房延鳳 馬李杰 南巖東 張濤 任騰 蘇蔚 劉雁聲 惠盼 譙鈺琪金發(fā)光 劉偉

1空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，西安710038；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，成都610083

非小細(xì)胞肺癌占肺癌的85%[1]，5年生存率約13%[2]。以EGFR酪氨酸酶抑制劑為代表的分子靶向治療較化療顯著延長(zhǎng)了患者無進(jìn)展生存期。研究表明，EGFR-TKI治療敏感性最高的經(jīng)典突變?yōu)?9外顯子的缺失突變和21外顯子的L858R點(diǎn)突變[3-4]，其中L858R點(diǎn)突變占EGFR突變的40%～45%[5]。罕見突變占EGFR突變陽(yáng)性NSCLC患者的7%～23%[6-8]，而21外顯子上的少見突變L861Q約占2%[9]，且突變臨床特征和對(duì)EGFR-TKI治療的敏感性研究數(shù)據(jù)不多，有研究發(fā)現(xiàn)L861Q對(duì)EGFR-TKI治療敏感性僅次于經(jīng)典突變[10-12]，但部分研究顯示L861Q呈低水平的敏感性[13]，甚至對(duì)EGFR-TKI治療的完全抵抗[14]，療效不佳[15]。本研究回顧性分析498例非小細(xì)胞肺癌患者通過ARMS法檢測(cè)其EGFR基因上21外顯子的L861Q、L858R2個(gè)突變位點(diǎn)，分析其突變臨床特征及兩者突變率的對(duì)比研究，有助于進(jìn)一步總結(jié)歸納本地區(qū)非小細(xì)胞肺癌21外顯子突變臨床特征，構(gòu)建基因突變臨床特征模型。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年7月至2018年12月空軍軍醫(yī)大學(xué)空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科確診的非小細(xì)胞肺癌705例，包括腺癌464例，其他類型241例。其中男448例，女257例；年齡(65.96±12.36)歲。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則。

1.2 設(shè)備與方法

1.2.1 主要儀器和試劑 熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司，LightCycler480II)，臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司，PICO17)，核酸蛋白定量?jī)x(美國(guó)Invitrogen公司，Qubit2.0)，三孔電熱恒溫水槽(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司，DK-8D)等。組織&血液DNA提取純化試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司，CatNo./ID：69504)，石蠟組織DNA提取純化試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司，Cat No./ID：56404)外周血游離核酸提取純化試劑盒(德 國(guó)QIAGEN公 司，CatNo./ID：55114)，EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)(蘇州為真生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.2.2 核酸純化 (1)胸水和新鮮組織：處理好樣本之后，按照DNesasy?Blood&Tissue Kit(QIAGEN)流程純化核酸。(2)外周血：采集患者化療前或化療后4周外周血8～10 ml(EDTA抗凝)，按照QIAamp?Circulating Nucleic Acid Kit(QIAGEN)流程純化ctDNA。(3)石蠟組織：取石蠟組織切片3～5μm厚，5～10片，按照QIAamp?DNA FFPE Tissue Kit(QIAGEN)流程純化核酸。

1.2.3 EGFR基因突變檢測(cè) 于實(shí)時(shí)熒光定量PCR平臺(tái)，用突變特異擴(kuò)增PRCR和溶解曲線分析技術(shù)檢測(cè)基因特定突變。

1.2.4 結(jié)果判讀 陽(yáng)性樣本指有典型S型擴(kuò)增曲線，且某個(gè)位點(diǎn)的ΔCt值在切值范圍內(nèi)，同時(shí)該位點(diǎn)的溶解峰形的Tm值與STD該位點(diǎn)溶解峰形的Tm值的差值絕對(duì)值小于或等于1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 26.0軟件包處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以x-±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入選患者Exon21外顯子上L858R、L861Q突變情況 705例非小細(xì)胞肺癌中Exon21外顯子上L858R、L861Q共突變80例，突變率11.348%，男性共突變31例，男性突變率6.920%，女性共突變49例，女性突變率19.066%。

2.2 L861Q、L858R突變臨床特征對(duì)比

2.2.1 L861Q突變臨床特征 705例非小細(xì)胞肺癌中L861Q突變13例，突變率1.844%；其中腺癌突變率高于其他病理類型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。L861Q突變特征還表現(xiàn)在：年齡≥50歲組突變率高于年齡＜50歲組、女性組突變率高于男性組，不吸煙組突變率高于吸煙組，右肺腫瘤組突變率高于左肺腫瘤組，合并其他腫瘤組中僅13例腺癌未合并其他腫瘤患者突變，Ⅰ～Ⅲ期組突變率高于Ⅳ期組，并發(fā)骨、頭顱轉(zhuǎn)移組突變率高于相應(yīng)的無轉(zhuǎn)移組，無胸膜及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組突變率高于相應(yīng)轉(zhuǎn)移組，合并糖尿病、高血壓組突變率高于未合并糖尿病、高血壓組，但以上各項(xiàng)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＞0.05)，見表1。

2.2.2 L858R突變臨床特征 705例非小細(xì)胞肺癌中L858R突變67例，突變率95.035%。女性組突變率高于男性組(χ2=19.562，P＜0.001)，不吸煙組突變率高于吸煙組(χ2=15.859，P＜0.001)，右肺腫瘤突變率高于左肺腫瘤(χ2=5.601，P=0.020)，腺癌組突變率高于非腺癌組(χ2=16.282，P＜0.001)，Ⅳ期組腫瘤突變率高于Ⅰ～Ⅲ期組(χ2=5.996，P=0.016)，見表1。

2.2.3 L861Q與L858R突變特征對(duì)比 L861Q與L858R突變?cè)谛詣e、年齡、是否吸煙、病理分型、腫瘤發(fā)生部位、是否合并其它腫瘤、有無并發(fā)骨轉(zhuǎn)移突變臨床特征相一致；腫瘤分期，是否并發(fā)胸膜、淋巴結(jié)、頭顱轉(zhuǎn)移及有無合并糖尿病、高血壓突變臨床特征相反，以上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＞0.05)，見表1。

3 討論

本文705例非小細(xì)胞肺癌L861Q突變率略低于既往報(bào)道[9]，考慮與檢測(cè)方法有關(guān)。腺癌組L861Q、L858R突變率高于其它類型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，既往研究認(rèn)為EGFR突變?cè)邝[癌中偶然檢測(cè)到是對(duì)腺鱗癌或低分化癌的病例誤診[16]，本文中13例L861Q突變均發(fā)生于腺癌未合并其它腫瘤組，即21外顯子的突變更易發(fā)生于腺癌。既往報(bào)道EGFR少見突變與吸煙之間存在顯著關(guān)聯(lián)[17-18]。本文L858R不吸煙組突變率高于吸煙組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；L861Q不吸煙組突變率高于吸煙組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮一方面與L861Q突變率低有關(guān)，另一方面L861Q少見突變與吸煙是否相關(guān)需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入研究。腺癌患者L861Q突變率高于相應(yīng)對(duì)照組，L858R突變率在非吸煙、女性、Ⅳ期、右肺、腺癌高于相應(yīng)對(duì)照組，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＜0.05)，表明L861Q、L858R突變及EGFR-TKI治療更傾向這種特征的患者。

國(guó)外有研究表明，腫瘤分期也會(huì)影響突變率。癌癥基因組圖譜隊(duì)列中報(bào)道EGFR突變率11%，其對(duì)象主要為非轉(zhuǎn)移性、手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌，且未接受全身性的治療[19]。本研究中不同臨床分期的L861突變率Ⅰ～Ⅲ期組高于Ⅳ期組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.057，P＞0.05)；L858R突變率Ⅳ期組高于Ⅰ～Ⅲ期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.996，P＜0.05)，即EGFR常見突變L858R腺癌Ⅳ期更易出現(xiàn)。一方面考慮入選病例大部分是臨床分期，部分和術(shù)后分期存在一定差異，另一方面Ⅳ期腺癌患者無手術(shù)適應(yīng)癥，基因檢測(cè)為首選，相比Ⅰ～Ⅲ期腺癌，Ⅳ期檢測(cè)比例更高，故而檢出常見突變L858R在Ⅳ期比例更高，后續(xù)需進(jìn)一步深入研究。

表1 L861Q、L858R突變臨床特征對(duì)比

本研究還發(fā)現(xiàn)發(fā)生于≥50歲不吸煙女性、右肺腺癌、未合并其他腫瘤、并發(fā)骨轉(zhuǎn)移者的L861Q突變率高于相應(yīng)對(duì)照組，L858R突變率臨床特征與此相一致。而L861Q、L858R在腫瘤分期有無合并糖尿病、高血壓和是否并發(fā)頭顱、胸膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移突變率臨床特征相反，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均＞0.05)，L861Q、L858R突變臨床特征的一致性和相反性內(nèi)在機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。據(jù)報(bào)道攜帶L858R突變的非小細(xì)胞肺癌EGFR-TKI療效優(yōu)于L861Q等少見突變的患者[20-28]，因此，L858R、L861Q突變的臨床特征和療效之間存在一定相關(guān)性。突變過程中有無其他通路同時(shí)激活的影響，如MDM2蛋白的產(chǎn)生[29]，需要大樣本進(jìn)一步深入研究。鑒定非小細(xì)胞肺癌患者臨床特征為其接受EGFR-TKI治療療效預(yù)測(cè)提供了導(dǎo)向。

本研究未涉及復(fù)合突變及L861Q、L858R突變療效對(duì)比研究，罕見的突變可能單獨(dú)發(fā)生或與常見或罕見EGFR復(fù)合突變[30]，伴隨基因檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)，少見突變的檢出率可能比以前更高[31]。通過705例非小細(xì)胞肺癌患者L861Q、L858R突變臨床特征研究，有助于進(jìn)一步探索本地區(qū)21外顯子的突變臨床特征，優(yōu)化非小細(xì)胞肺癌個(gè)體化治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突