牟春堂 楊文軍 王鵬舉 任國棟 劇 浩 張暄梓 張建新 郝小燕

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，晉中030801)

由于季節(jié)性和地區(qū)性的優(yōu)質(zhì)粗飼料資源缺乏，高精料飼糧在我國反芻動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用非常普遍。長期飼喂高精料飼糧容易造成反芻動(dòng)物瘤胃代謝異常，進(jìn)而發(fā)生瘤胃酸中毒，導(dǎo)致瘤胃內(nèi)產(chǎn)生并積累大量的異常代謝物，包括D-乳酸、組胺、色胺和脂多糖(LPS)等[1]。反芻動(dòng)物長期攝入高精料飼糧，瘤胃和后腸道中低pH和高濃度LPS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞上皮結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞間緊密連接的屏障功能受到破壞，游離的LPS會(huì)遷移至循環(huán)系統(tǒng)[2]。LPS進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)中會(huì)引起動(dòng)物氧化應(yīng)激和免疫活化，增加動(dòng)物對(duì)病原的易感性。Nagaraja等[3]報(bào)道，發(fā)生瘤胃酸中毒后，外周血中中性粒細(xì)胞比例增加，淋巴細(xì)胞比例降低。吳永霞[4]研究也表明，高精料飼糧組較低精料飼糧組奶牛的外周血中白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著升高。

細(xì)胞免疫是動(dòng)物免疫系統(tǒng)的重要組成部分，而T細(xì)胞在細(xì)胞免疫中至關(guān)重要。T細(xì)胞的過度增殖和活化均不利于機(jī)體健康。白細(xì)胞分化抗原(cluster of differentiation，CD)是存在于T細(xì)胞膜表面的主要標(biāo)志物，其中CD4和CD8分別存在于輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的膜表面。機(jī)體CD4+T細(xì)胞比例高時(shí)，能夠迅速啟動(dòng)免疫系統(tǒng)抵抗外源性病原微生物的入侵，不易感染疾病。當(dāng)機(jī)體CD8+T細(xì)胞比例高時(shí)，說明機(jī)體遭受外源感染的程度更嚴(yán)重，機(jī)體自身的免疫功能降低，需要依靠外源藥物抵抗病原[5]。因此，機(jī)體T淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+的細(xì)胞比例及二者的比值高低與動(dòng)物機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。

葡萄籽原花青素(GSPs)廣泛存在于葡萄枝葉、果皮、果肉和籽實(shí)中，由不同數(shù)量的黃烷醇單體聚合而成。研究表明，植物多酚和黃酮類化合物可以增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體抗氧化力，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，改善動(dòng)物健康狀況，促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育[6]。邢文麗等[7]研究表明，GSPs能夠上調(diào)大鼠血清白細(xì)胞介素-12(IL-12)含量，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的活化，提高機(jī)體免疫功能。茅婷婷等[8]報(bào)道，GSPs可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖，具有提高細(xì)胞抗氧化和細(xì)胞免疫的作用。沙蔥黃酮對(duì)綿羊免疫功能有調(diào)控作用，可以提高綿羊外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，上調(diào)CD4+T細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值，下調(diào)CD8+T細(xì)胞比例[9]，同時(shí)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖[10]。目前，關(guān)于GSPs在反芻動(dòng)物的中應(yīng)用研究主要集中在對(duì)機(jī)體抗氧化能力和瘤胃內(nèi)環(huán)境調(diào)控等方面，而對(duì)于反芻動(dòng)物免疫功能調(diào)控作用方面的研究很少。本試驗(yàn)在高精料飼糧舍飼條件下給羔羊飼喂不同水平GSPs，旨在探究GSPs對(duì)羔羊外周血淋巴細(xì)胞亞群、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和凋亡率、細(xì)胞因子水平的影響，旨在為開發(fā)綿羊功能性免疫佐劑提供理論指導(dǎo)，為舍飼羔羊健康、高效養(yǎng)殖提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及動(dòng)物管理

GSPs購自南京某生物科技有限公司，其主要成分為原花青素(96.4%)、兒茶素(0.533%)、表兒茶素(0.239%)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(0.225%)、表兒茶素沒食子酸酯(0.171%)。

本試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系飼料資源崗位試驗(yàn)基地進(jìn)行，選取48只4月齡、體重[(22.75±1.20) kg]相近的杜寒雜交一代公羔羊，嚴(yán)格檢疫。試驗(yàn)開始前對(duì)羊舍進(jìn)行全面的清洗、消毒，對(duì)試驗(yàn)羊進(jìn)行羊痘、口蹄疫和小反芻獸疫疫苗免疫。采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將48只試驗(yàn)羊隨機(jī)分成4組，每組12只羊。各組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0(對(duì)照組)、10(10GSPs組)、20(20GSPs組)、40 mg/(kg BW·d)(40GSPs組)的GSPs。試驗(yàn)期共60 d，其中預(yù)試期15 d，正試期45 d。

GSPs的飼喂量在正試期每周根據(jù)體重調(diào)整1次，提前用分析天平準(zhǔn)確稱取每只羔羊每日GSPs的飼喂量，在晨飼前與100 g粉狀飼料混合后，逐只一次性飼喂，確保每只羊完全采食GSPs后再投喂飼料?；A(chǔ)飼糧精粗比例為70∶30，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。所有羔羊單欄(3.0 m×0.8 m)飼養(yǎng)，每日飼喂2次(07:00和19:00)，自由采食、飲水，記錄每只羔羊日采食量。分別于正試期第1和45天晨飼前稱量試驗(yàn)羊體重，計(jì)算平均日增重。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

分別于正試期第1、15、30和45天晨飼前頸靜脈采集血液于5 mL肝素鈉采血管中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，待測淋巴細(xì)胞亞群。第45天同時(shí)采集2份5 mL血液，一份用于測定淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和凋亡率；另一份用常規(guī)方法分離血清后-20 ℃保存，待測細(xì)胞因子和免疫球蛋白含量。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 飼糧營養(yǎng)水平的測定

飼料原料及基礎(chǔ)飼糧經(jīng)粉碎后過1 mm篩，制成風(fēng)干樣品待測。干物質(zhì)、粗灰分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量參照AOAC(2000)[12]的方法測定。中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量參照Van Soest等[13]的方法，采用Ankom 220纖維分析儀(美國ANKOM公司)測定。

1.3.2 外周血淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+T細(xì)胞比例的測定

外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測參考木其爾[9]的測定方法，即取60 μL血液于流式管中，加入MOUSE ANTI SHEEP CD4∶TITC和MOUSE ANTI SHEEP CD8∶RPE抗體，室溫避光孵育20 min。再加入1×紅細(xì)胞裂解液(索萊寶生物科技有限公司，No.：R1010)2 mL，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。300×g離心5 min，棄上清。再加入4 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，300×g離心5 min，棄上清。加入300 μL流式細(xì)胞儀上機(jī)液(或PBS)，上流式細(xì)胞儀(FACSCalibur，美國BD公司)檢測。

1.3.3 外周血淋巴細(xì)胞的分離

利用試劑盒(索萊寶生物科技有限公司，No.：P9030)分離綿羊外周血淋巴細(xì)胞，按說明書操作步驟進(jìn)行。1)使用真空采血管采集試驗(yàn)羊新鮮血液3 mL，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室；2)在無菌操作臺(tái)中，將血液與稀釋液等體積混合均勻；3)先往15 mL進(jìn)口離心管中加入4 mL的淋巴細(xì)胞分離液，再緩慢沿管壁加入5 mL稀釋血液，1 000×g離心25 min；4)用移液槍小心吸取白色中間層，再加入5 mL PBS+1%雙抗緩沖液，500×g離心5 min；5)加入5 mL 1×紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解5 min，500×g離心5 min；6)PBS+1%雙抗緩沖液重復(fù)清洗2遍，獲得淋巴細(xì)胞；7)將收集的淋巴細(xì)胞置于5%胎牛血清(美國Gibco公司，No.：26010074)和1%雙抗RPMI-1640的細(xì)胞培養(yǎng)液中，待用。

1.3.4 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測定

外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率檢測參考朱麗君等[14]報(bào)道的方法并加以改進(jìn)。將已分離的外周血淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106個(gè)/mL，取100 μL接種于96孔板中，標(biāo)記組別，設(shè)置對(duì)照組，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組每孔加入10 g/mL刀豆蛋白(ConA)100 μL，對(duì)照組加入等體積PBS，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱(型號(hào)：BC-J80-S，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入CCK-8溶液10 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束，取出96孔板，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值(OD450)。按以下公式計(jì)算羔羊外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率：

外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(%)=100×(試驗(yàn)組
OD450-對(duì)照組OD450)/對(duì)照組OD450。

1.3.5 外周血淋巴細(xì)胞凋亡率的測定

外周血淋巴細(xì)胞凋亡率的測定參考木其爾[9]的方法。將羔羊外周血淋巴細(xì)胞懸液置于離心管中，1 000×g離心5 min，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，再用預(yù)冷的PBS漂洗2次，收集細(xì)胞。使用1×Binding buffer工作液，重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL。吸取100 μL細(xì)胞懸液至流式管中，再加入膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)各5 μL，輕輕混合均勻，室溫避光孵育15 min。染色孵育后，加入1×Binding buffer工作液400 μL，1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.6 血清細(xì)胞因子和免疫球蛋白含量的測定

采用比色法測定血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)含量；采用酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(yàn)(ELISA)法測定血清中白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和干擾素-γ(IFN-γ)含量，ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2013進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)初步整理，采用SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVE)，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，通過正交多項(xiàng)式分析處理的線性和二次效應(yīng)。P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有顯著的趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 GSPs對(duì)羔羊生長性能的影響

GSPs對(duì)羔羊生長性能的影響詳見牟春堂等[15]。簡言之，10GSPs和20GSPs組羔羊平均日增重和平均日采食量顯著高于對(duì)照組和40GSPs組(P<0.05)，40GSPs與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)；各組料重比無顯著差異(P>0.05)。

2.2 GSPs對(duì)羔羊外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響

由表2可知，在正試期第1天，各組間羔羊外周血中CD4+和CD8+T細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值均無顯著差異(P>0.05)。正試期第15天，GSPs對(duì)外周血中CD4+T細(xì)胞比例沒有顯著影響(P>0.05)，但CD8+T細(xì)胞比例有線性降低的趨勢(P=0.057)，CD4+/CD8+比值有線性升高的趨勢(P=0.075)。正試期第30天，20GSPs和40GSPs組外周血中CD4+T細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，CD8+T細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，10GSPs組與對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05)；20GSPs組CD4+/CD8+比值最高，顯著高于10GSPs和對(duì)照組(P<0.05)。正試期第45天，與對(duì)照組相比，20GSPs和40GSPs組外周血中CD8+T細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)，CD4+T細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值顯著升高(P<0.05)；10GSPs組與20GSPs和對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

表2 GSPs對(duì)羔羊外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響

2.3 GSPs對(duì)羔羊外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和凋亡率的影響

由表3和圖1可知，隨著GSPs添加水平的增加，外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率線性升高(P<0.05)；20GSPs和40GSPs組的外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，與10GSPs組差異不顯著(P>0.05)。隨著GSPs添加水平的增加，GSPs外周血淋巴細(xì)胞凋亡率線性降低(P<0.05)；20GSPs和40GSPs組的外周血淋巴細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

2.4 GSPs對(duì)羔羊血清細(xì)胞因子和免疫球蛋白含量的影響

由表4可知，隨著GSPs添加水平的增加，血清IL-2含量有線性升高的趨勢(P=0.057)，血清IL-6含量有線性降低的趨勢(P=0.074)，但各組間血清IL-2、IL-6含量差異不顯著(P>0.05)。20GSPs和40GSPs組血清IL-4含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各組間血清IFN-γ含量差異不顯著(P>0.05)。隨著GSPs添加水平的增加，血清IgG含量線性增加(P<0.05)；20GSPs組血清IgG含量顯著高于10GSPs和對(duì)照組(P<0.05)，40GSPs組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。各組間血清IgA和IgM含量差異不顯著(P>0.05)。

表3 GSPs對(duì)羔羊外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和凋亡率的影響

A：對(duì)照組；B：10GSPs組；C：20GSPs組；D：40GSPs組。Q1：機(jī)械性死亡細(xì)胞區(qū)域；Q2：晚期凋亡和壞死細(xì)胞區(qū)域；Q3：活細(xì)胞區(qū)域；Q4：早期凋亡細(xì)胞區(qū)域。

表4 GSPs對(duì)羔羊血清細(xì)胞因子及免疫球蛋白含量的影響

3 討 論

3.1 GSPs對(duì)羔羊生長性能及外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響

在高產(chǎn)奶牛、肉牛和肉羊生產(chǎn)中，通常會(huì)采用高精低粗的飼糧結(jié)構(gòu)滿足其營養(yǎng)需求。然而，反芻動(dòng)物長期飼喂高精料飼糧會(huì)引起瘤胃發(fā)酵及微生物區(qū)系的改變，引發(fā)機(jī)體代謝紊亂，造成酸中毒、脂肪肝、蹄葉炎和全身炎癥等[16]。研究發(fā)現(xiàn)，與低精料飼糧組相比，飼喂以玉米秸稈為唯一粗飼料的高精料飼糧后，奶牛血液中白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量升高，CD4+/CD8+比值顯著降低，表明不同飼糧模式對(duì)奶牛免疫功能會(huì)產(chǎn)生不同的影響[4]。血液中淋巴細(xì)胞亞群的變化是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)，能夠反映機(jī)體的健康狀況。孫國慶等[5]研究發(fā)現(xiàn)，隨著日齡的不斷增加，羔羊血液中CD4+T淋巴細(xì)胞含量逐漸升高，之后趨于穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)機(jī)體處于免疫功能最佳狀態(tài)。CD8+T細(xì)胞比例越高，CD4+/CD8+比值越低，表明機(jī)體的免疫能力越弱。在人醫(yī)臨床上，CD4+/CD8+比值大小常作為病毒感染、腫瘤或其他造成免疫功能降低的疾病臨床診斷的重要指征[17-18]。本研究中，羔羊的基礎(chǔ)飼糧精料比例為70%，正試期第30天和第45天各組羔羊外周血中CD4+細(xì)胞比例在數(shù)值上比第1天均有所升高，可能與羔羊日齡增加有關(guān)；各組羔羊的CD8+細(xì)胞比例在數(shù)值上也較第1天有明顯的增加，說明飼喂高精料可能使羔羊的免疫機(jī)能降低。試驗(yàn)組給羔羊飼喂不同水平GSPs，飼喂30和45 d后外周血淋巴細(xì)胞亞群有所改善，20GSPs和40GSPs組羔羊CD4+T細(xì)胞比例較對(duì)照組顯著增加，CD8+T細(xì)胞比例較對(duì)照組低，說明一定水平的GSPs可以緩解羔羊長期采食高精料造成的CD8+T細(xì)胞比例增加的免疫反應(yīng)。據(jù)報(bào)道，GSPs具有很強(qiáng)的抗氧化、抗炎功能[19]，同時(shí)具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能[20]。茶多酚可以提高斷奶仔豬血液中CD4+T淋巴細(xì)胞的比例，抑制T細(xì)胞向CD8+分化，緩解氧化應(yīng)激造成的仔豬免疫功能紊亂[21]。木其爾[9]研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥黃酮可以降低肉羊外周血中CD8+T細(xì)胞比例，提高CD4+T淋巴細(xì)胞的比例及CD4+/CD8+比值，改善肉羊的免疫功能。張海軍等[20]研究表明，適量的葡多酚可以改善肉仔雞免疫功能，但高水平葡多酚(>15 mg/kg飼糧)會(huì)降低各類淋巴細(xì)胞的數(shù)量，影響肉仔雞的生長性能。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，適量的GSPs可以提高羔羊的平均日增重和育肥末體重，但40GSPs組羔羊的平均日增重和平均日采食量低于20GSPs和10GSPs組[15]，一方面原因可能是適量的GSPs發(fā)揮其天然抗氧化功能，有效清除機(jī)體自由基[6]，降低高精料飼糧引起的羔羊氧化應(yīng)激，提高羔羊的免疫力，有利于羔羊的健康；另一方面原因可能是因?yàn)榉宇愇镔|(zhì)降低了飼糧蛋白質(zhì)在瘤胃中的降解率，增加了小腸中可消化飼糧蛋白質(zhì)的比例[22]，為機(jī)體提供了充足的代謝蛋白質(zhì)。而高水平的GSPs會(huì)抑制瘤胃微生物活性，從而抑制羔羊采食和生長[23]。

3.2 GSPs對(duì)羔羊外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和凋亡率的影響

在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中，淋巴細(xì)胞增殖分化程度與機(jī)體的免疫應(yīng)答水平有直接關(guān)系。T淋巴細(xì)胞表面有多種受體存在，在受到特異性抗原或特異性有絲分裂原(如ConA)作用時(shí)，細(xì)胞代謝會(huì)加強(qiáng)，體積變大，轉(zhuǎn)化為原淋巴細(xì)胞。研究表明，機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化顯著被抑制[24]。房群[25]研究表明，大量自由基的攻擊會(huì)引起體內(nèi)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率下降，通過給大鼠補(bǔ)充適量的抗氧化劑可以提高機(jī)體的抗氧化能力，可以改善淋巴細(xì)胞膜的流動(dòng)性，提高淋巴細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)的功能，提高大鼠外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。木其爾[9]研究顯示，沙蔥黃酮可以有效提高肉羊T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。在幼犬的飼糧中添加適量(0.3%或0.5%)的茶多酚，可以提高幼犬的抗氧化能力和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，改善幼犬的健康狀況[26]。本研究中，羔羊長期采食高精料飼糧可能引起機(jī)體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[27]，而補(bǔ)飼GSPs后機(jī)體的抗氧化能力有所改善[28]，機(jī)體抗氧化能力的改善可能有助于淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的提高。因此，本研究中20GSPs和40GSPs組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于對(duì)照組，說明GSPs對(duì)羔羊細(xì)胞免疫水平有一定的調(diào)控作用。

細(xì)胞凋亡是正常細(xì)胞在生理和病理的刺激下發(fā)生的一種自發(fā)性死亡過程。機(jī)體可以通過細(xì)胞凋亡來清除衰老的細(xì)胞，保持機(jī)體細(xì)胞的正常新陳代謝。機(jī)體在維持免疫穩(wěn)態(tài)的過程中，淋巴細(xì)胞凋亡發(fā)揮著關(guān)鍵作用。淋巴細(xì)胞的凋亡和增殖調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程，受多種細(xì)胞因子、激素以及外界環(huán)境誘因(如溫度、藥物、感染、射線等)的調(diào)控。有研究表明，熱應(yīng)激能顯著提高奶牛的外周血淋巴細(xì)胞凋亡率，造成機(jī)體一定程度的免疫抑制[29]。雛雞發(fā)生銅中毒時(shí)，血液和免疫器官中淋巴細(xì)胞凋亡率均會(huì)顯著升高[30]，機(jī)體免疫功能下降。劉玉娟等[31]研究表明，葡多酚可以有效緩解X射線引起的人外周血淋巴細(xì)胞凋亡，對(duì)淋巴細(xì)胞輻射損傷有良好的保護(hù)作用。紅松球果多酚類化合物可以改善患腫瘤小鼠的脾臟組織損傷，降低脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡率，改善小鼠的免疫功能[32]。本研究中，20GSPs和40GSPs組淋巴細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組顯著降低，說明GSPs一定程度上改善了高精料引起的機(jī)體免疫功能下降。但木其爾[9]研究發(fā)現(xiàn)沙蔥黃酮一定程度上提高了肉羊的淋巴細(xì)胞凋亡率，造成研究結(jié)果不一致的原因尚不明確，可能與試驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體氧化應(yīng)激程度和免疫功能水平不同有關(guān)。

3.3 GSPs對(duì)羔羊血清細(xì)胞因子和免疫球蛋白含量的影響

淋巴細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，其中IL-2和IFN-γ主要由CD4+T細(xì)胞中的炎癥性T細(xì)胞分泌。IL-4則主要由CD4+T細(xì)胞中的輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生。炎癥性T細(xì)胞的主要功能是激活T細(xì)胞，參與細(xì)胞免疫；輔助性T細(xì)胞的主要功能是促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖和產(chǎn)生抗體，參與體液免疫。機(jī)體在氧化應(yīng)激時(shí)T淋巴細(xì)胞的活性降低，血清中IL-2含量降低，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低[33]，免疫球蛋白含量降低[34]。有研究表明，茶多酚可以有效緩解斷奶仔豬的氧化應(yīng)激，增加CD4+T細(xì)胞比例，提高血清IL-2和IL-4含量，提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能[19]。GSPs可以提高血清中IgG、IgM含量，提高機(jī)體體液免疫功能[35]。Iqbal等[36]報(bào)道，利用原花青素替代維生素E飼喂肉仔雞可以提高肉仔雞的抗氧化能力和抗體效價(jià)。本研究中，長期采食高精料可能引起羔羊機(jī)體氧化應(yīng)激以及胃腸道上皮黏膜損傷，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)。GSPs對(duì)血清中IL-2和IFN-γ含量影響不顯著，而血清中IL-4含量隨著GSPs添加水平的增加線性升高，說明GSPs促進(jìn)了CD4+細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，進(jìn)一步促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，提高血清IgG含量。此外，GSPs抑制T細(xì)胞向CD8+細(xì)胞分化，使機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫得到改善。然而，Correddu等[37]報(bào)道，給泌乳母羊飼喂葡萄籽(300 g/d)會(huì)輕微降低母羊血清中IgG含量，降低CD4+/CD8+比值，引起一定的免疫抑制。因此，我們推測適量的GSPs有助于提高機(jī)體的抗氧化能力和免疫功能，而原花青素的攝入量超過一定水平后可能造成免疫抑制。

4 結(jié) 論

適量的GSPs可以提高羔羊平均日增重，提高外周血淋巴細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞比例及CD4+/CD8+比值，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高血清IgG含量。綜上所述，適量的GSPs可以改善羔羊生長性能和免疫功能，本試驗(yàn)條件下，GSPs的適宜添加水平為20 mg/(kg BW·d)。