夏戴陽 楊 琳 朱勇文 王文策

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東省動(dòng)物營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642)

脊椎動(dòng)物的腸道中寄居著大量的微生物，它們被統(tǒng)稱為微生物群。腸道微生物群中的基因組中所包含的基因數(shù)量可達(dá)到宿主自身基因組數(shù)量的100倍[1-2]。然而，不僅是數(shù)量上的龐大，微生物群在宿主體內(nèi)也發(fā)揮著強(qiáng)大的不可或缺的功能。微生物群可以被看作是一種代謝器官[3]，對宿主營養(yǎng)、腸道發(fā)育和生理調(diào)節(jié)都起到重要的作用。它們可以消化宿主無法消化吸收的成分，產(chǎn)生宿主生長發(fā)育所需要的代謝產(chǎn)物[4]。不僅如此，微生物群還決定了宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)展，影響免疫介導(dǎo)的信號(hào)傳遞過程[5]。可以說，正是腸道微生物群將機(jī)體的營養(yǎng)、代謝和免疫3個(gè)過程緊緊聯(lián)結(jié)在了一起。

早在1 500年前，東晉的葛洪就用糞便提取物制作成“黃湯”來治療食物中毒和嚴(yán)重腹瀉的患者。明代的李時(shí)珍也在本草綱目中記載了使用糞便提取物來治療腹瀉、發(fā)燒、疼痛、嘔吐和便秘[6]?，F(xiàn)如今，糞便微生物移植(FMT)技術(shù)不僅在治療艱難梭菌感染方面獲得了巨大成功[7]，對于腸易激綜合征、炎癥性腸病、胰島素抵抗和多發(fā)性硬化癥等疾病，F(xiàn)MT技術(shù)也表現(xiàn)出很好的療效[8-12]。并且，隨著“肝腸軸”和“腦腸軸”等概念的提出[13-14]，F(xiàn)MT技術(shù)應(yīng)用于代謝病，甚至精神病上的治療也在飛速發(fā)展[15-16]。

1 鴨FMT技術(shù)的可行性探究

與其他脊椎動(dòng)物一樣，鴨的胃腸道內(nèi)也寄居著大量的微生物，在后腸中的數(shù)量高達(dá)1×1011CFU/g，其中的優(yōu)勢菌群為厚壁菌和擬桿菌[17]。對于禽類來說，微生物群除了能夠影響機(jī)體的代謝功能以外，在機(jī)體的免疫功能中也起著獨(dú)特的作用。法氏囊是禽類特有的免疫器官。在孵化期間，法氏囊作為禽類腸道的憩室，在禽類孵化后被微生物定植。隨后，這些微生物可以作為抗原促使機(jī)體產(chǎn)生抗體，或者誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞因子，促進(jìn)法氏囊B細(xì)胞的增殖和成熟[18]。同時(shí)，微生物群還可以在腸道內(nèi)產(chǎn)生黏蛋白來保護(hù)腸道，一些禽類的黏蛋白還具有特殊的免疫功能，例如雞黏蛋白可以減輕空腸彎曲桿菌的毒性[19]。此外，F(xiàn)MT技術(shù)已經(jīng)在一些研究中運(yùn)用于禽類(表1)，這也為鴨糞便微生物移植技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化奠定了基礎(chǔ)。

表1 FMT技術(shù)在禽類中的應(yīng)用

2 鴨FMT供體的選擇

FMT技術(shù)中，供體的腸道微生物是治愈受體疾病的關(guān)鍵，因此供體的選擇是決定FMT是否成功的重要因素。選擇不合適的供體可能會(huì)損害受體腸道菌群的穩(wěn)定性和耐受性，引起受體腸道排斥反應(yīng)。此外，由于供體糞便可能攜帶致病性微生物，如若不謹(jǐn)慎選擇供體，F(xiàn)MT過程中可能會(huì)導(dǎo)致病原體傳播。供體的選擇包括從表現(xiàn)性狀、行為、抗生素使用史、藥物使用史和疫病史等多方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，并且在移植前對供體進(jìn)行血清學(xué)檢測和糞便檢測，以監(jiān)測感染性病原體和其他危險(xiǎn)因素。

與鴨傳染病相關(guān)的病原微生物主要有以下幾類。1)與鴨傳染性疾病相關(guān)的病毒：鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨腸炎病毒、毒性腸炎皰疹病毒、A型流感病毒、鴨細(xì)小病毒、鴨副黏病毒(新城疫病毒)；2)與鴨傳染性疾病相關(guān)的細(xì)菌：禽類多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、煙曲霉菌、黃曲霉菌、彎曲桿菌和單核球增多性李斯特菌；3)與鴨傳染性疾病相關(guān)的寄生蟲：艾美球蟲、住白細(xì)胞蟲、毛滴蟲、絳蟲、肉孢子蟲和隱孢子蟲[24-33]。

2.1 表觀特征及行為學(xué)特征觀察

選為供體的鴨表觀特征與行為應(yīng)當(dāng)符合如下條件：1)生長發(fā)育良好；2)無不良行為(如啄癖、異食癖)；3)羽毛完整，身體表面無傷口或其他損傷；4)體溫維持在40～42 ℃；5)正常飲水采食；6)糞便正常，未出現(xiàn)病變樣糞便或者便秘；7)無使用抗生素或其他藥物記錄。

此外還需注意的是，作為供體的鴨在收集糞便前的2周內(nèi)不能接種弱毒疫苗，且不能接觸其他有過疫病史的鴨。

2.2 血清學(xué)檢測

病原體可以刺激宿主，并在血清中產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，這使得我們通過抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)監(jiān)測侵入性病原體成為了可能。血清學(xué)檢測包括：血清中和試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和補(bǔ)體固定試驗(yàn)。尤其是ELISA試驗(yàn)，由于其具有很高的特異性與敏感性，已被廣泛運(yùn)用于病原體血清學(xué)檢測[34-35]。近年來，鴨腺病毒和尼泊爾禽流感病毒都利用血清學(xué)檢測進(jìn)行了研究與風(fēng)險(xiǎn)防控[36-37]。

2.3 糞便檢測

由于糞便中可能攜帶某些傳染性病原體，如禽大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌等致病菌[38-39]。對供體鴨進(jìn)行糞便檢測可直接降低鴨FMT的傳染風(fēng)險(xiǎn)。從供體鴨的糞便中提取DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)致病菌的基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物可判斷糞便中是否存在潛在的病原體[40-41]。

同樣，除了在糞便檢測中篩選致病菌外，還應(yīng)當(dāng)關(guān)注益生菌的作用。有報(bào)道稱，枯草芽孢桿菌可增強(qiáng)鴨的免疫力和抗氧化能力[42]，乳酸桿菌可促進(jìn)鴨腸道發(fā)育，并有助于維持腸道完整性[43]?？梢岳?6S rDNA測序和宏基因組學(xué)的研究方法，根據(jù)鴨FMT糞便微生物組成和功能的分析結(jié)果，篩選出腸道中具有高豐度“功能微生物”且無致病微生物的最佳供體鴨。

3 鴨FMT技術(shù)糞便菌液的制備及保存方法

選取符合FMT條件的供體鴨后，將其與其他鴨隔離，單獨(dú)飼養(yǎng)，正常飲水飼喂。在收集糞便的不銹鋼鴨籠下放置牛皮紙，收集供體鴨新鮮糞便。將收集到的糞便樣品保存在無菌的Eppendorf管中，置于冰上，快速轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。如需長時(shí)間運(yùn)輸，則需要置于干冰或液氮中冷凍保存，并在做后續(xù)處理時(shí)，將樣品置于42 ℃的水浴鍋中溶解。盡量縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間，以減少腸道微生物的損耗。

將收集到的糞便樣品轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室后，將其與無菌、非抑菌磷酸鹽緩沖液(PBS)按照1∶5的比例混合稀釋，勻漿。將混勻后的懸浮液通過紗布或者0.25 mm孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)篩，重復(fù)過濾3次，以消除糞便懸浮液中未消化的小顆粒物質(zhì)[44-45]。之后將濾液轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，置入離心機(jī)中，1 000 r/min離心5 min。用移液槍小心吸取上清液，制成糞便菌液。

制作好的糞便菌液可即刻用于受體，進(jìn)行糞便微生物移植操作。如需長期保存，則需要在菌液中加入10%無菌甘油，混合完全后置于-80 ℃環(huán)境保存，冷凍樣品需在6個(gè)月內(nèi)使用完畢。由于腸道微生物以厭氧菌為主，在制作糞便菌液過程中，應(yīng)盡量縮短糞便暴露在空氣中的時(shí)間。所有操作均在室溫下進(jìn)行，優(yōu)先在厭氧培養(yǎng)箱中操作，所有試驗(yàn)儀器設(shè)備均要求做無菌處理。

4 鴨FMT技術(shù)糞便微生物的移植

在人類醫(yī)學(xué)中，將糞便微生物轉(zhuǎn)入受體體內(nèi)方式有很多種，包括從上消化道(口服)、中消化道(內(nèi)窺鏡、鼻胃管、鼻空腸和鼻十二指腸)和下消化道(結(jié)腸鏡檢查和灌腸)給藥[46-47]。對于鴨來說，由于其腸道短、代謝快，灌胃糞便菌液是最佳給藥方式[48]。灌胃過程為：取出受體鴨并稱重；在注射器前嵌套灌胃塑膠軟管，按10 mL/kg劑量吸取糞便菌液，反復(fù)吹打幾次，排凈灌胃管內(nèi)氣泡；將受體鴨保定，沿著受體鴨食管向腹部左側(cè)進(jìn)管，注射糞便菌液(過程要迅速，防止受體鴨產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)或嘔吐反應(yīng))。每次灌胃都需要替換潔凈無菌的注射器和灌胃塑膠軟管。

5 小 結(jié)

基于人類醫(yī)學(xué)和鴨養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)驗(yàn)，本文探討了關(guān)于鴨FMT技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化程序的制定，包括供體鴨的選擇、糞便菌液的制備保存和糞便菌液的移植，同時(shí)也為鴨養(yǎng)殖生產(chǎn)提供了一個(gè)全新的思路：FMT是一種技術(shù)手段，它不僅可以用于治療疾病，也可以與動(dòng)物的疾病防控，甚至與提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能聯(lián)系在一起。通過對鴨FMT技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化，在無抗養(yǎng)殖的大環(huán)境下改善鴨的腸道健康，可推進(jìn)整個(gè)畜牧行業(yè)向綠色養(yǎng)殖過渡。目前，F(xiàn)MT技術(shù)已在豬養(yǎng)殖業(yè)有所應(yīng)用，主要以初生仔豬為受體，進(jìn)行糞菌移植，以達(dá)到降低腹瀉率、提高生產(chǎn)性能的目的。由于豬為哺乳動(dòng)物，進(jìn)行FMT操作需要在仔豬斷奶后進(jìn)行，并且仔豬體型較大，灌胃或灌腸時(shí)需多人操作，糞便菌液制作量大，灌胃耗時(shí)長。相較而言，鴨FMT技術(shù)具有易于操作、無生長階段限制以及糞便菌液制作方便等優(yōu)勢。

目前，我們對于腸道微生物的了解還不夠全面，對于微生物之間的相互作用還未探明，微生物群的具體作用機(jī)制和通路還有待深入探索。但隨著高通量研究方法包括宏基因組學(xué)、元轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)的日益發(fā)展，宿主健康與腸道菌群組成和功能之間的關(guān)系將會(huì)逐漸得到揭示。FMT技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化和普及、糞便菌液干粉化處理以及鴨腸道微生物庫的建立只是腸道微生物應(yīng)用于水禽生產(chǎn)的初步探索，未來將會(huì)有更多更精準(zhǔn)的FMT治療方案，人們對于健康機(jī)體的微生物區(qū)系也將會(huì)有更清楚的認(rèn)識(shí)。屆時(shí)，對于致病微生物將不再需要大劑量的抗生素進(jìn)行“不分?jǐn)澄摇钡臍?，而是只需要使用健康的菌群進(jìn)行定植，即可達(dá)到治愈改良效果。相信在不久的將來，通過腸道微生物介導(dǎo)以改善動(dòng)物機(jī)體健康將會(huì)成為現(xiàn)實(shí)。