細胞儀(FACSCalibur，美國BD公司)檢測。

1.3.3 外周血淋巴細胞的分離

利用試劑盒(索萊寶生物科技有限公司，No.：P9030)分離綿羊外周血淋巴細胞，按說明書操作步驟進行。1)使用真空采血管采集試驗羊新鮮血液3 mL，迅速帶回實驗室；2)在無菌操作臺中，將血液與稀釋液等體積混合均勻；3)先往15 mL進口離心管中加入4 mL的淋巴細胞分離液，再緩慢沿管壁加入5 mL稀釋血液，1 000×g離心25 min；4)用移液槍小心吸取白色中間層，再加入5 mL PBS+1%雙抗緩沖液，500×g離心5 min；5)加入5 mL 1×紅細胞裂解液，室溫裂解5 min，500×g離心5 min；6)PBS+1%雙抗緩沖液重復(fù)清洗2遍，獲得淋巴細胞；7)將收集的淋巴細胞置于5%胎牛血清(美國Gibco公司，No.：26010074)和1%雙抗RPMI-1640的細胞培養(yǎng)液中，待用。

1.3.4 外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的測定

外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率檢測參考朱麗君等[14]報道的方法并加以改進。將已分離的外周血淋巴細胞濃度調(diào)整為2×106個/mL，取100 μL接種于96孔板中，標記組別，設(shè)置對照組，每個樣品3個重復(fù)。試驗組每孔加入10 g/mL刀豆蛋白(ConA)100 μL，對照組加入等體積PBS，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱(型號：BC-J80-S，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入CCK-8溶液10 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束，取出96孔板，用酶標儀測定450 nm處的吸光度值(OD450)。按以下公式計算羔羊外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率：

外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率(%)=100×(試驗組
OD450-對照組OD450)/對照組OD450。

1.3.5 外周血淋巴細胞凋亡率的測定

外周血淋巴細胞凋亡率的測定參考木其爾[9]的方法。將羔羊外周血淋巴細胞懸液置于離心管中，1 000×g離心5 min，棄掉細胞培養(yǎng)液，再用預(yù)冷的PBS漂洗2次，收集細胞。使用1×Binding buffer工作液，重懸細胞，并調(diào)整細胞濃度至1×106個/mL。吸取100 μL細胞懸液至流式管中，再加入膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)各5 μL，輕輕混合均勻，室溫避光孵育15 min。染色孵育后，加入1×Binding buffer工作液400 μL，1 h內(nèi)使用流式細胞儀檢測。

1.3.6 血清細胞因子和免疫球蛋白含量的測定

采用比色法測定血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)含量；采用酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(ELISA)法測定血清中白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-6(IL-6)和干擾素-γ(IFN-γ)含量，ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2013進行試驗數(shù)據(jù)初步整理，采用SAS 9.2軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVE)，并采用Duncan氏法進行多重比較，通過正交多項式分析處理的線性和二次效應(yīng)。P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有顯著的趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 GSPs對羔羊生長性能的影響

GSPs對羔羊生長性能的影響詳見牟春堂等[15]。簡言之，10GSPs和20GSPs組羔羊平均日增重和平均日采食量顯著高于對照組和40GSPs組(P<0.05)，40GSPs與對照組差異不顯著(P>0.05)；各組料重比無顯著差異(P>0.05)。

2.2 GSPs對羔羊外周血淋巴細胞亞群的影響

由表2可知，在正試期第1天，各組間羔羊外周血中CD4+和CD8+T細胞比例及CD4+/CD8+比值均無顯著差異(P>0.05)。正試期第15天，GSPs對外周血中CD4+T細胞比例沒有顯著影響(P>0.05)，但CD8+T細胞比例有線性降低的趨勢(P=0.057)，CD4+/CD8+比值有線性升高的趨勢(P=0.075)。正試期第30天，20GSPs和40GSPs組外周血中CD4+T細胞比例顯著高于對照組(P<0.05)，CD8+T細胞比例顯著低于對照組(P<0.05)，10GSPs組與對照組之間差異不顯著(P>0.05)；20GSPs組CD4+/CD8+比值最高，顯著高于10GSPs和對照組(P<0.05)。正試期第45天，與對照組相比，20GSPs和40GSPs組外周血中CD8+T細胞比例顯著降低(P<0.05)，CD4+T細胞比例及CD4+/CD8+比值顯著升高(P<0.05)；10GSPs組與20GSPs和對照組差異不顯著(P>0.05)。

表2 GSPs對羔羊外周血淋巴細胞亞群的影響

2.3 GSPs對羔羊外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和凋亡率的影響

由表3和圖1可知，隨著GSPs添加水平的增加，外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率線性升高(P<0.05)；20GSPs和40GSPs組的外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率顯著高于對照組(P<0.05)，與10GSPs組差異不顯著(P>0.05)。隨著GSPs添加水平的增加，GSPs外周血淋巴細胞凋亡率線性降低(P<0.05)；20GSPs和40GSPs組的外周血淋巴細胞凋亡率顯著低于對照組(P<0.05)。

2.4 GSPs對羔羊血清細胞因子和免疫球蛋白含量的影響

由表4可知，隨著GSPs添加水平的增加，血清IL-2含量有線性升高的趨勢(P=0.057)，血清IL-6含量有線性降低的趨勢(P=0.074)，但各組間血清IL-2、IL-6含量差異不顯著(P>0.05)。20GSPs和40GSPs組血清IL-4含量顯著高于對照組(P<0.05)。各組間血清IFN-γ含量差異不顯著(P>0.05)。隨著GSPs添加水平的增加，血清IgG含量線性增加(P<0.05)；20GSPs組血清IgG含量顯著高于10GSPs和對照組(P<0.05)，40GSPs組顯著高于對照組(P<0.05)。各組間血清IgA和IgM含量差異不顯著(P>0.05)。

表3 GSPs對羔羊外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和凋亡率的影響

A：對照組；B：10GSPs組；C：20GSPs組；D：40GSPs組。Q1：機械性死亡細胞區(qū)域；Q2：晚期凋亡和壞死細胞區(qū)域；Q3：活細胞區(qū)域；Q4：早期凋亡細胞區(qū)域。

表4 GSPs對羔羊血清細胞因子及免疫球蛋白含量的影響

3 討 論

3.1 GSPs對羔羊生長性能及外周血淋巴細胞亞群的影響

在高產(chǎn)奶牛、肉牛和肉羊生產(chǎn)中，通常會采用高精低粗的飼糧結(jié)構(gòu)滿足其營養(yǎng)需求。然而，反芻動物長期飼喂高精料飼糧會引起瘤胃發(fā)酵及微生物區(qū)系的改變，引發(fā)機體代謝紊亂，造成酸中毒、脂肪肝、蹄葉炎和全身炎癥等[16]。研究發(fā)現(xiàn)，與低精料飼糧組相比，飼喂以玉米秸稈為唯一粗飼料的高精料飼糧后，奶牛血液中白細胞和中性粒細胞數(shù)量升高，CD4+/CD8+比值顯著降低，表明不同飼糧模式對奶牛免疫功能會產(chǎn)生不同的影響[4]。血液中淋巴細胞亞群的變化是衡量機體免疫功能的重要指標，能夠反映機體的健康狀況。孫國慶等[5]研究發(fā)現(xiàn)，隨著日齡的不斷增加，羔羊血液中CD4+T淋巴細胞含量逐漸升高，之后趨于穩(wěn)定狀態(tài)，此時機體處于免疫功能最佳狀態(tài)。CD8+T細胞比例越高，CD4+/CD8+比值越低，表明機體的免疫能力越弱。在人醫(yī)臨床上，CD4+/CD8+比值大小常作為病毒感染、腫瘤或其他造成免疫功能降低的疾病臨床診斷的重要指征[17-18]。本研究中，羔羊的基礎(chǔ)飼糧精料比例為70%，正試期第30天和第45天各組羔羊外周血中CD4+細胞比例在數(shù)值上比第1天均有所升高，可能與羔羊日齡增加有關(guān)；各組羔羊的CD8+細胞比例在數(shù)值上也較第1天有明顯的增加，說明飼喂高精料可能使羔羊的免疫機能降低。試驗組給羔羊飼喂不同水平GSPs，飼喂30和45 d后外周血淋巴細胞亞群有所改善，20GSPs和40GSPs組羔羊CD4+T細胞比例較對照組顯著增加，CD8+T細胞比例較對照組低，說明一定水平的GSPs可以緩解羔羊長期采食高精料造成的CD8+T細胞比例增加的免疫反應(yīng)。據(jù)報道，GSPs具有很強的抗氧化、抗炎功能[19]，同時具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能[20]。茶多酚可以提高斷奶仔豬血液中CD4+T淋巴細胞的比例，抑制T細胞向CD8+分化，緩解氧化應(yīng)激造成的仔豬免疫功能紊亂[21]。木其爾[9]研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥黃酮可以降低肉羊外周血中CD8+T細胞比例，提高CD4+T淋巴細胞的比例及CD4+/CD8+比值，改善肉羊的免疫功能。張海軍等[20]研究表明，適量的葡多酚可以改善肉仔雞免疫功能，但高水平葡多酚(>15 mg/kg飼糧)會降低各類淋巴細胞的數(shù)量，影響肉仔雞的生長性能。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，適量的GSPs可以提高羔羊的平均日增重和育肥末體重，但40GSPs組羔羊的平均日增重和平均日采食量低于20GSPs和10GSPs組[15]，一方面原因可能是適量的GSPs發(fā)揮其天然抗氧化功能，有效清除機體自由基[6]，降低高精料飼糧引起的羔羊氧化應(yīng)激，提高羔羊的免疫力，有利于羔羊的健康；另一方面原因可能是因為酚類物質(zhì)降低了飼糧蛋白質(zhì)在瘤胃中的降解率，增加了小腸中可消化飼糧蛋白質(zhì)的比例[22]，為機體提供了充足的代謝蛋白質(zhì)。而高水平的GSPs會抑制瘤胃微生物活性，從而抑制羔羊采食和生長[23]。

3.2 GSPs對羔羊外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率和凋亡率的影響

在機體免疫應(yīng)答過程中，淋巴細胞增殖分化程度與機體的免疫應(yīng)答水平有直接關(guān)系。T淋巴細胞表面有多種受體存在，在受到特異性抗原或特異性有絲分裂原(如ConA)作用時，細胞代謝會加強，體積變大，轉(zhuǎn)化為原淋巴細胞。研究表明，機體在應(yīng)激狀態(tài)下T淋巴細胞轉(zhuǎn)化顯著被抑制[24]。房群[25]研究表明，大量自由基的攻擊會引起體內(nèi)T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率下降，通過給大鼠補充適量的抗氧化劑可以提高機體的抗氧化能力，可以改善淋巴細胞膜的流動性，提高淋巴細胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運、信號傳導(dǎo)的功能，提高大鼠外周血淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。木其爾[9]研究顯示，沙蔥黃酮可以有效提高肉羊T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率。在幼犬的飼糧中添加適量(0.3%或0.5%)的茶多酚，可以提高幼犬的抗氧化能力和淋巴細胞轉(zhuǎn)化率，改善幼犬的健康狀況[26]。本研究中，羔羊長期采食高精料飼糧可能引起機體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[27]，而補飼GSPs后機體的抗氧化能力有所改善[28]，機體抗氧化能力的改善可能有助于淋巴細胞轉(zhuǎn)化率的提高。因此，本研究中20GSPs和40GSPs組淋巴細胞轉(zhuǎn)化率顯著高于對照組，說明GSPs對羔羊細胞免疫水平有一定的調(diào)控作用。

細胞凋亡是正常細胞在生理和病理的刺激下發(fā)生的一種自發(fā)性死亡過程。機體可以通過細胞凋亡來清除衰老的細胞，保持機體細胞的正常新陳代謝。機體在維持免疫穩(wěn)態(tài)的過程中，淋巴細胞凋亡發(fā)揮著關(guān)鍵作用。淋巴細胞的凋亡和增殖調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，受多種細胞因子、激素以及外界環(huán)境誘因(如溫度、藥物、感染、射線等)的調(diào)控。有研究表明，熱應(yīng)激能顯著提高奶牛的外周血淋巴細胞凋亡率，造成機體一定程度的免疫抑制[29]。雛雞發(fā)生銅中毒時，血液和免疫器官中淋巴細胞凋亡率均會顯著升高[30]，機體免疫功能下降。劉玉娟等[31]研究表明，葡多酚可以有效緩解X射線引起的人外周血淋巴細胞凋亡，對淋巴細胞輻射損傷有良好的保護作用。紅松球果多酚類化合物可以改善患腫瘤小鼠的脾臟組織損傷，降低脾臟淋巴細胞的凋亡率，改善小鼠的免疫功能[32]。本研究中，20GSPs和40GSPs組淋巴細胞凋亡率較對照組顯著降低，說明GSPs一定程度上改善了高精料引起的機體免疫功能下降。但木其爾[9]研究發(fā)現(xiàn)沙蔥黃酮一定程度上提高了肉羊的淋巴細胞凋亡率，造成研究結(jié)果不一致的原因尚不明確，可能與試驗動物機體氧化應(yīng)激程度和免疫功能水平不同有關(guān)。

3.3 GSPs對羔羊血清細胞因子和免疫球蛋白含量的影響

淋巴細胞可以分泌多種細胞因子，其中IL-2和IFN-γ主要由CD4+T細胞中的炎癥性T細胞分泌。IL-4則主要由CD4+T細胞中的輔助性T細胞產(chǎn)生。炎癥性T細胞的主要功能是激活T細胞，參與細胞免疫；輔助性T細胞的主要功能是促進B淋巴細胞增殖和產(chǎn)生抗體，參與體液免疫。機體在氧化應(yīng)激時T淋巴細胞的活性降低，血清中IL-2含量降低，淋巴細胞轉(zhuǎn)化率降低[33]，免疫球蛋白含量降低[34]。有研究表明，茶多酚可以有效緩解斷奶仔豬的氧化應(yīng)激，增加CD4+T細胞比例，提高血清IL-2和IL-4含量，提高機體細胞免疫功能[19]。GSPs可以提高血清中IgG、IgM含量，提高機體體液免疫功能[35]。Iqbal等[36]報道，利用原花青素替代維生素E飼喂肉仔雞可以提高肉仔雞的抗氧化能力和抗體效價。本研究中，長期采食高精料可能引起羔羊機體氧化應(yīng)激以及胃腸道上皮黏膜損傷，引起機體炎癥反應(yīng)。GSPs對血清中IL-2和IFN-γ含量影響不顯著，而血清中IL-4含量隨著GSPs添加水平的增加線性升高，說明GSPs促進了CD4+細胞向Th2細胞分化，進一步促進B淋巴細胞產(chǎn)生抗體，提高血清IgG含量。此外，GSPs抑制T細胞向CD8+細胞分化，使機體細胞免疫和體液免疫得到改善。然而，Correddu等[37]報道，給泌乳母羊飼喂葡萄籽(300 g/d)會輕微降低母羊血清中IgG含量，降低CD4+/CD8+比值，引起一定的免疫抑制。因此，我們推測適量的GSPs有助于提高機體的抗氧化能力和免疫功能，而原花青素的攝入量超過一定水平后可能造成免疫抑制。

4 結(jié) 論

適量的GSPs可以提高羔羊平均日增重，提高外周血淋巴細胞中CD4+T細胞比例及CD4+/CD8+比值，促進淋巴細胞轉(zhuǎn)化，提高血清IgG含量。綜上所述，適量的GSPs可以改善羔羊生長性能和免疫功能，本試驗條件下，GSPs的適宜添加水平為20 mg/(kg BW·d)。