郭寶珠 蔡輝益 劉國(guó)華 李 陽(yáng) 常文環(huán) 鄭愛(ài)娟 陳志敏

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物飼料開(kāi)發(fā)國(guó)家工程研究中心，北京100081)

蛋白質(zhì)飼料原料缺乏已成為我國(guó)畜牧業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一[1]，而開(kāi)發(fā)非常規(guī)蛋白質(zhì)飼料原料(unconventional protein feed ingredients,UPFI)能促進(jìn)地源性飼料資源有效利用并一定程度上緩解蛋白質(zhì)飼料原料缺乏的現(xiàn)狀[2-3]。中國(guó)是亞麻的主要種植國(guó)之一，在我國(guó)西北、華北等地區(qū)亞麻種植較多[4]，亞麻籽餅粕是亞麻籽榨油后的副產(chǎn)物，其粗蛋白質(zhì)含量為32.2%～34.8%[5]，屬于典型的地源性UPFI[6]。然而，F(xiàn)SC中的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子——生氰糖苷(cyanogenic glycosides,CGs)，極大地限制了其在動(dòng)物飼糧中的應(yīng)用[7-8]。研究表明，發(fā)酵處理可以脫除UPFI(如棉籽餅粕、菜籽餅粕、亞麻籽餅粕等)中抗?fàn)I養(yǎng)因子并改善營(yíng)養(yǎng)組成[9]。已有的關(guān)于發(fā)酵亞麻籽餅粕的研究[10-12]多關(guān)注CGs的脫除效果，對(duì)發(fā)酵后亞麻籽餅粕營(yíng)養(yǎng)組成變化的研究較少，而且發(fā)酵菌株多為酵母、曲霉等真菌類，鮮有枯草芽孢桿菌等細(xì)菌類發(fā)酵菌株。目前尚未有發(fā)酵亞麻籽餅粕對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、免疫及抗氧化功能影響的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以亞麻籽餅(flaxseed cake,FSC)為唯一發(fā)酵底物，以枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌株，優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵亞麻籽餅(solid-state-fermentation flaxseed cake,SFFSC)的制備工藝，并探究SFFSC對(duì)1～21日齡肉雞生長(zhǎng)性能、免疫及抗氧化功能的影響，以期為UPFI的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

發(fā)酵菌種：枯草芽孢桿菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所單胃動(dòng)物飼料創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供，該菌在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)的登記號(hào)為18230。

培養(yǎng)基：細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供。

發(fā)酵底物：FSC由呼和浩特市某生物科技有限公司提供。

好氧發(fā)酵袋：由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所單胃動(dòng)物飼料創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)明制作。

試驗(yàn)動(dòng)物：1日齡科寶肉公雞由北京大發(fā)正大有限公司提供。

1.2 SFFSC制備工藝優(yōu)化

1.2.1 單因素試驗(yàn)

采用控制變量法，分別探究發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、料水比、接種量對(duì)枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵處理FSC脫除CGs的影響。以CGs含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，每個(gè)單因素設(shè)5個(gè)水平，每個(gè)水平設(shè)3個(gè)重復(fù)。具體方法如下：保持接種量10%、料水比1.0∶0.8、發(fā)酵溫度37 ℃不變，設(shè)定發(fā)酵時(shí)間分別為24、36、48、60、72 h，探究發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響；保持接種量10%、料水比1.0∶0.8、發(fā)酵時(shí)間72 h不變，設(shè)定發(fā)酵溫度分別為31、33、35、37、39 ℃，探究發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響；保持接種量為10%、發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間72 h不變，設(shè)定料水比分別為1.0∶0.6、1.0∶0.7、1.0∶0.8、1.0∶0.9、1.0∶1.0，探究料水比對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響；保持發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時(shí)間72 h、料水比1∶0.8不變，設(shè)定接種量分別為2%、6%、10%、14%、18%，探究接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響。

1.2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵FSC的工藝進(jìn)行優(yōu)化。以CGs含量為指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵溫度(B)、料水比(C)、接種量(D)4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，進(jìn)行3水平4因素正交試驗(yàn)，表1為L(zhǎng)9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)和擴(kuò)大試驗(yàn)

按照優(yōu)化的發(fā)酵工藝進(jìn)行驗(yàn)正試驗(yàn)，設(shè)置3個(gè)重復(fù)并測(cè)定發(fā)酵后FSC中CGs含量。按照優(yōu)化的發(fā)酵工藝，將發(fā)酵底物擴(kuò)大至30 kg進(jìn)行擴(kuò)大試驗(yàn)。發(fā)酵組：發(fā)酵時(shí)間72 h、發(fā)酵溫度39 ℃、料水比1.0∶0.6、接種量4%；對(duì)照組：FSC不進(jìn)行任何處理。每組3個(gè)重復(fù)，發(fā)酵后的樣品常溫自然風(fēng)干。取擴(kuò)大試驗(yàn)中各組樣品測(cè)定CGs含量并計(jì)算CGs的脫毒率，同時(shí)測(cè)定粗蛋白質(zhì)、多肽、粗脂肪和粗纖維含量。

CGs脫毒率(%)=100×(對(duì)照組CGs含量-
發(fā)酵組CGs含量)/對(duì)照組CGs含量。

1.3 SFFSC對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、免疫及抗氧化功能的影響

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)飼糧

選取180只1日齡健康科寶肉公雞，按初始體重?zé)o差異原則隨機(jī)分成3個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞。試驗(yàn)周期為21 d。對(duì)照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂含10%FSC(FSC組)和10%SFFSC(SFFSC組)的試驗(yàn)飼糧。基礎(chǔ)飼糧與試驗(yàn)飼糧均參考《雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 33—2004)配制，飼糧營(yíng)養(yǎng)水平根據(jù)中國(guó)飼料數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)計(jì)算而得，各飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

1.3.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口中試基地進(jìn)行，開(kāi)展前對(duì)雞舍嚴(yán)格消毒。采用全封閉式雞舍3層重疊式籠養(yǎng)，每籠10只雞。第1～3天每天24 h光照，第3天后均為23 h光照。飼糧為顆粒狀，自由采食；乳頭式飲水器，自由飲水。水循環(huán)式暖氣供熱，前3 d雞舍溫度維持在33 ℃，此后每周降低2～3 ℃，直到24 ℃，并維持在24 ℃，相對(duì)濕度控制在50%左右。試驗(yàn)肉雞飼養(yǎng)管理和雞舍衛(wèi)生管理均按常規(guī)飼養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行。每天進(jìn)行健康觀察，記錄死亡只數(shù)、時(shí)間及原因，按時(shí)記錄損料、余料以及各項(xiàng)生長(zhǎng)性能指標(biāo)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 FSC與SFFSC中營(yíng)養(yǎng)成分及CGs含量的測(cè)定

參照GB/T 6435—2014，采用鼓風(fēng)干燥箱測(cè)定干物質(zhì)(dry matter,DM)含量。采用杜馬斯全自動(dòng)定氮儀測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量。采用濾袋法測(cè)定粗纖維含量。采用索氏抽提法測(cè)定粗脂肪含量。參照GB/T 22492—2008的測(cè)定方法測(cè)定多肽含量。

參考GB/T 13084—2006的比色法測(cè)定CGs含量，具體步驟如下：準(zhǔn)確稱取10 g(精確到0.001 g)樣品于500 mL三角平底蒸餾燒瓶中，加入250 mL去離子水，封口，在室溫放置4 h后，加入20 mL乙酸鋅溶液和2.0 g酒石酸，迅速連接于HCA-300多功能蒸餾器，進(jìn)行蒸餾。將冷凝管下端插入盛有20 mL 20 g/L氫氧化鈉溶液的250 mL錐形瓶液面下，收集蒸餾液約150 mL時(shí)，取下錐形瓶，將錐形瓶收集的蒸餾液完全轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，用去離子水定容。量取10 mL容量瓶溶液置于25 mL比色管中，作為試樣溶液。試樣溶液中加1 mL 10 g/L氫氧化鈉溶液和1滴酚酞指示液，用乙酸溶液緩慢調(diào)至紅色褪去，加5 mL磷酸鹽緩溶液，37 ℃恒溫水浴鍋中保溫10 min，加入0.25 mL氯胺T溶液，加塞振蕩混合均勻，放置5 min。分別加入5 mL異煙酸-吡唑酮溶液，加去離子水至25 mL，混勻。37 ℃恒溫水浴鍋放置40 min，用2 cm比色杯，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，于波長(zhǎng)638 nm處測(cè)定吸光度。

1.4.2 生長(zhǎng)性能

分別于肉雞1和21日齡時(shí)以重復(fù)為單位稱重，記錄總采食量、肉雞末體重(final body weight,FBW)，計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。

1.4.3 血清免疫和抗氧化指標(biāo)

在肉雞21日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)挑選與該重復(fù)平均體重接近的肉雞1只，采血10 mL，室溫靜置1 h后，3 000 r/min離心15 min后分離血清。采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總蛋白(TP)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量。血清總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和總抗氧化能力(T-AOC)均采用試劑盒測(cè)定，試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，按照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，對(duì)組間差異顯著的指標(biāo)，使用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

如圖1所示，不同發(fā)酵時(shí)間下發(fā)酵FSC中CGs含量差異顯著(P<0.05)，在一定范圍內(nèi)隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵FSC中CGs含量逐漸降低，而且下降幅度越來(lái)越小，正交試驗(yàn)中發(fā)酵時(shí)間可設(shè)置為48、60、72 h。如圖2所示，不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵FSC中CGs含量差異顯著(P<0.05)，在一定范圍內(nèi)隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵FSC中CGs含量逐漸降低，而且下降幅度越來(lái)越小，正交試驗(yàn)中發(fā)酵溫度可設(shè)置為35、37、39 ℃。如圖3所示，料水比為1.0∶0.6、1.0∶0.7、1.0∶0.8時(shí)發(fā)酵FSC中CGs含量相近且顯著低于料水比為1.0∶0.9、1.0∶1.0時(shí)(P<0.05)，在一定范圍內(nèi)隨著料水比的降低，發(fā)酵FSC中CGs含量先保持不變后上升，正交試驗(yàn)中料水比可設(shè)置為1.0∶0.6、1.0∶0.7、1.0∶0.8。如圖4所示，接種量6%時(shí)發(fā)酵FSC中CGs含量顯著低于接種量為2%、10%、14%、18%時(shí)(P<0.05)，在一定范圍內(nèi)隨著接種量的增加，發(fā)酵FSC中CGs含量先下降后上升，正交試驗(yàn)中接種量可設(shè)置在6%左右。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

固態(tài)發(fā)酵FSC工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析見(jiàn)表3，由極差(R)值可知，按影響力大小，各發(fā)酵參數(shù)可排序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度>發(fā)酵時(shí)間>接種量>料水比。發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的影響力相近且對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響較大，料水比和接種量的影響力相近且對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響較小。由K值可知，A3B3C2D3的試驗(yàn)處理可使CGs含量降到最低水平，此時(shí)發(fā)酵時(shí)間為72 h、發(fā)酵溫度為39 ℃、料水比為1.0∶0.7、接種量為8%。由表4可知，發(fā)酵時(shí)間水平3的CGs含量顯著低于時(shí)間水平1和2(P<0.05)；發(fā)酵溫度水平3的CGs含量顯著低于發(fā)酵溫度水平1和2(P<0.05)；料水比各水平間的CGs含量差異不顯著(P>0.05)；接種量各水平間的CGs含量差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)CGs含量的影響顯著(P<0.05)，因此需選取發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間最優(yōu)水平作為最終的發(fā)酵參數(shù)，即溫度為39 ℃、時(shí)間為72 h；料水比和接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響不顯著，為了節(jié)約生產(chǎn)成本，選取料水比1.0∶0.6、接種量4%作為最終的發(fā)酵參數(shù)。綜上，枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵FSC脫除CGs的最優(yōu)工藝為：發(fā)酵時(shí)間72 h、發(fā)酵溫度39 ℃、料水比1.0∶0.6、接種量4%。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵FSC中CGs含量的影響

圖3 料水比對(duì)發(fā)酵FSC中CGs含量的影響

圖4 接種量對(duì)發(fā)酵FSC中CGs含量的影響

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)和擴(kuò)大試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得CGs含量為(33.42±2.05) mg/kg，經(jīng)方差分析，其與正交試驗(yàn)中處理A3B3C2D1的CGs含量[(38.78±0.20) mg/kg]差異不顯著(P>0.05)。擴(kuò)大試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，發(fā)酵組CGs含量為(34.78±1.86) mg/kg，經(jīng)方差分析，其與正交試驗(yàn)中處理A3B3C2D1的CGs含量[(38.78±0.20) mg/kg]差異不顯著(P>0.05)。FSC經(jīng)優(yōu)化發(fā)酵工藝處理后，CGs含量由(548.47±8.76) mg/kg降至(34.78±1.86) mg/kg，CGs脫除率達(dá)到93.66%；同時(shí)，F(xiàn)SC營(yíng)養(yǎng)組成得到改善，粗蛋白質(zhì)、多肽、粗脂肪含量均顯著提高(P<0.05)，粗纖維含量變化不顯著(P>0.05)。

2.4 SFFSC對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，SFFSC組1～21日齡肉雞FBW、ADG、ADFI分別顯著降低6.90%、7.26%、1.99%(P<0.05)，F(xiàn)/G顯著增加6.15%(P<0.05)；FSC組1～21日齡肉雞FBW、ADG、ADFI分別顯著降低24.69%、21.77%、10.86%(P<0.05)，F(xiàn)/G顯著增加10.77%(P<0.05)。與FSC組相比，SFFSC組1～21日齡肉雞FBW、ADG、ADFI分別顯著提高23.62%、18.54%、9.95%(P<0.05)，F(xiàn)/G顯著降低4.17%(P<0.05)。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.5 SFFSC對(duì)肉雞血清免疫指標(biāo)的影響

由表7可知，與對(duì)照組相比，SFFSC組1～21日齡肉雞血清TP、IgA、IgG含量差異不顯著(P>0.05)，IgM含量顯著提高5.26%(P<0.05)；FSC組1～21日齡肉雞血清IgG含量顯著降低20.95%(P<0.05)。與FSC組相比，SFFSC組1～21日齡肉雞血清IgG和IgM含量分別顯著提高25.38%和6.67%(P<0.05)。

2.6 SFFSC對(duì)肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，SFFSC組1～21日齡肉雞血清T-SOD活性、MDA含量、T-AOC差異不顯著(P>0.05)；FSC組1～21日齡肉雞血清T-SOD活性顯著降低3.72%(P<0.05)，MDA含量顯著增加16.29%(P<0.05)。與FSC組相比，SFFSC組1～21日齡肉雞血清T-SOD活性顯著提高4.67%(P<0.05)，MDA含量顯著降低15.97%(P<0.05)。

表5 擴(kuò)大試驗(yàn)結(jié)果(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表7 SSFFC對(duì)1～21日齡肉雞血清免疫指標(biāo)的影響

表8 SSFFC對(duì)1～21日齡肉雞血清抗氧化指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 固態(tài)發(fā)酵FSC脫除CGs的機(jī)理

亞麻籽含有的CGs主要為β-龍膽二糖丙酮氰醇(linustatin,LN)和β-龍膽二糖甲乙酮氰醇(neolinustatin,NN)[13]，榨油過(guò)程中LN和NN幾乎全部存留于FSC中且百分含量升高[14]。研究表明，LN和NN均可被β-葡萄糖苷酶水解為氰醇和葡萄糖，氰醇在中性和堿性環(huán)境中非常不穩(wěn)定，能自發(fā)分解產(chǎn)生酮化合物和氰化氫(hydrogen cyanide，HCN)，羥腈裂解酶可加速氰醇的分解[15-16]。FSC中存在β-葡萄糖苷酶，但是該酶與CGs存在于不同部位而不能接觸[17]，而且FSC中的β-葡萄糖苷酶活性低、穩(wěn)定性差且易在榨油過(guò)程中失去活性[18]。微生物(如酵母菌、細(xì)菌、霉菌等)亦能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶[19-20]。發(fā)酵過(guò)程中，微生物分泌的各種酶可破壞FSC的組織結(jié)構(gòu)，CGs與β-葡萄糖苷酶充分接觸而被水解，產(chǎn)生的HCN易揮發(fā)，從而達(dá)到FSC脫毒。CGs的脫除率與β-葡萄糖苷酶活性相關(guān)，不同微生物分泌的β-葡萄糖苷酶活性不同，其水解糖苷類物質(zhì)的能力也不同[21]。研究表明，釀酒酵母固態(tài)發(fā)酵處理FSC可脫除79.91%的CGs[10]，假絲酵母和黑曲霉混菌發(fā)酵FSC可脫除73.22% CGs[11]，菌株多枝橫梗霉(Lichtheimiaramosa)發(fā)酵FSC可脫除89.00%的CGs[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SC經(jīng)枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵處理后，CGs含量由548.47 mg/kg降至37.78 mg/kg，脫除率為93.66%，表明本研究所用枯草芽孢桿菌脫除CGs的能力較強(qiáng)。

3.2 固態(tài)發(fā)酵FSC工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)結(jié)果為正交試驗(yàn)因素水平范圍的選擇提供了參考依據(jù)。發(fā)酵時(shí)間是影響發(fā)酵進(jìn)程與結(jié)果的重要因素，主要通過(guò)影響發(fā)酵菌株的數(shù)量以及產(chǎn)酶量而間接影響發(fā)酵結(jié)果[22]，發(fā)酵時(shí)間不足會(huì)導(dǎo)致抗?fàn)I養(yǎng)因子脫除量降低，而發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)增加生產(chǎn)成本。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，發(fā)酵FSC中CGs含量逐漸降低，而且下降幅度越來(lái)越?。徽辉囼?yàn)結(jié)果表明，不同發(fā)酵時(shí)間下CGs脫除量存在顯著差異，發(fā)酵72 h后，CGs得到有效脫除，若此時(shí)繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，CGs的脫除量不會(huì)發(fā)生顯著變化，而且還會(huì)因過(guò)度發(fā)酵導(dǎo)致FSC中其他營(yíng)養(yǎng)成分的損失，同時(shí)增加發(fā)酵成本。發(fā)酵溫度可通過(guò)直接影響菌種的代謝速率、營(yíng)養(yǎng)需求、酶活性而改變發(fā)酵進(jìn)程和結(jié)果，同時(shí)可通過(guò)影響物質(zhì)的溶解性、擴(kuò)散和運(yùn)輸間接影響發(fā)酵結(jié)果[23]，而且不同菌種所需發(fā)酵溫度不同[24-25]。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵FSC中CGs含量逐漸降低，而且下降幅度越來(lái)越??；正交試驗(yàn)結(jié)果表明，不同發(fā)酵溫度下CGs脫除量存在差異顯著，最適發(fā)酵溫度為39 ℃。枯草芽孢桿菌適宜生長(zhǎng)的溫度較高[26]，因而決定了固態(tài)發(fā)酵工藝的溫度也較高。發(fā)酵底物初始含水量對(duì)菌種的生長(zhǎng)代謝影響很大[27]，含水量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵原料黏性增加，料間空隙減少，換氣量減少，生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的廢氣會(huì)影響菌株的正常生長(zhǎng)，從而引起發(fā)酵停滯。研究表明，隨著含水量的增加，固態(tài)發(fā)酵棉籽粕脫除棉酚的效果先升高后降低[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)隨著料水比的降低，發(fā)酵FSC中CGs含量先保持不變后上升，最適料水比為1.0∶0.6。適宜的接種量對(duì)保證發(fā)酵效果具有重要意義[23]，接種量不足，菌株細(xì)胞量減少，相關(guān)酶分泌量下降，嚴(yán)重降低發(fā)酵效率，而且接種量過(guò)少還會(huì)因發(fā)酵菌株未能及時(shí)繁殖到一定數(shù)量引起雜菌污染；而接種量過(guò)多，菌體生長(zhǎng)繁殖過(guò)快則會(huì)提前進(jìn)入穩(wěn)定期甚至衰亡期，從而影響發(fā)酵效果。韋濤等[29]利用納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵小米糠的研究結(jié)果表明，隨著接種量的增加，發(fā)酵效果先升高后降低。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)隨著接種量的增加，發(fā)酵FSC中CGs含量先下降后上升，最適接種量在6%附近；正交試驗(yàn)結(jié)果表明，4%、6%、8%的接種量下CGs脫除量差異不顯著，因此確定最優(yōu)接種量為4%。

3.3 SFFSC對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的影響

CGs具有苦味能降低飼糧適口性[30]，從而使動(dòng)物采食量下降。本研究發(fā)現(xiàn)，SFFSC組1～21日齡肉雞ADFI顯著高于FSC組。FSC經(jīng)固態(tài)發(fā)酵處理后，CGs含量降低，適口性得到改善，從而提高了肉雞的ADFI。動(dòng)物采食大量未經(jīng)處理的FSC會(huì)引起急性中毒，CGs進(jìn)入動(dòng)物消化道內(nèi)可分解產(chǎn)生HCN，而氰基(CN-1)可與細(xì)胞色素氧化酶的3價(jià)鐵結(jié)合而阻斷細(xì)胞呼吸鏈，從而導(dǎo)致動(dòng)物因細(xì)胞窒息而死亡[31]；此外，若動(dòng)物攝入CGs未達(dá)到急性中毒劑量，亦會(huì)引起慢性中毒，HCN在動(dòng)物體內(nèi)解毒過(guò)程中產(chǎn)生的硫氰酸鹽可導(dǎo)致碘缺乏癥，如甲狀腺腫、視神經(jīng)受損及生長(zhǎng)性能下降等[14]。Zanu等[32]研究表明，飼糧中添加木薯粉(含CGs)可降低肉雞的采食量及生長(zhǎng)性能；Anjum等[33]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加5%的FSC可顯著降低肉雞的生長(zhǎng)性能；Pekel等[34]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加10%的亞麻籽可顯著降低肉雞的生長(zhǎng)性能。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，F(xiàn)SC組肉雞FBW、ADG和ADFI顯著降低，這與前期眾多報(bào)道一致；FSC經(jīng)固態(tài)發(fā)酵處理后CGs含量由548.47 mg/kg降至37.78 mg/kg，SFFSC組生長(zhǎng)性能顯著高于FSC組，表明固態(tài)發(fā)酵處理可有效降低FSC中CGs對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能的消極影響。飼料原料經(jīng)發(fā)酵處理后，大分子蛋白質(zhì)得到分解，多肽含量增加，益生物質(zhì)增多，營(yíng)養(yǎng)組成發(fā)生積極變化，因此發(fā)酵飼料往往能表現(xiàn)出一定的促生長(zhǎng)作用[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SC經(jīng)固態(tài)發(fā)酵處理后粗蛋白質(zhì)和多肽含量得到提高，但SFFSC組肉雞FBW、ADG、ADFI與對(duì)照組相比均有略微降低且F/G增加，即SFFSC沒(méi)有表現(xiàn)出促生長(zhǎng)作用。這可能是由于固態(tài)發(fā)酵處理并未有效降低FSC中可溶性非淀粉多糖(soluble nonstarch polysaccharide,SNSP)的含量，SFFSC組飼糧中SNSP含量過(guò)高造成了食糜的營(yíng)養(yǎng)屏障效應(yīng)[37]，從而使SFFSC并未表現(xiàn)出促生長(zhǎng)作用。

3.4 SFFSC對(duì)肉雞免疫和抗氧化功能的影響

血清TP含量間接體現(xiàn)了機(jī)體免疫水平的高低[38]，而血清IgG、IgM含量能直接反映動(dòng)物的全身免疫狀態(tài)[39]，血清中MDA含量、T-SOD活性、T-AOC是反映機(jī)體抗氧化功能的重要指標(biāo)[40]。研究表明，CGs在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的HCN在解毒過(guò)程需要消耗體內(nèi)的含硫氨基酸、硫代硫酸鹽等硫供體[41]，而體內(nèi)含硫氨基酸及其中間代謝產(chǎn)物對(duì)維持機(jī)體免疫和抗氧化功能起著重要作用[42-43]，因此FSC中CGs可導(dǎo)致肉雞免疫和抗氧化功能的降低。本研究發(fā)現(xiàn)，SFFSC組與對(duì)照組21日齡肉雞血清TP含量相近且均高于FSC組，SFFSC組21日齡肉雞血清IgM含量顯著高于對(duì)照組和FSC組，SFFSC組21日齡肉雞血清IgG含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異但顯著高于FSC組；SFFSC組21日齡肉雞血清T-SOD活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異且均顯著高于FSC組，SFFSC組21日齡肉雞血清MDA含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異且均顯著低于FSC組。由此表明，枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵處理FSC可有效降低CGs對(duì)肉雞免疫和抗氧化功能的不利影響。

4 結(jié) 論

① 枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵FSC最優(yōu)工藝為：發(fā)酵時(shí)間72 h、發(fā)酵溫度39 ℃、料水比1.0∶0.6、接種量4%。

② FSC經(jīng)優(yōu)化工藝發(fā)酵處理后，CGs脫除率為93.66%，營(yíng)養(yǎng)組成得到改善。

③ 本試驗(yàn)建立的固態(tài)發(fā)酵工藝可有效降低FSC對(duì)1～21日齡肉雞生長(zhǎng)性能、免疫及抗氧化功能的不利影響。