吳峰洋 崔 嘉 楊新宇 陳寶江,2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，保定071000；2.河北省牛羊胚胎技術創(chuàng)新中心，保定071000)

玉米赤霉烯酮(ZEA)是主要由鐮刀菌菌株產(chǎn)生的，具有類雌激素活性和多種毒性作用的代謝產(chǎn)物，是豬飼糧中最常見的霉菌毒素之一。中國氣候復雜多樣，領土遼闊廣大，谷物在田間生長、收獲加工以及運輸和貯存過程中都容易受到ZEA的污染[1]。王國強[2]對從全國12個省市收集的飼料樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)ZEA陽性檢出率為92.59%，ZEA在陽性樣品中的中值為172.2 μg/kg，平均值為332.2 μg/kg，最高值為3 123.8 μg/kg，高于《飼料衛(wèi)生標準》(GB 13078—2017)的部分限量要求。子宮是重要的繁殖器官，子宮的生長發(fā)育及功能狀態(tài)直接影響母豬繁殖潛力的發(fā)揮[3]。生長激素受體(GHR)是一種單鏈跨膜糖蛋白，可通過與生長激素特異性結合，以自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮生長調(diào)節(jié)作用[4]。已有研究表明，ZEA可以促進母豬子宮的發(fā)育，但是通過GHR調(diào)節(jié)子宮發(fā)育的報道較少。因此，本試驗以對ZEA較敏感的青年母豬為對象，研究ZEA對子宮發(fā)育、生長激素(GH)分泌及GHR分布與表達的影響，為探討ZEA繁殖毒性機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ZEA購自Triplebond公司(加拿大)，純度保證值≥98%。

1.2 試驗設計及飼糧

選擇胎次和體重[(23.20±0.68) kg]相近的長×大二元青年母豬48頭，隨機分為4組，每組12個重復，每個重復1頭。對照組(CON組)飼喂基礎飼糧，試驗組(T1、T2、T3組)分別飼喂在基礎飼糧中添加200、800、1 600 μg/kg ZEA的試驗飼糧。預試期7 d，正試期40 d。試驗前對豬舍進行清潔和消毒，母豬采用分欄飼養(yǎng)，自由采食和飲水，常規(guī)飼養(yǎng)管理。

青年母豬飼喂玉米-豆粕型飼糧，不添加抗生素及脫霉劑?；A飼糧參照《豬飼養(yǎng)標準》(NY/T 65—2004)進行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

飼糧于試驗開始前配制完成，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測，各組飼糧中嘔吐毒素(DON)、伏馬毒素(FB)和黃曲霉毒素B1(AFB1)含量均符合《飼料衛(wèi)生標準》(GB 13078—2017)的限量要求，ZEA的含量分別為52.37、241.60、825.20和1 634.46 μg/kg。ZEA、DON和AFB1試劑盒購自深圳芬德生物技術有限公司，F(xiàn)B試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 血清及組織指標

于正試期結束后，試驗母豬空腹12 h，然后每組隨機選擇8頭進行前腔靜脈采血，每頭采集15 mL，將血液注入離心管內(nèi)傾斜靜置，待血凝后3 000 r/min離心10 min，分離血清。每組隨機選取4頭試驗母豬進行屠宰，取子宮組織樣品，血清及部分組織于-80 ℃條件下冷凍保存待測。采用ELISA法測定血清及子宮組織中GH及ZEA含量，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，按說明書指示進行操作。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

1.3.2 生長性能及子宮指數(shù)

試驗開始時稱量各組母豬的體重獲得初始體重，試驗結束時再次稱量獲得終末體重，并根據(jù)試驗天數(shù)計算獲得平均日增重(ADG)。統(tǒng)計試驗期間的各組母豬的采食量，計算獲得平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。宰前稱量青年母豬宰前活重，宰后稱量子宮組織重計算器官指數(shù)。

子宮指數(shù)(g/kg)=子宮鮮重(g)/宰前活重(kg)。

1.3.3 子宮組織形態(tài)觀察

取子宮新鮮組織于10%中性甲醛固定液中固定，經(jīng)脫水，透明，浸蠟，包埋，切片處理后用蘇木素-伊紅染液染色，經(jīng)脫水，透明，中性樹膠封固后使用顯微攝像系統(tǒng)進行切片觀察和圖像采集。

1.3.4 子宮組織基因相對表達量

根據(jù)GenBank中已報道的豬的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、生長激素受體(GHR)、Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)和信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)基因序列，和前人文獻中已發(fā)表的引物序列，使用Primer 6.0軟件設計相應特異性引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表2 實時熒光定量PCR反應引物序列

將子宮樣品取出50～100 mg，提取總RNA，具體操作按Trizol試劑盒(Invitrogen公司)說明進行，用RNA濃度儀(ThermoNanoDrop Lite)檢測RNA濃度。用反轉錄試劑盒(Vazyme公司，R323-01，20 μL反應體系)進行反轉錄，具體操作說明書指示進行。按熒光定量試劑盒(Vazyme公司，Q111-02，20 μL反應體系)具體操作按說明書指示進行。擴增條件為：95 ℃預變性5 min；循環(huán)反應95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每個樣品作3個重復，目標基因表達情況：mRNA相對表達量=2-△△Ct。

1.3.5 免疫組織化學法檢測

取子宮新鮮組織迅速于4%多聚甲醛固定液中固定，經(jīng)脫水、修剪、包埋、切片、染色、封片后，使用顯微攝像系統(tǒng)進行切片觀察和圖像采集。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測

取子宮組織提取總蛋白，經(jīng)樣品蛋白質(zhì)濃度測定(BCA法)、樣品測定、蛋白質(zhì)變性、上樣、電泳、轉膜、封閉、孵育抗體、顯影、定影后統(tǒng)計結果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Excel 2016和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用one-way ANOVA檢驗各組數(shù)據(jù)間顯著性差異，用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05

2 結果與分析

2.1 ZEA對青年母豬血清和子宮組織GH含量的影響

由表3可知，各組間血清及子宮組織中GH含量均無顯著差異(P>0.05)。

表3 ZEA對青年母豬血清和子宮組織GH含量的影響

2.2 ZEA對青年母豬子宮組織中ZEA含量的影響

由表4可知，各組間子宮組織中ZEA含量均無顯著差異(P>0.05)，與CON組相比，T2和T3組均升高，分別升高了7.96%和10.40%。

表4 ZEA對青年母豬子宮組織中ZEA含量的影響

2.3 ZEA對青年母豬生長性能及子宮指數(shù)的影響

由表5可知，各組間初始體重、終末體重、ADG、ADFI及F/G均無顯著差異(P>0.05)。與

CON組相比，T2組青年母豬的子宮指數(shù)顯著升高(P<0.05)，T3組極顯著升高(P<0.01)，分別升高了152%和186%。

表5 ZEA對青年母豬生長性能及子宮指數(shù)的影響

2.4 ZEA對青年母豬子宮結構形態(tài)的影響

由圖1可知，CON組子宮內(nèi)膜、肌層和外膜結構較為清晰；子宮內(nèi)膜上皮細胞矮柱狀，排列較規(guī)則，未見明顯變性壞死或增生；子宮內(nèi)膜固有層基質(zhì)細胞排列較緊密，多量子宮腺分布，子宮腺結構正常，未見明顯擴張，毛細血管較豐富。與CON組相比，T1組子宮肌層和內(nèi)膜增厚，固有層近上皮區(qū)域細胞排列較稀疏，少量淋巴細胞散在浸潤。T2和T3組子宮肌層和內(nèi)膜增厚，子宮腺數(shù)量增多，毛細血管增多，局部固有層內(nèi)有細胞灶性浸潤，以淋巴細胞為主，部分上皮細胞變性壞死，見壞死細胞胞質(zhì)空泡化，胞核固縮。上述結果表明，ZEA可以使子宮肌層和內(nèi)膜增厚，腺體數(shù)量增多，毛細血管增多，使子宮發(fā)育異常。ZEA還可以使子宮產(chǎn)生炎性反應(淋巴細胞浸潤)及上皮細胞變性壞死，且隨ZEA劑量增大，損傷作用增強。

2.5 ZEA對青年母豬子宮組織GHR、JAK2、STAT3 mRNA相對表達量的影響

由圖2可知，與CON組相比，T2和T3組子宮GHRmRNA相對表達量以及T2組JAK2 mRNA相對表達量均顯著升高(P<0.05)，STAT3 mRNA相對表達量各組間無顯著差異(P>0.05)。

2.6 ZEA對青年母豬子宮組織GHR免疫陽性分布的影響

由表6可知，各組間母豬子宮組織GHR的平均光密度值沒有顯著差異(P>0.05)，但T2和T3組均高于CON組，其中T3組有升高的趨勢(P=0.08)。

圖3可知，GHR的免疫陽性物質(zhì)主要分布于子宮的血管、基質(zhì)細胞、子宮腺、固有層和肌層細胞的細胞質(zhì)及細胞間質(zhì)中，陽性細胞呈黃色或棕黃色。ZEA對GHR在青年母豬子宮中的分布與定位無明顯的影響，但各試驗組中隨著子宮肌層和內(nèi)膜增厚，子宮腺數(shù)量增多，毛細血管增多，免疫陽性物質(zhì)分布進一步增多，免疫陽性強度進一步增大。由此可見，ZEA可以使青年母豬子宮內(nèi)GHR免疫陽性物質(zhì)分布增多，免疫陽性強度增大，來促進子宮的發(fā)育。

圖CON-1、T1-1、T2-1、T3-1與圖CON-2、T1-2、T2-2、T3-2分別為CON組與各試驗組在100與400倍下獲得的子宮組織視野。圖中綠色箭頭指示淋巴細胞，黃色箭頭指示炎細胞灶性浸潤，紅色箭頭指示上皮細胞壞死。100和400倍下的比例尺分別為：100和10 μm。

2.7 ZEA對青年母豬子宮GHR蛋白表達量的影響

由圖4和圖5可知，各組間青年母豬子宮組織的GHR蛋白表達量沒有顯著差異(P>0.05)，但各試驗組灰度值均高于CON組，其中T2組有升高的趨勢(P=0.09)。

GHR:生長激素受體 growth hormone receptor;JAK2:Janus蛋白酪氨酸激酶2 Janus activated kinase 2;STAT3:信號轉導與轉錄激活因子3 signal transducer and activator of transcriptions 3。

3 討 論

3.1 ZEA對青年母豬血清和子宮GH及ZEA含量的影響

GH是由垂體分泌的肽類激素，具有促進蛋白質(zhì)合成、影響脂肪和礦物質(zhì)代謝等生物功能，對子宮的生長發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用[8]。研究表明，ZEA及其代謝產(chǎn)物可以影響垂體的功能狀態(tài)，繼而改變GH的分泌來影響骨骼和器官的發(fā)育。Thomas等[9]報道，玉米赤霉醇可以通過影響羊垂體轉錄因子Pit-1、生長激素釋放激素受體以及GHmRNA的表達來促進GH的分泌。但本試驗中，各組青年母豬血清和子宮組織中GH含量均無顯著差異，說明ZEA處理對青年母豬的GH分泌沒有顯著影響，結果差異可能和試驗動物及試驗材料的差異有關。Olivares等[10]也發(fā)現(xiàn)玉米赤霉醇對羔羊血清的GH含量沒有顯著影響。

表6 ZEA對青年母豬子宮GHR平均光密度的影響

圖CON-1、T1-1、T2-1、T3-1與圖CON-2、T1-2、T2-2、T3-2分別為對照組與各試驗組在400倍下獲得的子宮組織的2個視野。圖中ML表示肌層，UG表示子宮腺，LP表示固有層，LE表示腔上皮。圖中比例尺均為40 μm。

圖4 ZEA對青年母豬子宮GHR蛋白表達量的影響

圖5 ZEA對青年母豬子宮GHR蛋白灰度值的影響

ZEA具有類雌激素活性和多種毒性作用，母豬攝入ZEA后經(jīng)胃腸吸收后，可在子宮、肝臟、腎臟等組織中沉積[11]，發(fā)揮毒性作用，ZEA導致的子宮疾病及機能障礙與之有關。本試驗中，各組青年母豬子宮組織中ZEA含量未出現(xiàn)顯著差異，可能和試驗時間相對較短有關。Gajecka等[11]飼喂母豬被ZEA污染的飼糧持續(xù)1年，發(fā)現(xiàn)子宮組織中ZEA的含量顯著升高。本試驗中，T2和T3組青年母豬子宮ZEA含量較CON組均提高7%以上，可見ZEA沉積量與飼糧添加量有一定的正相關性，這可能是ZEA導致子宮異常發(fā)育的原因之一。

3.2 ZEA對青年母豬生長性能及子宮指數(shù)和組織形態(tài)的影響

本試驗中ZEA對青年母豬的生長性能無顯著影響。Fu等[12]飼喂母豬被ZEA污染的飼糧持續(xù)21 d，也發(fā)現(xiàn)對ADG、ADFI和F/G均無顯著影響。這可能和消化系統(tǒng)不是ZEA毒性作用的主要靶器官有關。這說明ZEA對生長性能的影響不是造成子宮異常發(fā)育的主要原因。

ZEA對子宮組織生長發(fā)育的促進作用已有報道，如周敏等[13]在小母豬的飼糧中添加0.5、1.0和1.5 mg/kg ZEA，發(fā)現(xiàn)ZEA可使子宮內(nèi)膜和肌層顯著增厚，腺體數(shù)量顯著增多，腺體密度顯著增大，使子宮發(fā)育異常。本試驗中，各試驗組青年母豬的子宮指數(shù)均高于或顯著高于CON組，且經(jīng)組織學觀察發(fā)現(xiàn)，試驗組青年母豬子宮組織出現(xiàn)肌層和內(nèi)膜增厚、腺體增多、毛細血管增多等變化。本試驗中，ZEA處理對青年母豬的ADG、ADFI以及F/G均無顯著影響，結合血清和子宮組織中GH含量的變化，說明影響生長性能及調(diào)節(jié)GH分泌可能不是ZEA促進青年母豬子宮發(fā)育的主要作用途徑。ZEA可以通過調(diào)控子宮內(nèi)生長發(fā)育相關基因及蛋白的表達來使子宮發(fā)育異常，如ZEA可以使母豬子宮內(nèi)增殖細胞核抗原表達量升高，并激活轉化生長因子-β1(TGF-β1)/Smad蛋白3(Smad3)信號通路[14]。組織學觀察還發(fā)現(xiàn)ZEA可以使青年母豬子宮出現(xiàn)炎性反應和上皮細胞變性壞死。這與ZEA能通過c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路引起炎癥反應及損傷，以及ZEA能誘導機體產(chǎn)生過量的活性氧引起氧化應激及損傷有關[15-16]。

3.3 ZEA對青年母豬子宮組織GHR、JAK2、STAT3 mRNA相對表達量的影響

GH在組織和細胞水平發(fā)揮作用，需要與靶細胞膜表面的GHR結合使GHR二聚體化，激活JAK2后使GHR胞內(nèi)結構與及自身酪氨酸殘基磷酸化，進一步激活STAT3，誘導蛋白質(zhì)因子磷酸化，產(chǎn)生級聯(lián)放大效應，將生物信號傳導到細胞內(nèi)引發(fā)生物效應，參與調(diào)節(jié)子宮組織的生長發(fā)育等生理過程[16-17]。組織中GHR的含量及功能影響GH生物效應的發(fā)揮，如GHR基因突變可使男童體內(nèi)的GH的生物效應降低，導致男童身材矮小[18]。JAK2及STAT3是JAK-STAT信號通路中的重要基因，在細胞的生長和增殖過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。Feng等[19]報道，GH可通過GHR-JAK2-STAT3途徑促進人子宮內(nèi)膜腺細胞的增殖，如果使用GHR抑制劑AG490，則GHR、JAK2和STAT3基因表達下調(diào)，GH生物效應降低，細胞增殖速率降低。

本試驗中，各試驗組青年母豬子宮組織GHR、JAK2和STAT3 mRNA相對表達量均高于或顯著高于CON組，說明ZEA可能通過上調(diào)GHRmRNA相對表達量，提高GH與GHR的結合率，并激活下游JAK-STAT信號通路，使JAK2和SATA3 mRNA相對表達量上調(diào)，增強了GH的生物效應。GH可以通過GHR-JAK-STAT途徑促進子宮內(nèi)膜細胞和子宮內(nèi)膜腺細胞等細胞的增殖和血管的生成，使子宮指數(shù)出現(xiàn)極顯著升高，子宮肌層和內(nèi)膜增厚，子宮腺和毛細血管數(shù)量增多，子宮發(fā)育異常[19-20]。Zhou等[21]在斷奶母豬飼糧中添加1 mg/kg的ZEA，也發(fā)現(xiàn)子宮指數(shù)顯著增大，子宮內(nèi)膜變厚，GHRmRNA相對表達量顯著升高。

3.4 ZEA對青年母豬子宮組織GHR蛋白陽性分布及表達的影響

在實時熒光定量PCR的基礎上進一步進行了免疫組織化學和Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)ZEA可以使青年母豬子宮內(nèi)GHR免疫陽性物質(zhì)分布增多，免疫陽性強度增大，并且T2組GHR蛋白灰度值有升高的趨勢。這說明ZEA可能通過上調(diào)GHR蛋白的表達水平，增強GH的生物作用，來促進子宮的發(fā)育。Wathes等[22]報道，GHR可以促進牛子宮發(fā)育。而子宮發(fā)育加快可能會增加子宮發(fā)育不全、早衰、功能異常和子宮肌瘤等疾病的患病風險，降低青年母豬的繁殖潛力[23]。Zhou等[21]在斷奶母豬的飼喂試驗中發(fā)現(xiàn)，1 mg/kg的ZEA可以使子宮GHR蛋白表達量顯著升高。戴美玲[6]報道，飼喂斷奶仔豬1.04 mg/kg的ZEA可以促進卵巢發(fā)育并使GHRmRNA的表達量及蛋白免疫陽性強度增大，這與本試驗結果一致。

3.5 ZEA對青年母豬繁殖性能的影響

ZEA具有類雌激素活性可以特異性的與雌激素受體結合調(diào)控靶基因和蛋白質(zhì)的轉錄與合成，產(chǎn)生生殖毒性作用，使母豬子宮組織發(fā)育異常，子宮細胞凋亡，子宮機能下降，是母豬繁殖性能降低的重要原因之一，持續(xù)危害著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[24-26]。本試驗的結果表明，ZEA對GH的分泌無顯著影響，但可以通過調(diào)控GHR、JAK2和STAT3 mRNA相對表達和蛋白的表達來增強GH的生物效應，導致子宮異常發(fā)育，是ZEA生殖毒性作用的途徑之一。同時，T2和T3組青年母豬子宮還出現(xiàn)淋巴細胞浸潤以及上皮細胞壞死等病理變化。子宮異常發(fā)育及出現(xiàn)病理變化，將增加子宮發(fā)育不全、早衰、功能異常以及多種疾病的患病風險，導致母豬的繁殖性能降低[23]。如Zhao等[27]在斷奶雌鼠的的飼喂試驗中發(fā)現(xiàn)，40 mg/kg的ZEA可以使雌鼠子宮發(fā)育異常，子宮機能降低，受精減少，胚胎運輸和植入前發(fā)育延遲，胚胎著床中斷，繁殖性能下降。高文博[28]在后備母豬飼糧中添加1 mg/kg的ZEA也發(fā)現(xiàn)，子宮發(fā)育異常并產(chǎn)生氧化應激損傷。此外，GH通過結合GHR激活下游JAK-STAT信號通路除了參與調(diào)節(jié)動物的生長發(fā)育外，還參與代謝、生殖系統(tǒng)、心血管以及消化系統(tǒng)等多種生理和病理過程的調(diào)節(jié)[29]。ZEA通過此途徑發(fā)揮子宮毒性作用，影響青年母豬的繁殖性能。

4 結 論

ZEA對青年母豬的生長性能以及血清和子宮GH和ZEA的含量均無顯著影響，但是可通過升高GHR、JAK2和STAT3 mRNA相對表達量、增強GHR的免疫陽性、升高蛋白表達量來增強GH的生物效應，使子宮發(fā)育異常，導致子宮指數(shù)出現(xiàn)極顯著升高，子宮肌層和內(nèi)膜增厚，子宮腺和毛細血管數(shù)量增多。