金 鹿 李勝利 桑 丹 張崇志 張春華 張俊麗 施 安 孫海洲* 李聚才*

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所，內(nèi)蒙古自治區(qū)草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010031；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，銀川750002)

長(zhǎng)期以來(lái)，反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家一直致力于通過(guò)優(yōu)化飼糧配方和利用飼料添加劑來(lái)改善、調(diào)節(jié)瘤胃中不同微生物菌群之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，以提高機(jī)體能量和蛋白質(zhì)的利用效率。飼料添加劑不僅可以改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，而且能夠增強(qiáng)或抑制特定微生物菌群的結(jié)構(gòu)[1]。植物多糖是廣泛存在于植物體組織中的酮糖或醛糖通過(guò)糖苷鍵連接在一起組成的天然高分子化合物，近年來(lái)因其具有增強(qiáng)免疫機(jī)能、改善幼畜腸道健康和瘤胃微生態(tài)環(huán)境等特點(diǎn)，被用作綠色、安全的飼料添加劑之一。沙蒿多糖是植物多糖的一種，具有植物多糖的全部特性，本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果表明，沙蒿多糖能夠能抑制消化道中有害菌的生長(zhǎng)與繁殖，同時(shí)也可調(diào)節(jié)反芻動(dòng)物瘤胃微生物發(fā)酵，提高機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[2-3]。此外，丁酸作為一種短鏈脂肪酸，能夠快速、直接的為胃腸道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育提供能量，也被證實(shí)具有改善胃腸道健康的功能。丁酸甘油酯和包膜丁酸鈉同為丁酸衍生物，在腸道內(nèi)部可水解產(chǎn)生丁酸。丁酸甘油酯無(wú)毒性和刺激性，在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮作用時(shí)間長(zhǎng)，能夠提供更加集中的能量形式[4]。包膜丁酸鈉則無(wú)需主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)直接進(jìn)入血液，作用迅速[5]。據(jù)報(bào)道，三丁酸甘油酯和包膜丁酸鈉均具有抗炎、保護(hù)腸黏膜的作用，能夠?yàn)橄捞峁I(yíng)養(yǎng)需要，進(jìn)而預(yù)防斷奶應(yīng)激對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成的壓力，提高動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[6]。但是，目前關(guān)于沙蒿多糖與丁酸類物質(zhì)的研究主要集中在豬和家禽等單胃動(dòng)物上，在反芻動(dòng)物中的研究相對(duì)較少，且大多數(shù)試驗(yàn)都是集中在單一物質(zhì)的效果研究上，有關(guān)沙蒿多糖與丁酸類物質(zhì)復(fù)合使用對(duì)灘羊羔羊瘤胃的作用機(jī)理研究尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)利用16S rDNA高通量測(cè)定技術(shù)，分析飼糧中添加沙蒿多糖不同組合制劑對(duì)灘羊羔羊瘤胃菌群組成及多樣性的影響，以期為沙蒿多糖不同組合制劑在舍飼灘羊生產(chǎn)實(shí)踐中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

沙蒿多糖(含量為95%以上)為實(shí)驗(yàn)室自制，丁酸甘油酯(含量為60%)購(gòu)于四川某飼料有限公司，包被丁酸鈉(含量為60%)購(gòu)于杭州某飼料有限公司，莫能菌素(含量3.8%)購(gòu)于北京某生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和基礎(chǔ)飼糧

采用完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇健康、體況良好、體重相近的斷奶灘羊公羔60只，按體重隨機(jī)分為4個(gè)組，每組15只羊。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加5.5 g/d沙蒿多糖+5.5 g/d包被丁酸鈉、5.5 g/d沙蒿多糖+5.5 g/d丁酸甘油酯和5.5 g/d沙蒿多糖+1.1 g/d莫能菌素的試驗(yàn)飼糧。參照NRC(2007)[7]飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制基礎(chǔ)飼糧，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。其中，沙蒿多糖、包被丁酸鈉、丁酸甘油酯的添加水平在NRC(2007)[7]飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，并結(jié)合課題組前期李勝利[2]和邴新帥[3]的研究結(jié)果設(shè)定；莫能菌素的添加水平按照產(chǎn)品說(shuō)明的推薦劑量設(shè)定。整個(gè)試驗(yàn)期75 d，其中預(yù)試期為15 d，正試期為60 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在寧夏靈誠(chéng)農(nóng)牧科技有限公司養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)期間所有羊只每日飼喂2次(08：00和17：00)，自由采食及飲水。各組試驗(yàn)羊只單欄飼喂，環(huán)境條件及飼養(yǎng)管理均保持一致，由專人負(fù)責(zé)飼養(yǎng)，并每天記錄羊只的個(gè)體采食量。

1.4 基礎(chǔ)飼糧營(yíng)養(yǎng)水平測(cè)定

飼糧中干物質(zhì)含量按照GB/T 6435—2014的方法進(jìn)行檢測(cè)[9]；粗蛋白質(zhì)含量使用凱式定氮法，按照GB/T 6432—1994的方法，通過(guò)凱氏定氮儀(KDY-9820，北京科拓有限公司)進(jìn)行檢測(cè)[10]；鈣含量使用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法，按照GB/T 6436—2002的方法進(jìn)行檢測(cè)[11]；磷含量定使用分光光度法，按照GB/T 6437—2002的方法，應(yīng)用紫外可見分光光度計(jì)(UV-2600，日本島津公司)進(jìn)行檢測(cè)[12]。

1.5 瘤胃液的采集與處理

試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)組選擇3只試驗(yàn)羊進(jìn)行屠宰，屠宰后立即無(wú)菌操作采集試驗(yàn)羊的瘤胃液，一部分分裝于50 mL的離心管中，用于測(cè)定pH；一部分用4層紗布過(guò)濾收集上清液，分裝于5 mL的離心管中，-20 ℃冰箱保存，用于測(cè)定氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度；一部分置于5 mL的凍存管中，-80 ℃冰箱保存，用于瘤胃微生物區(qū)系測(cè)定。

1.6 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測(cè)定

瘤胃液pH使用酸度計(jì)(FE20，瑞士梅特勒-托利多公司)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行測(cè)定；瘤胃液氨態(tài)氮濃度的測(cè)定采用馮宗慈等[13]的方法；瘤胃液VFA濃度采用姜芳等[14]的方法，通過(guò)氣相色譜儀(GC-2014，日本島津公司)檢測(cè)。

1.7 樣本測(cè)序

1.7.1 DNA樣品提取和PCR擴(kuò)增

按照糞便基因組提取試劑盒說(shuō)明書的方法對(duì)試驗(yàn)樣品進(jìn)行DNA提取，之后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。引物上添加測(cè)序接頭和樣本特異性Barcode序列，進(jìn)而擴(kuò)增16s rDNA序列的V3～V4區(qū)域，引物序列為：338F，5’-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，806R，5’-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。PCR采用25 μL擴(kuò)增體系：DNA模板5 ng，5 μmol/L的上、下游引物各1 μL，2 ng/μL的牛血清白蛋白(BSA) 3 μL，2xTaq Plus Master Mix 12.5 μL，雙蒸水(ddH2O)補(bǔ)加至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸 60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用PCR純化試劑盒純化回收，并按測(cè)序要求進(jìn)行混合。

1.7.2 MiSeq測(cè)序

將樣品送至北京奧維森基因科技有限公司運(yùn)用Mixed PE 300平臺(tái)進(jìn)行MiSeq測(cè)序。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010進(jìn)行計(jì)算，并采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05≤P<0.10為差異有顯著趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)

由表2可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組灘羊瘤胃液乙酸、丁酸、總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度和乙酸比例顯著提高(P<0.05)。各組之間灘羊瘤胃液pH，氨態(tài)氮、丙酸濃度，丙酸、丁酸比例以及乙酸/丙酸無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2 瘤胃菌群多樣性

2.2.1 操作分類單位(OTU)數(shù)量

Venn圖用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，可以比較直觀地表現(xiàn)環(huán)境樣本的OTU數(shù)目組成相似性及特異性。利用瘤胃內(nèi)細(xì)菌群落共享和獨(dú)特的OTU數(shù)目對(duì)飼糧內(nèi)添加沙蒿多糖混合制劑效果進(jìn)行分析，由圖1可知，4個(gè)組共產(chǎn)生1 530個(gè)OTU，其中對(duì)照組產(chǎn)生1 048個(gè)OTU，試驗(yàn)1組產(chǎn)生912個(gè)OTU，試驗(yàn)2組產(chǎn)生1 286個(gè)OTU，試驗(yàn)3組產(chǎn)生839個(gè)OTU，4個(gè)組共享了541個(gè)OTU，占總OTU數(shù)目的35.36%。對(duì)照組、試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組獨(dú)有的OTU數(shù)目分別為29、30、263和31個(gè)，分別占1.90%、1.96%、17.19%和2.03%，OTU數(shù)目順序?yàn)樵囼?yàn)2組>試驗(yàn)3組>試驗(yàn)1組>對(duì)照組，表明試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組和試驗(yàn)1組均提高了瘤胃內(nèi)特有微生物的種類，增加了其微生物的多樣性。

表2 沙蒿多糖組合制劑對(duì)灘羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

LW1、LW2、LW3和LW4分別代表試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組和對(duì)照組。下圖同。

2.2.2 多樣性分析

2.2.2.1 稀釋曲線和Shannon曲線

稀釋曲線和Shannon曲線反映本試驗(yàn)的測(cè)序量和97%相似度OTU數(shù)目下制備的文庫(kù)微生物多樣性。由圖2可以看出，隨著測(cè)序深度的增加，新物種出現(xiàn)的增加速度變得緩慢，但是仍然有新種群出現(xiàn)。由圖3可以看出，當(dāng)測(cè)序深度較小時(shí)，Shannon曲線急速上升，當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到5 000 reads時(shí)，該多樣性曲線變化緩慢，已接近飽和，說(shuō)明測(cè)序趨向飽和，即本試驗(yàn)當(dāng)前的測(cè)序量足夠進(jìn)行樣品菌群多樣性分析。

圖2 樣品的稀釋曲線

圖3 樣品的Shannon曲線

2.2.2.2 α多樣性分析

α多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析，包括Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等。其中，Chao1指數(shù)反映樣品中微生物的種類，即OTU數(shù)目。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)則用于估計(jì)微生物多樣性，Shannon指數(shù)越大反映了樣品中微生物多樣性越豐富。由表3可知，試驗(yàn)2組的Chao1指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明試驗(yàn)2組樣品中細(xì)菌物種總數(shù)高于對(duì)照組。試驗(yàn)2組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)有大于對(duì)照組的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)，說(shuō)明試驗(yàn)2組樣品中細(xì)菌的多樣性高于對(duì)照組。各組的覆蓋率均高于99%，說(shuō)明足夠反映試驗(yàn)不同組別中每只灘羊瘤胃菌群的情況。

表3 α多樣性指數(shù)

2.2.2.3 β多樣性分析

β多樣性主要是為了研究不同樣品或組別之間的菌群結(jié)構(gòu)差異。采用加權(quán)Unifrac比較組別之間的微生物群落之間的距離，可以直觀地反映出不同組別之間物種的組成結(jié)構(gòu)差異性。各組之間離散的越遠(yuǎn)，說(shuō)明各組差異越大。由圖4可以看出，本試驗(yàn)中，試驗(yàn)2組與其他各組相距較遠(yuǎn)，說(shuō)明其與其他各組瘤胃微生物區(qū)系存在著差異，也進(jìn)一步可以說(shuō)明飼糧添加沙蒿多糖+丁酸甘油酯可以使灘羊羔羊的瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖4 16S rDNA的主坐標(biāo)分析

2.2.3 細(xì)菌組成和群落結(jié)構(gòu)分析

2.2.3.1 門水平結(jié)構(gòu)分析

灘羊瘤胃細(xì)菌在門水平上的組成和相對(duì)豐度見表4和圖5，共檢測(cè)到21種菌門，包括厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、螺旋菌門、軟壁菌門、糖細(xì)菌門、變形菌門、絲狀桿菌門、藍(lán)藻菌門、SR1_Absconditabacteria、疣微菌門、綠彎菌門、未注釋細(xì)菌門、互養(yǎng)菌門、廣古菌門、黏膠球形菌門、浮霉菌門等。4個(gè)組中灘羊瘤胃液中的菌門主要為厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門，占到了總細(xì)菌的94.52%。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)1組瘤胃液中軟壁菌門的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，厚壁菌門和絲狀桿菌門的相對(duì)豐度有升高的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)；試驗(yàn)2組瘤胃液中綠彎菌門的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)，而疣微菌門的相對(duì)豐度有升高的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)；試驗(yàn)3組瘤胃液中藍(lán)藻菌門和互養(yǎng)菌門的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)。

2.2.3.2 屬水平結(jié)構(gòu)分析

灘羊瘤胃細(xì)菌在上水平上的組成和相對(duì)豐度見表5和圖6，將瘤胃細(xì)菌群落細(xì)化分類注釋到細(xì)菌屬水平，4組灘羊瘤胃液菌群總共包含173個(gè)屬。其中有18個(gè)菌屬相對(duì)比例均占到序列總數(shù)的1%以上，分別為普雷沃氏菌屬_1、克里斯滕森菌科_R-7、奧爾森菌屬、理研菌科_RC9、毛螺菌科_NK3A20、密螺旋體屬_2、Saccharofermentans、瘤胃球菌屬_gauvreauii、瘤胃球菌科_NK4A214、瘤胃球菌科_UCG-014、Sharpea、雙歧桿菌屬、毛螺旋菌科、互營(yíng)球菌屬、Catenisphaera、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌、解琥珀酸菌屬、嚙齒真桿菌等。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)1組瘤胃液中理研菌科RC9的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，解琥珀酸菌屬和丹毒絲菌屬的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)；試驗(yàn)2組瘤胃液中Sharpea的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，假丁酸弧菌屬的相對(duì)豐度顯著升高(P<0.05)；試驗(yàn)3組瘤胃液中理研菌科RC9和Sharpea的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)，互營(yíng)球菌屬的相對(duì)豐度有增加的趨勢(shì)(0.05≤P<0.10)。

Firmicutes：厚壁菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Spirochaetae：螺旋菌門；Tenericutes：軟壁菌門；Other：其他。

3 討 論

反芻動(dòng)物的瘤胃是一個(gè)復(fù)雜的厭氧微生物發(fā)酵系統(tǒng)，主要包括細(xì)菌和古菌、原蟲和真菌以及噬菌體，其中細(xì)菌是瘤胃中數(shù)量最多、種類最復(fù)雜的微生物。細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝不僅能夠?yàn)榉雌c動(dòng)物提供能量、蛋白質(zhì)、必需氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且可以降解纖維物質(zhì)，使其轉(zhuǎn)化為供機(jī)體吸收利用的能源物質(zhì)，進(jìn)而維持反芻動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)需要[15]。研究表明，反芻動(dòng)物瘤胃中的優(yōu)勢(shì)菌群主要為厚壁菌門和擬桿菌門，其在瘤胃發(fā)酵過(guò)程中扮演著重要角色[16-17]。本試驗(yàn)中，瘤胃優(yōu)勢(shì)菌群按照相對(duì)豐度由大到小依次為厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門，這與上述研究得出的結(jié)果一致。郭偉[18]使用RDP數(shù)據(jù)庫(kù)資源對(duì)瘤胃菌群16S rRNA基因序列進(jìn)行Meta分析后，得出山羊瘤胃中優(yōu)勢(shì)菌群依次為擬桿菌門、變形菌門和厚壁菌門，與本研究得出的結(jié)論不同，探究其原因可能是與動(dòng)物的品種與日齡、飼糧結(jié)構(gòu)、采樣方式以及測(cè)序區(qū)域等的不同有關(guān)。厚壁菌門與擬桿菌們分別在纖維物質(zhì)與非纖維物質(zhì)的降解中發(fā)揮著重要作用，纖維與非纖維物質(zhì)經(jīng)瘤胃發(fā)酵后分別產(chǎn)生乙酸和丙酸[19]。有學(xué)者認(rèn)為，厚壁菌門和擬桿菌門二者含量的比例會(huì)影響機(jī)體對(duì)能量的吸收。Turnbaugh等[20]研究發(fā)現(xiàn)，腸道富集厚壁菌門細(xì)菌的小鼠比較肥胖，然而擁有更高比例擬桿菌門細(xì)菌的小鼠卻相對(duì)消瘦。這可能是因?yàn)楹癖诰T細(xì)菌富含淀粉、半乳糖及丁酸等代謝酶，有助于促進(jìn)機(jī)體對(duì)能量的吸收，更有利于脂肪的沉積[21]。本試驗(yàn)前期研究結(jié)果的生長(zhǎng)性能數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照組相比，沙蒿多糖+包被丁酸鈉組、沙蒿多糖+丁酸甘油酯組和沙蒿多糖+莫能菌素組顯著提高了灘羊羔羊的末重和平均日增重，平均日增重比對(duì)照組分別增加了15.29%、11.98%和17.33%，但對(duì)平均日采食量無(wú)顯著影響，4個(gè)組的平均日采食量分別為2 120、2 110、2 140和2 180 g/d；4個(gè)組的料重比分別為10.99、9.86、10.20和9.99，以沙蒿多糖+包被丁酸鈉組為最低，且與對(duì)照組相比差異顯著[22]。因此，本試驗(yàn)中飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉后灘羊羔羊的增重并非由采食量導(dǎo)致的，推測(cè)其一方面是由于其提高了瘤胃中厚壁菌門的相對(duì)豐度；另一方面可能與沙蒿多糖、丁酸鈉營(yíng)養(yǎng)腸道的作用有關(guān)[23]。此外，與生長(zhǎng)性能相一致，本研究中飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉有提高Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的趨勢(shì)，雖然與對(duì)照組相比差異不顯著，但在數(shù)值上均有所提高。這說(shuō)明飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉可能通過(guò)提高瘤胃微生物豐度和多樣性導(dǎo)致羔羊生長(zhǎng)性能提高。

Daly等[24]研究表明，厚壁菌門中包含有較多的纖維分解菌。本研究中，飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉有提高瘤胃液中厚壁菌門的相對(duì)豐度的趨勢(shì)，說(shuō)明添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉后促進(jìn)了纖維分解菌的生長(zhǎng)，這可能會(huì)提高瘤胃內(nèi)纖維類物質(zhì)的分解效率，發(fā)酵產(chǎn)生更多的乙酸。VFA(乙酸、丙酸、丁酸)的組成和濃度除受飼糧結(jié)構(gòu)和品質(zhì)的影響外，瘤胃微生物活性和微生物區(qū)系也會(huì)影響VFA的生成[25]。本研究得出，飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉顯著提高瘤胃液乙酸比例，說(shuō)明添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉后纖維的降解率有所提高，可能是由于添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉后提高了厚壁菌門相對(duì)豐度的原因。此外，碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生VFA的過(guò)程中釋放的能量可以供微生物生長(zhǎng)繁殖利用。據(jù)報(bào)道，pH的高低也會(huì)直接影響瘤胃微生物的生長(zhǎng)代謝，反芻動(dòng)物瘤胃液適宜pH為6.00～6.30，pH過(guò)低將會(huì)抑制纖維分解菌的活性[26-27]。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組瘤胃液pH雖略有提高，但均處于正常范圍內(nèi)，說(shuō)明發(fā)酵環(huán)境有利于微生物的生長(zhǎng)和代謝。

表4 沙蒿多糖組合制劑對(duì)灘羊瘤胃菌群在門水平上相對(duì)豐度的影響

變形菌門是細(xì)菌域中最大的一門，除了包含纖維素降解菌、半纖維素降解菌、蛋白質(zhì)降解菌、淀粉降解菌以及乳酸利用菌以外，還包含很多如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等致病菌，容易引起動(dòng)物腹瀉等疾病[28]。本試驗(yàn)中試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組中變形菌門的相對(duì)豐度與對(duì)照組相比雖然差異不顯著，但在數(shù)值上有所降低，說(shuō)明飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉或沙蒿多糖+丁酸甘油酯具有較好的平衡腸道菌群的作用。目前關(guān)于沙蒿多糖與丁酸類物質(zhì)復(fù)合使用對(duì)腸道菌群的影響鮮有報(bào)道，只有少量試驗(yàn)集中在單一物質(zhì)的效果研究上，并且主要以單胃動(dòng)物為主。本課題組李勝利[2]的研究結(jié)果表明，飼糧添加沙蒿多糖能夠減少腸道致病性如弧菌、空腸彎曲菌等的相對(duì)豐度。Rivera-Chavez等[29]研究發(fā)現(xiàn)，三丁酸甘油酯和包被丁酸鈉釋放出的有效物質(zhì)丁酸，其強(qiáng)酸性可以有效抑制有害致病菌的增殖，并且能夠促進(jìn)乳酸菌等益生菌的生長(zhǎng)，使腸道微生態(tài)維持在正常水平。此外，本試驗(yàn)中，試驗(yàn)3組與對(duì)照組間互養(yǎng)菌門的相對(duì)豐度差異顯著?；ヰB(yǎng)菌門是一種較新分類門，屬革蘭氏陰性厭氧桿菌，具有降解氨基酸和丙酮酸的能力[30]。疣微菌門在哺乳動(dòng)物胃腸道免疫耐受中起主要作用，其相對(duì)豐度的減少或缺失與宿主免疫力的下降密切相關(guān)[31]。本研究中，試驗(yàn)2組與對(duì)照組相比，疣微菌門的相對(duì)豐度顯著升高，這表明在飼糧中添加沙蒿多糖+丁酸甘油酯可增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

Unidentified：未分類；Prevotella_1：普雷沃氏菌屬_1；Olsenella：奧爾森菌屬；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌科_R-7；Succiniclasticum：解琥珀酸菌屬；Lachnospiraceae_NK3A20_group：毛螺菌科_NK3A20；Treponema_2：密螺旋體屬_2；Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃球菌科_UCG-014；Syntrophococcus：互營(yíng)球菌屬；Ruminococcus_gauvreauii_group：瘤胃球菌屬_gauvreauii；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科_RC9；Ruminococcus_1：瘤胃球菌屬_1；Acetitomaculum：毛螺旋菌科；Ruminococcaceae_NK4A214：瘤胃球菌科_NK4A214；Eubacterium_ruminantium_group：嚙齒真桿菌；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌科_UCG-001；Eubacterium_coprostanoligenes_group：產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌；Prevotella_7：普雷沃氏菌屬_7；Ruminococcus_2：瘤胃球菌屬_2；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃球菌科_UCG-005；Other：其他。

表5 沙蒿多糖組合制劑對(duì)灘羊瘤胃菌群在屬水平的豐度影響

續(xù)表5項(xiàng)目Items對(duì)照組 Control group試驗(yàn)1組Trial group 1試驗(yàn)2組Trial group 2試驗(yàn)3組Trial group 3均值標(biāo)準(zhǔn)誤SEMP值P-value瘤胃球菌科_NK4A214 Ruminococcaceae_NK4A2142.286ab1.241b3.531a1.136b0.4950.029瘤胃球菌科_UCG-014 Ruminococcaceae_UCG-0142.2593.7451.5011.9331.6610.175Sharpea2.207a0.976ab0.545b0.161b0.3840.026雙歧桿菌屬 Bifidobacterium2.5650.1110.3500.1450.9170.249毛螺旋菌科 Acetitomaculum1.8591.8321.9093.5280.8950.498互營(yíng)球菌屬 Syntrophococcus1.7932.8130.7526.8591.4200.069Catenisphaera1.259ab2.259a0.573b0.204b0.4610.057產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌Eubacterium_coprostanoligenes_group1.0351.3221.1731.1610.1990.791解琥珀酸菌屬 Succiniclasticum0.911b6.795a1.868ab6.071ab1.6120.036嚙齒真桿菌 Eubacterium_ruminantium_group0.8641.9511.1371.2540.4580.432瘤胃球菌科_UCG-005 Ruminococcaceae_UCG-0050.4630.4050.5970.3020.4640.468丁酸弧菌屬_2 Butyrivibrio_20.2210.1170.2920.1380.0690.371韋榮球菌科_UCG-007 Erysipelotrichaceae_UCG-0070.2910.0010.0440.0000.1360.422假丁酸弧菌屬 Pseudobutyrivibrio0.040b0.000b0.173a0.008b0.0140.001毛螺菌科_ND3007 Lachnospiraceae_ND3007_group0.9000.0100.1170.2270.3820.403丹毒絲菌屬 Solobacterium0.092b0.629a0.174b0.039b0.0620.001葡萄球菌屬 Turicibacter0.0100.0030.0000.0010.0030.130

進(jìn)一步從屬水平來(lái)看，普雷沃氏菌屬是普遍存在于草食動(dòng)物瘤胃中數(shù)量最多的一類擬桿菌門菌屬，參與多種微生物代謝、具有較高活性的半纖維素降解能力和適應(yīng)不同飼糧結(jié)構(gòu)的能力[32]，在蛋白質(zhì)、淀粉、木聚糖和果膠的降解過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[33-34]。本試驗(yàn)中，普雷沃氏菌屬1的相對(duì)豐度最高，但各組之間差異不顯著，這與前人研究結(jié)果[35]一致。然而從數(shù)值上看，試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組瘤胃液中普雷沃氏菌屬1的相對(duì)豐度均高于對(duì)照組，說(shuō)明飼糧添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉組或沙蒿多糖+丁酸甘油酯均能在一定程度上提高普雷沃氏菌屬的數(shù)量，進(jìn)而可能提高半纖維素被分解的效率。瘤胃球菌屬包括黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌，是瘤胃中主要的纖維降解菌，能產(chǎn)生大量的纖維素酶、半纖維素酶和木聚糖酶，降解粗飼料中的纖維素和半纖維素[36]。Shen等[37]在研究莫能菌素對(duì)荷斯坦奶牛瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響中發(fā)現(xiàn)，由于莫能菌素降低了革蘭氏陽(yáng)性纖維溶解菌(如瘤胃球菌屬)在瘤胃液中的相對(duì)豐度，因此降低了瘤胃液中乙酸比例。在本試驗(yàn)中，試驗(yàn)2組瘤胃液中瘤胃球菌科_NK4A214的相對(duì)豐度顯著高于試驗(yàn)3組，而瘤胃球菌科_UCG-014的相對(duì)豐度低于試驗(yàn)3組，這可能是由于灘羊瘤胃內(nèi)瘤胃球菌科_NK4A214的生長(zhǎng)因添加莫能菌素而受到抑制，導(dǎo)致了與它有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的其他瘤胃球菌屬的相對(duì)豐度提高。Grilli等[38]研究證實(shí)，丁酸弧菌屬中的假丁酸弧菌是山羊瘤胃中主要降解纖維的細(xì)菌，發(fā)酵各種碳水化合物，丁酸是主要的代謝產(chǎn)物。Koike等[39]研究發(fā)現(xiàn)，解琥珀酸菌屬中產(chǎn)琥珀酸擬桿菌，纖維分解活性很高，能夠降解白色瘤胃球菌不能降解的晶體纖維素，是研究纖維素酶最早的瘤胃菌株之一。有研究表明，產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌產(chǎn)生的酶具有獨(dú)立的纖維素化區(qū)和結(jié)合區(qū)，纖維降解能力很強(qiáng)，并且還能降解黃白瘤胃球菌不能降解的纖維素[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加沙蒿多糖+丁酸甘油酯或沙蒿多糖+包被丁酸鈉促進(jìn)了灘羊瘤胃中假丁酸弧菌屬和解琥珀酸菌屬的生長(zhǎng)繁殖，提高了瘤胃液中乙酸和丁酸濃度，表明這2組瘤胃內(nèi)纖維類物質(zhì)的消化率會(huì)提高，這也與課題組前期得出的其顯著增加了中性洗滌纖維(NDF)表觀消化率的研究結(jié)果[22]相吻合。

此外，基于當(dāng)前細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究在灘羊瘤胃內(nèi)還檢測(cè)到大量未被分類鑒定的菌屬，這些結(jié)果暗示灘羊具有自己特有的瘤胃微生物菌群，同時(shí)也反映了目前對(duì)其瘤胃微生物區(qū)系研究很少的事實(shí)，在今后的研究中有待于進(jìn)一步發(fā)掘。

4 結(jié) 論

在灘羊羔羊飼糧中添加沙蒿多糖組合制劑均可提高菌群多樣性，改善瘤胃微生物區(qū)系，且以添加沙蒿多糖+包被丁酸鈉效果最好。