丁 軻 余祖玲 王鐠蒂 余祖華 李 旺 李元曉 何萬領 曹平華 張春杰 劉 寧

(1.河南科技大學宏翔生物飼料實驗室，洛陽471003；2.洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，洛陽471003)

膽固醇是一種甾體化合物，廣泛存在于動物性食品內(nèi)，在肝臟、腦、膽汁、蛋等中含量較高。隨著人們生活水平的提高，動物性食品在飲食結(jié)構(gòu)中的比例逐漸上升，導致膽固醇攝入過量，引起血清膽固醇含量增高，從而會引發(fā)冠心病、高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化等一系列心腦血管疾病，在中老年群體中尤其普遍[1-3]。據(jù)調(diào)查，當前因疾病死亡的人數(shù)中有約40%的疾病是由直接或間接高膽固醇所引起，是人類疾病的第一大殺手[4-5]。降低血清膽固醇含量可有效防止心血管疾病的發(fā)生，提高人們的健康指數(shù)[6-7]，其有效途徑：一是從源頭控制，即降低食品源中膽固醇的含量，以減少人們對膽固醇的攝入量和攝入機會，二是降低體內(nèi)的膽固醇含量，即通過干預手段降低血液中膽固醇的含量。降低體內(nèi)膽固醇含量最有效的方法是使用膽鹽水解酶(BSH)，BSH是微生物生長過程中產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物，具有較強的降解膽固醇的能力[8]。據(jù)報道，產(chǎn)生BSH的菌株主要來自于乳酸菌，如植物乳桿菌(L.plantarum)[9-10]、干酪乳桿菌(L.casei)[11]、布氏乳桿菌(L.buchneri)[12]、雙歧桿菌(Bifidobacterium)等[13]。另外，在擬桿菌屬(Bacteroides)和腸球菌屬(Enterococcus)的細菌中也發(fā)現(xiàn)有BSH[14-15]。但一般情況下，野生型菌株降解膽固醇的能力均有限，不能完全滿足臨床需要。因此，很有必要利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)將BSH基因在高效表達系統(tǒng)中進行表達，后期無論其純化酶或基因工程菌均具有極好的應用前景。

本實驗室前期已分離鑒定了1株L.plantarum——L.plantarumDPP8，GenBank登錄號為KR824936，菌種保藏號為CCTCC M2016136，試驗證明其基因組上含有1個975 bp的BSH基因，并可降解培養(yǎng)基中35.93%的膽固醇，降解率有限[16]。為了提高BSH基因的表達量，本試驗擬利用PCR技術(shù)克隆BSH基因，將其重組于表達載體pMJ67-sp中，電轉(zhuǎn)入L.caseiCECT5276中進行表達研究，以期獲得能夠高效表達BSH的重組L.caseiCECT5276，將其開發(fā)成為功能性活菌飼料添加劑應用于動物生產(chǎn)，能夠高效降低動物性產(chǎn)品中膽固醇含量，從而為人類提供更為健康的動物性食品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

L.plantarumDPP8，本實驗室分離保存；pMD18-T，購自大連寶生物工程有限公司；表達質(zhì)粒pMJ67、L.caseiCECT5276由荷蘭Gasper教授贈送；pMJ67-sp，本實驗室構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，檸檬酸二銨2 g，葡萄糖20 g，吐溫-80 1 mL，七水硫酸鎂0.58 g，四水硫酸錳0.25 g，瓊脂粉 15 g，水1 000 mL，調(diào)pH至6.2～6.4，115 ℃、0.105 MPa滅菌15 min。

降膽固醇培養(yǎng)基：含2%膽固醇的MRS液體培養(yǎng)基。

BSH誘導培養(yǎng)基：含2%牛磺膽酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基。

LB液體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，調(diào)pH至7.0，121 ℃、0.12 MPa滅菌20 min。

1.1.3 生化試劑及工具酶

聚合酶PyrobestTMDNA Polymerase、DL2000 Marker、λDNA/HindⅢ、限制性切酶NdeⅠ、EcoRⅠ，PCR回收試劑盒、T4 DNA Ligase，IPTG、X-gal、Goldview購自大連寶生物工程有限公司；細菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要儀器

1.3 方法

1.3.1 引物設計

根據(jù)GenBank中已登錄的L.plantarumBSH基因(登錄號：MBUL90)序列，利用Primer Premier 6.0設計1對引物，bsh1：5’-CGCATATGATGTGTACTGCCATAACT-3’(劃線部分為NdeⅠ位點)和bsh2：5’-CGGAATTCGTTAACTGCATAGTATTG-3’(劃線部分為EcoRⅠ位點)，送至上海生物工程股份有限公司合成。

1.3.2L.plantarumDPP8基因組DNA的提取

將培養(yǎng)的L.plantarumDPP8按照天根生化科技(北京)有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒的方法提取其基因組DNA。

1.3.3BSH基因的克隆

以L.plantarumDPP8基因組DNA為模板，利用引物bsh1和bsh2進行擴增，PCR反應體系為：上游引物1.5 μL(20 pmol/L)、下游引物1.5 μL(20 pmol/L、10×PCR Buffer 5μL、dNTPs 1 μL (10 pmol/L)、Pyrobest DNA Polymerase 0.5 μL(5 U/μL)、模板DNA 4 μL，加滅菌超純水至50 μL。反應條件：模板DNA 95 ℃預變性10 min；95 ℃ 40 s、62 ℃ 1 min、72 ℃ 90 s，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。利用天根生化科技(北京)有限公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行PCR產(chǎn)物的回收，然后將擴增產(chǎn)物連接于pMD18-T，得到克隆質(zhì)粒pMD18-BSH。將驗證正確的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，并進行同源性比較，確定是否是BSH基因。

1.3.4 重組表達載體的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ分別對鑒定正確的克隆質(zhì)粒pMD18-BSH與表達載體pMJ67-sp進行雙酶切，分別回收目的條帶，16 ℃條件下經(jīng)T4連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)109，在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性菌株。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，采用PCR法、雙酶切及測序進行鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pMJ67-sp-BSH。

將100 μL感受態(tài)乳酸桿菌與5 μL(300～500 ng) pMJ67-sp-BSH在冰浴下混勻，然后加入到冰浴預冷的0.1 cm的電轉(zhuǎn)化杯中，冰上放置10 min。在電壓600～1 200 V、電容25 μF、電阻100 Ω條件下進行電擊，電擊后立即加入0.9 mL預冷的含10%蔗糖的MRS，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，37 ℃孵育2 h后，取200 μL涂于含5 μg/mL的紅霉素抗性的MRS平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)40 h。在平板上挑取陽性克隆，采用細菌基因組提取試劑盒提取乳酸桿菌基因組，利用引物bsh1和bsh2參照步驟1.3.3進行PCR鑒定和酶切鑒定，并將擴增后的序列進行測序，鑒定正確的即為重組L.caseiCECT5276——L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)。

1.3.5 重組L.caseiCECT5276 BSH的表達與純化

1)表達產(chǎn)物濃縮：將陽性重組L.caseiCECT5276接種于加有2%?；悄懰徕c的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)至600 nm處吸光度值(OD600 nm)=0.5時加入0.5%的乳糖，誘導培養(yǎng)36 h，將菌液5 000 r/min離心8 min，取上清液。向100 mL上清液中加入150 mL聚乙二醇6000(PEG6000)，攪拌至完全沉淀，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，用0.01 mol/L(pH 7.4)的磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮沉淀，4 ℃透析48 h，重復5～6次，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，棄沉淀，上清液透析48 h，重復5～6次，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)鑒定：將濃縮液和純化液于15%的垂直板凝膠中進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，以未誘導的L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)、L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)和誘導的L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)為對照。

1.3.6L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH) BSH活力測定

將L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)于37 ℃用0.5%的乳糖厭氧誘導培養(yǎng)36 h，離心分離上清和沉淀。后者用PBS(pH 6.0)洗2次后，加冰預冷的PBS，混勻，于冰上用超聲破碎儀破碎細胞后，于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液。分別以上述培養(yǎng)上清液和菌體裂解上清液為粗酶液進行BSH活力測定，同時以野生型菌株L.plantarumDPP8為對照。樣品管和空白對照管分別加入55 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液0.3 mL，0.01 mmol/L巰基乙醇溶液0.3 mL，0.5 mmol/L pH 6.0 PBS 0.3 mL，0.12 mmol/L?；悄懰徕c0.1 mL，雙蒸水0.3 mL。將上述溶液用移液槍反復吹打混勻后，置37 ℃恒溫水浴鍋中孵育10 min，向樣品管和空白對照管中分別加入1.5和1.2 mL 15%的三氯乙酸，同時吸取0.2 mL的粗酶液加入樣品管中，徹底混勻后，于4 ℃、1 000 r/min離心10 min，分別吸取0.8 mL樣品管和空白對照管上清液，各加入1.8 mL顯色液(0.3 mL 2%茚三酮-檸檬酸鹽溶液、1.5 mL 30%甘油)，當樣品管和空白對照管與顯色液徹底混勻后，塞上棉塞于水浴鍋中沸水浴15 min，冷卻至常溫，在570 nm處測定吸光度值(OD570 nm)。BSH活力定義為：每分鐘每毫升粗酶液反應產(chǎn)生?；撬岬奈⒛枖?shù)。

BSH活力(U/mL)=A×4 000/30。

式中：A表示?；撬岬奈⒛枖?shù)。

取0.5 mmol/L的?；撬針藴室?，配制成5個不同濃度的工作液(0.083、0.167、0.250、0.333、0.417 mmol/L)，繪制牛磺酸標準曲線。

1.3.7L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)降膽固醇能力測定

標準曲線的制定：取1.0 mg/mL的膽固醇標準液，配制成5個不同濃度的工作液(20、40、60、80、100 μg/mL)，然后各取1.0 mL參照文獻[17]采用鄰苯二甲醛(OPA)法對膽固醇含量進行測定。以1.0 mL無水乙醇作為空白對照，每個濃度重復測定3次，取平均值。

將L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)接種到MRS培養(yǎng)基中活化后，按2%(體積分數(shù))的接種量接種于10 mL降膽固醇培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧靜止培養(yǎng)，每隔12 h搖勻1次，培養(yǎng)48 h后，吸取混勻的菌液1.0 mL，5 000 r/min離心10 min，檢測培養(yǎng)液中膽固醇的殘余量。分別以L.caseiCECT5276 (pMJ67-sp)和L.plantarumDPP8為對照。膽固醇降解率計算公式為：

D(%)=[(A-B)/A]×100。

式中：D為膽固醇降解率；A為未接種菌株培養(yǎng)上清液中膽固醇含量；B為重組干酪乳桿菌發(fā)酵后培養(yǎng)上清液中膽固醇含量。

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2017軟件進行處理，試驗結(jié)果以平均值+標準誤表示，并采用Excel 2017軟件進行圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSH基因PCR克隆結(jié)果

以L.plantarumDPP8基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增后，擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果如圖1所示，在約975 bp處有1條特異性條帶，與預期大小相符。將克隆質(zhì)粒pMD18-BSH測序，結(jié)果表明該基因全長為975 bp。同源性比較顯示該基因與L.plantarumMBUL69的BSH基因同源性高達99.6%。進化樹分析顯示該基因與L.plantarumMBUL69的BSH基因在同一分支。上述結(jié)果表明本試驗克隆獲得了L.plantarumDPP8源的BSH基因(GenBank登錄號為：KT343778)。

1和2：PCR擴增產(chǎn)物；3：陰性對照；M：DL2000 Marker。

2.2 表達載體pMJ67-sp-BSH的鑒定及重組L. casei CECT5276的PCR鑒定

將表達載體pMJ67-sp與pMD18-BSH同時用NdeⅠ和EcoRⅠ酶切后進行連接，得到重組表達載體pMJ67-sp-BSH。質(zhì)粒pMJ67-sp-BSH PCR擴增產(chǎn)物和酶切鑒定結(jié)果見圖2，NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切后得到2條分別約為5 000和975 bp的條帶，EcoRⅠ單酶切得到1條約為6 000 bp的條帶，采用引物bsh1/bsh2進行PCR擴增得到1條約為975 bp的條帶，均與預期大小相符，說明重組表達載體pMJ67-sp-BSH構(gòu)建成功。

M1：DL2000 Marker；1：NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切pMJ67-sp-BSH：2：PCR擴增產(chǎn)物；3：EcoRⅠ單酶切pMJ67-sp-BSH；M2：λDNA/HindⅢ Marker。

表達載體pMJ67-sp-BSH電轉(zhuǎn)化L.caseiCECT5276，通過紅霉素抗性平板篩選陽性菌株后，利用引物bsh1/bsh2對陽性菌株基因組進行PCR擴增。由圖3可知，L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)能夠擴增出約975 bp的條帶，證明BSH基因已成功整合到了L.caseiCECT5276基因組上。

2.3 BSH表達產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果

經(jīng)乳糖誘導后的重組L.caseiCECT5276用15%凝膠進行SDS-PAGE，其結(jié)果見圖4。由圖4可知，在泳道1約37 ku處有1條清晰的蛋白條帶，與推測的BSH蛋白分子質(zhì)量大小相符，說明BSH在L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)中得到了表達。而未誘導的重組L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)和誘導的原始菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)在約37 ku處也有淺淡的條帶，說明原始菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)和未誘導重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)基因組上也能分泌產(chǎn)生類似大小的蛋白，但該蛋白的表達不受乳糖誘導的影響。

1和2：L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)PCR擴增產(chǎn)物；3: L.casei CECT5276(pMJ67-sp)PCR擴增產(chǎn)物；M: DL2000 Marker。

1：L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)未誘導產(chǎn)物；2：L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)誘導產(chǎn)物；3：L. casei CECT5276(pMJ67-sp)未誘導產(chǎn)物；4：L. casei CECT5276(pMJ67-sp)誘導產(chǎn)物；5：純化蛋白；M：標準Marker。

2.4 L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)表達產(chǎn)物BSH活力測定結(jié)果

L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)經(jīng)乳糖誘導發(fā)酵，采用?；撬針藴室簶硕ǚy定BSH的活力，結(jié)果見圖5。由圖5可知，L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)的培養(yǎng)上清液中BSH活力為42.57 U/mL，其細胞裂解液中的BSH活力為4.34 U/mL，說明L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)代謝產(chǎn)生的BSH有90.7%的量全部分泌到了胞外。而野生型菌株L.plantarumDPP8的培養(yǎng)上清液中BSH活力為5.71 U/mL，L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)的培養(yǎng)上清液中BSH活力是野生型菌株L.plantarumDPP8的7.46倍。

1：L. plantarum DPP8培養(yǎng)上清液；2：L. plantarum DPP8細胞裂解液；3：L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)培養(yǎng)上清液；4：L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)細胞裂解液。

2.5 L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)降膽固醇能力測定結(jié)果

采用OPA法對發(fā)酵的含膽固醇MRS培養(yǎng)基中的膽固醇含量進行測定，結(jié)果見表1。由表1可知，野生型菌株L.plantarumDPP8的膽固醇降解率為35.77%，重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)的膽固醇降解率為94.43%，說明重組菌株的降膽固醇能力得到了提升。

表1 L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)降膽固醇解能力測定結(jié)果

3 討 論

BSH是一種能夠?qū)Ｒ凰饽懰猁}和甘氨酸鹽等類物質(zhì)生成氨基酸和非結(jié)合態(tài)膽酸的蛋白酶，其降低膽固醇的機理是代謝產(chǎn)生的非結(jié)合態(tài)膽酸能與膽固醇結(jié)合形成沉淀，隨糞便排出體外，從而降低介質(zhì)中的膽固醇含量[18-19]。它常常存在于微生物體內(nèi)，是由微生物代謝產(chǎn)生的一種酶，尤其是在乳酸桿菌類中最為常見，經(jīng)常服用乳酸桿菌制劑或酸奶能夠改善血脂調(diào)節(jié)血流變，這可能就是因為這類產(chǎn)品具有降膽固醇功效的原因[20-21]。本團隊在前期研究中分離獲得了1株產(chǎn)BSH的L.plantarumDPP8[16]，本試驗又成功克隆了其BSH基因。從GenBank中提交的BSH基因的信息分析，BSH基因絕大部分來自于L.plantarum、格氏乳桿菌(L.gasseri)、棒狀乳桿菌(L.coryniformis)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、唾液乳桿菌(L.salivarius)等[22]，但這些不同菌株來源的BSH基因差異較大，同源性最低35.7%，最高可達99.6%，所以BSH存在基因多樣性，說明這些不同來源的BSH在關鍵酶活性位點的空間結(jié)構(gòu)是相同或相近的。因此，L.plantarumDPP8BSH基因的克隆豐富了BSH基因庫，對于進一步研究其降膽固醇機制具有重要意義。

目前，關于產(chǎn)BSH的乳酸菌的報道很多，但BSH的體外活力一般均較低[22-23]。本團隊所分離篩選的1株降膽固醇乳酸菌L.plantarumDPP8，其所產(chǎn)BSH的活力僅為5.78 U/mL，對培養(yǎng)基中膽固醇的降解率為35.93%[16]，說明野生型乳酸菌產(chǎn)BSH以及降膽固醇能力均有限。通過基因工程技術(shù)利用高效表達系統(tǒng)是實現(xiàn)高產(chǎn)BSH的最有效途徑之一。Yu等[10]將來源于L.plantarumM1-UVS29的BSH基因重組于乳酸乳球菌(L.lactis)NZ9000表達系統(tǒng)，表達的BSH活力為0.77 μmol/min。唐雅茹等[24]將4種BSH基因(BSH1、BSH2、BSH3、BSH4)在L.plantarumKLDS1.0386中進行表達，并證明了不同濃度的不同膽鹽底物均可上調(diào)BSH的表達。黃艷娜等[25]同樣也是將4種BSH基因(BSH1、BSH2、BSH3、BSH4)在L. case LC2w中進行表達研究，表達產(chǎn)物中BSH活力分別為85.06、77.75、45.75、46.50 U/mL。本研究所利用的L.case表達系統(tǒng)L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)，前期對表達載體pMJ67進行了改造，將短小乳桿菌(L.brevis)1.2028的信號肽基因插入到了pMJ67的啟動子之后，從而能夠?qū)崿F(xiàn)目的蛋白的分泌表達。試驗結(jié)果也驗證了這個載體分泌的有效性，約90.7%的BSH被分泌到了胞外，其活力是野生型菌株L.plantarumDPP8的7.46倍，而且能降解培養(yǎng)基中94.43%的膽固醇，遠遠超出了野生型菌株L.plantarumDPP8 35.77%的膽固醇降解率，說明重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)不僅實現(xiàn)了BSH的高效表達，而且所分泌的BSH具有天然的蛋白活性。L.casei本身就是一種益生菌，國際上公認許可用作食品或飼料添加劑，因此重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)更具有重要的現(xiàn)實意義，如可用于酸奶發(fā)酵可制作功能奶，用于秸稈青貯制作高質(zhì)量的飼料，或直接將其作為活菌飼料添加劑，這些產(chǎn)品用于人或動物均會使重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)及其代謝產(chǎn)生的BSH進入機體內(nèi)，從而可以降低體內(nèi)膽固醇的含量，間接達到預防或改善體內(nèi)脂類的代謝的目的。

4 結(jié) 論

本試驗成功克隆了L.plantarumDPP8的BSH基因，并將其重組入了L.casei表達系統(tǒng)L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)中，實現(xiàn)了BSH在L.caseiCECT5276中的高效分泌表達，其活力可達42.57 U/mL，并可使培養(yǎng)基中膽固醇的降解率達94.43%。