王子微 高亞男 王加啟 鄭 楠*

(1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農業(yè)部奶產品質量安全風險評估實驗室，北京100193；2.農業(yè)部奶及奶制品質量監(jiān)督檢驗測試中心，北京100193；3.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193)

霉菌毒素是由鐮刀菌、曲霉和青霉等絲狀真菌產生的低分子質量次級代謝產物，廣泛存在于谷類、牛奶和雞蛋等農畜產品中[1]。據估計，世界上25%的農作物和多種類型的食品會受到霉菌毒素相關的污染[2]。霉菌毒素可通過攝入、吸入或皮膚接觸等方式危害人和動物的健康，具有致癌性、遺傳毒性、肝臟毒性、腎臟毒性、雌激素樣作用、生殖障礙、免疫抑制以及刺激皮膚等毒理效應[3]。一種真菌能夠同時產生多種霉菌毒素，食品和飼料可同時或連續(xù)被幾種真菌污染，而如今人們的飲食日益豐富化多元化，這使得霉菌毒素的共污染廣為發(fā)生[4]。本文綜述了牛奶中霉菌毒素共污染及聯合毒理效應的研究進展，以期為牛奶和奶制品中霉菌毒素共污染風險評估及相關標準的建立和完善提供參考。

1 牛奶中霉菌毒素共污染情況

牛奶的消費量很高，匯總來自于77個國家，涵蓋68.9萬人信息的75項調查發(fā)現，2010年全球人均牛奶消費為0.57份/d(95%不確定性區(qū)間：0.39～0.83)，其中瑞典和冰島的成年人(≥20歲)每天飲用的牛奶量最多，為1.60份/d(95%不確定性區(qū)間：1.4～1.8)[5]。牛奶富含蛋白質、維生素、脂肪、礦物質等重要營養(yǎng)素，在各個年齡段的飲食中都很重要。嬰幼兒是牛奶的最大消費群體，其免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，相比成人來說更容易受到霉菌毒素的不利影響。

牛奶中霉菌毒素主要來源于飼料。瘤胃中的新陳代謝過程是抵御霉菌毒素的關鍵屏障[6]，赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、脫氧雪腐鐮刀烯醇(deoxynivalenol，DON)、黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)和玉米赤霉烯酮(zearalemone,ZEA)經過瘤胃屏障后可被代謝成毒性較低的化合物，而帕特菌素(patulin，PAT)和伏馬菌素(fumonisins，FB)則不會發(fā)生變化[7]。但是，某些奶牛疾病和/或飼料中的高污染可能會改變瘤胃狀態(tài)，進而改變瘤胃代謝，從而導致牛奶中霉菌毒素的存在[7]。一項為期3年的世界范圍的調查表明，在7 049份飼料樣本中，48%的樣本被2種或2種以上的霉菌毒素污染[8]。Gallo等[9]綜述了2000年起近15年來飼料中霉毒素污染的研究進展，發(fā)現反芻動物的飼料常常會被幾種霉菌毒素同時污染，這可能導致生鮮奶中霉菌毒素的共存。而黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1，AFM1)等霉菌毒素在巴氏殺菌等牛奶加工和儲存過程中仍然保持穩(wěn)定[10]，這在某種程度上意味著液態(tài)奶和奶制品中可能存在霉菌毒素共污染的潛在風險。

霉菌毒素的預防和控制具有重要的公共衛(wèi)生意義和商業(yè)影響，越來越受到公眾的關注，各個國家對牛奶中霉菌毒素水平的監(jiān)管力度也在不斷加強。迄今為止，全球各國各地區(qū)的多項法規(guī)和標準只對牛奶和奶制品中AFM1的含量進行了限量規(guī)定，其中部分列舉在表1中。

表1 牛奶和奶制品中AFM1限量規(guī)定

其他霉菌毒素如今尚未有具體的限量標準，但是，它們在牛奶中的暴露風險甚至是在牛奶中共污染的風險仍然不可忽視。鄭楠等[11]對中國牛奶中的霉菌毒素進行了風險排序，將牛奶中常見的幾種霉菌毒素按照指標重要程度依次排列為AFM1、OTA、ZEA、α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol，α-ZOL)、T-2毒素(T-2 toxin，T-2)、HT-2毒素(HT-2 toxin，HT-2)、DON以及FB。歐洲聯盟委員會的建議指出，成員國應確保同時對牛奶和奶制品樣品進行多種霉菌毒素的檢測，以確定是否存在DON、ZEA、OTA、FB1、FB2、T-2以及HT-2的共污染，以便評估聯合毒性作用[12]。目前，已有一些多種霉菌毒素的同時檢測技術和方法經過驗證，不僅比普通檢測方法成本更低，耗時更少，也可更為科學合理地進行牛奶和奶制品中霉菌毒素共污染的風險評估。牛奶和奶制品中多種霉菌毒素的共存情況見表2。

表2 牛奶和奶制品中多種霉菌毒素的共存情況

2 霉菌毒素交互作用預測方法

牛奶和奶制品中共存的多種霉菌毒素可能具有不同的交互作用，一般分為加和作用、協同作用和拮抗作用[21]。目前，用于預測霉菌毒素混合物之間的交互作用的方法包括定義法、等效線圖設計(組合指數設計)[22-23]、比較霉菌毒素混合物的預期毒性和實測毒性的未配對t-檢驗方法[24-27]、析因設計、中心組合設計、射線設計等，主要通過比較霉菌毒素混合物的實測值和預期值來預測霉菌毒素的聯合毒理效應，其中，前3種判斷方法最為常用。

2.1 定義法

Grenier等[28]匯總了112篇有關霉菌毒素聯合毒性作用的文獻，提出了幾種交互作用的定義：混合毒素的聯合毒性效應等于毒素單獨的毒性效應之和時認為毒素之間存在加和作用；混合毒素的聯合毒性效應等于其中1種毒素的毒性效應而不體現其他毒素的毒性效應時為亞加和作用；當2種毒素的聯合毒性效應大于單獨的毒性效應之和時為協同作用，表現為毒素單獨作用效果相似或相反，甚至1種毒素無明顯作用效果的情況下，毒素混合后的作用效果強于其中作用效果較強的毒素；當2種毒素的聯合毒性效應小于單獨的毒性效應之和時為拮抗作用，表現為2種毒素單獨作用效果相似或相反的情況下，毒素混合后作用效果介于兩者之間。

2.2 等效線圖設計

等效線圖設計又稱組合指數設計，最初來源于中位效應原理，用于分析藥物的組合效應，相對來說比較復雜難懂。具體過程為，連接2種化合物的等效劑量點[如半抑制濃度(IC50)]得到等效線，之后判斷混合物的等效劑量點(同樣為IC50)所在的位置，若落在等效線上，則2種化學物之間存在加和作用；若落在等效線之上或之下，則2種化學物之間存在拮抗或協同作用。后來，在等效線思路的基礎上，引入了Bliss[29]提出的組合指數概念用于量化2種或2種以上霉菌毒素之間的交互作用程度[30-31]，在CalcuSyn軟件的幫助下，可以大大降低分析難度。組合指數的計算公式為：

組合指數接近1表示聯合霉菌毒素具有加和效應，<1表示具有協同作用，>1表示具有拮抗作用。等效線圖設計不僅可以確定霉菌毒素交互作用的類型，而且可以確定交互作用的大小。

2.3 比較霉菌毒素混合物的預期毒性和實測毒性的未配對t-檢驗方法

Weber等[32]提出的比較霉菌毒素混合物的預期毒性和實測毒性的未配對t-檢驗方法相比其他方法更為簡單直觀，是目前應用最多的數理統(tǒng)計模型。以2種霉菌毒素聯合處理的試驗為例，預期值和標準誤差的計算公式如下：

Mean預期值(%)=Mean霉菌毒素1(%)+Mean霉菌毒素2
(%)-Mean對照(%)；
SEM=[(SEM霉菌毒素1)2+(SEM霉菌毒素2)2]1/2。

式中：Mean表示平均值；SEM表示標準誤差。

通常采用未配對t-檢驗方法比較實測值與預期值，若兩者無顯著差異，則2種霉菌毒素之間的交互作用為加和作用；若實測值顯著高于預期值，則2種霉菌毒素之間的交互作用為協同作用；若實測值顯著低于預期值，則2種霉菌毒素之間的交互作用為拮抗作用。

2.4 其他方法

析因設計包括全析因設計和部分析因設計，主要基于單獨霉菌毒素和混合物的劑量-反應關系，可以較為準確地預測霉菌毒素之間的交互作用。部分析因設計主要用于全析因設計和中心組合設計之后，可以對已觀測到的交互作用進行更準確的分析，以確保和表征這些交互作用。中心組合設計同樣可以預測多種劑量下多種霉菌毒素之間的交互作用，但是，與析因設計相比，該方法所選擇的試驗終點較少，在響應面的中心區(qū)域預測準確度較高，而當試驗條件距離中心區(qū)域越遠時預測準確度則會隨之越差[33]。因此，大多數研究通常先用中心組合設計將霉菌毒素種類和劑量的所有可能組合的數量減少到特定數值，在篩選出霉菌毒素混合物之間可能的交互作用之后，使用全析因設計或部分析因設計方法檢測各種混合比下的交互作用[24,33-34]。然而，當霉菌毒素數量較多且研究毒素混合物所需的設計要點數量過多時，選擇中心組合設計可能導致工作量太大，與之相比，混合比恒定的射線設計可能更為合適[35]。

3 霉菌毒素共污染研究進展和毒理學機制

目前，對于牛奶中共污染霉菌毒素的毒理學研究還很有限，參考和借鑒牛奶和奶制品中高風險的霉菌毒素組合AFM1+OTA、AFM1+ZEA、DON+ZEA、DON+FB1、DON+T-2等的毒理學研究方法和結果，對于牛奶中共污染霉菌毒素的風險評估及其聯合毒理效應解析具有重要的科學意義。

如今，越來越多毒理機制研究傾向于選擇體外模型進行小分子化合物(霉菌毒素及其混合物)與細胞大分子之間交互作用的分析。與體內試驗相比，體外試驗所需裝置小，測試樣品用量少，成本低，允許重復次數高，操作小型化和自動化，暴露條件易受控制，而且更為符合3R[減少、優(yōu)化和替代(reduction, refinement and replacement)]原則和動物福利方面的倫理道德[36-37]。Smith等[38]匯總了100多篇食品和飼料中霉菌毒素的聯合毒理學體外研究發(fā)現，細胞活力(64%)是用于分析聯合毒性作用時最常采用的試驗終點，之后依次是細胞凋亡或壞死(19%)、DNA損傷(17%)和氧化損傷(16%)。目前，用于檢測細胞活力的方法有很多，主要包括基于四氮唑溴鹽物質，如四甲基偶氮唑藍(MTT)、新型四甲基偶氮唑鹽(MTS)和水溶性四唑鹽-1(WST-1)的還原分析比色法以及中性紅法和臺盼藍法等簡單方便的細胞染色方法。本文將牛奶中高風險的霉菌毒素組合對哺乳動物體外模型細胞活力的聯合毒性研究進行了匯總，列舉在表3中。

表3 霉菌毒素組合對細胞活力的聯合毒性作用

體外研究是當今毒理學研究的大趨勢，但是目前的體外研究仍然存在著一些無法忽視的缺陷，如細胞培養(yǎng)的局限性(永生、存活率有限、代謝失衡、缺乏組織間交流)[34]、試驗毒素濃度遠遠高于現實中的暴露濃度以及毒素處理時間基本不超過72 h等。因此，更接近真實情況的毒理學研究，如霉菌毒素在亞毒性濃度下的長期暴露研究，目前仍然還很缺乏。而動物模型與人類相比，體內細胞和分子之間的復雜交互作用接近，分子靶點和途徑相同或類似，仍然是一個很有用的毒理學評價工具[37]。本文匯總了近年來牛奶中高風險霉菌毒素組合的聯合毒性作用體內研究，見表4。值得注意的是，這些體內研究大多未通過數理統(tǒng)計模型分析交互作用，故此項未在表4中列出。采用合適的數理統(tǒng)計模型對交互作用進行評估和量化可能是今后霉菌毒素聯合毒理學體內研究有待提高的方向之一。

Tajima等[54]發(fā)現，多種鐮刀菌毒素聯合作用于細胞的時候，毒素之間往往會發(fā)生交互作用從而導致最終的毒性作用增強或減弱。Luongo等[55]、Severino等[56]和Chen等[57]也對2種鐮刀菌毒素的聯合毒性作用進行了研究，但是并沒有進一步發(fā)掘具體的交互作用類型。Corcuera等[58]研究發(fā)現，OTA和AFB1對HepG2細胞的基因毒性具有拮抗效果，同時伴隨著細胞內活性氧(ROS)含量的增加。2種毒素與同一細胞色素P450超家族(CYP)酶之間的競爭可能導致誘變的AFB1外環(huán)氧化物分子數量減少，從而導致DNA損傷水平降低。Tavares等[39]研究發(fā)現，OTA和AFM1聯合處理Caco-2細胞可能導致2種毒素對谷胱甘肽分子的競爭，從而降低OTA直接氧化還原循環(huán)反應產生的ROS含量，最終導致拮抗的細胞毒性作用。FB1具有抗雌二醇的特性，而ZEA具有雌激素作用，因此2種毒素之間可能產生拮抗作用[59]。但是，FB1、ZEA和DON均具有誘導脂質過氧化產物丙二醛(MDA)生成的能力，而且都能以線粒體和/或溶酶體為靶點，通過不同的機制抑制蛋白質合成和DNA合成，因此這些毒素的組合可能會導致加和或協同作用[59]。

表4 高風險霉菌毒素組合的聯合毒性作用體內研究

續(xù)表4霉菌毒素組合Mycotoxin combination劑量Doses暴露時間Exposure time動物Animals聯合毒性作用Combined toxicological effect參考文獻ReferencesDON+FB1DON:55 μg/kg BW;FB1:30 μg/kg BW5 d8周齡Wistar雄性大鼠AST、GSH-Px活性(↑,協同)[51]DON+FB1DON:45 μg/kg BW;FB1:110 μg/kg BW7 d7～8周齡瑞士小鼠雄性:甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)含量;雌性和雄性:總蛋白(TP)和CRE含量;雌性:ALT和AST活性(↑,加和或超過加和)。雌性:體重;雌性和雄性:CRE含量(↓,加和或超過加和)[52]ZEA+FB1ZEA:40.0 μg/kg BW;FB1:50.0 mg/kg BW21 d雌性SD大鼠AST、ALT活性及尿酸、尿素、NO、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白(LDL)、甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、白細胞介素-6(IL-6)、MDA含量(↑,協同);總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、高密度脂蛋白(HDL)含量(↓,協同)[53]

總結來看，2種霉菌毒素之間具有顯著的交互作用表明它們之間可能存在非加和作用，缺少交互作用則可能為加和作用[60]。當2種毒素的毒性特征和作用機制相同時毒素之間通常存在加和作用[61-62]，2種毒素競爭同一個靶點或接受位點時往往為拮抗作用[23]，而協同作用通常發(fā)生于2種毒素位于同一毒性通路的不同階段，或者1種毒素可以促進另一種毒素的吸收或減少另一種毒素的代謝性降解時[61]。

4 小 結

直到今天，霉菌毒素的聯合毒理學研究仍然十分有限，霉菌毒素共污染帶來的健康風險和經濟損失仍未可知。匯總以往的文獻可以發(fā)現，即使是毒性作用機制不同的多種霉菌毒素之間也很有可能存在交互作用，甚至是協同作用，這意味著即使牛奶中每種毒素的含量都低于最大允許限量，多種霉菌毒素在牛奶中的共污染仍具有很大的健康風險。因此，需要我們盡快開發(fā)和完善高效的多種霉菌毒素同時檢測技術，開展多種霉菌毒素的聯合毒理學研究，同時將霉菌毒素共污染納入考慮范圍，更謹慎地制定牛奶風險評估方案以及相關標準和法規(guī)。