丁 軻 余祖玲 王鐠蒂 余祖華 李 旺 李元曉 何萬領(lǐng) 曹平華 張春杰 劉 寧
(1.河南科技大學(xué)宏翔生物飼料實(shí)驗(yàn)室,洛陽471003;2.洛陽市活載體生物材料與動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,洛陽471003)
膽固醇是一種甾體化合物,廣泛存在于動(dòng)物性食品內(nèi),在肝臟、腦、膽汁、蛋等中含量較高。隨著人們生活水平的提高,動(dòng)物性食品在飲食結(jié)構(gòu)中的比例逐漸上升,導(dǎo)致膽固醇攝入過量,引起血清膽固醇含量增高,從而會(huì)引發(fā)冠心病、高血壓、高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化等一系列心腦血管疾病,在中老年群體中尤其普遍[1-3]。據(jù)調(diào)查,當(dāng)前因疾病死亡的人數(shù)中有約40%的疾病是由直接或間接高膽固醇所引起,是人類疾病的第一大殺手[4-5]。降低血清膽固醇含量可有效防止心血管疾病的發(fā)生,提高人們的健康指數(shù)[6-7],其有效途徑:一是從源頭控制,即降低食品源中膽固醇的含量,以減少人們對(duì)膽固醇的攝入量和攝入機(jī)會(huì),二是降低體內(nèi)的膽固醇含量,即通過干預(yù)手段降低血液中膽固醇的含量。降低體內(nèi)膽固醇含量最有效的方法是使用膽鹽水解酶(BSH),BSH是微生物生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物,具有較強(qiáng)的降解膽固醇的能力[8]。據(jù)報(bào)道,產(chǎn)生BSH的菌株主要來自于乳酸菌,如植物乳桿菌(L.plantarum)[9-10]、干酪乳桿菌(L.casei)[11]、布氏乳桿菌(L.buchneri)[12]、雙歧桿菌(Bifidobacterium)等[13]。另外,在擬桿菌屬(Bacteroides)和腸球菌屬(Enterococcus)的細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)有BSH[14-15]。但一般情況下,野生型菌株降解膽固醇的能力均有限,不能完全滿足臨床需要。因此,很有必要利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)將BSH基因在高效表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá),后期無論其純化酶或基因工程菌均具有極好的應(yīng)用前景。
本實(shí)驗(yàn)室前期已分離鑒定了1株L.plantarum——L.plantarumDPP8,GenBank登錄號(hào)為KR824936,菌種保藏號(hào)為CCTCC M2016136,試驗(yàn)證明其基因組上含有1個(gè)975 bp的BSH基因,并可降解培養(yǎng)基中35.93%的膽固醇,降解率有限[16]。為了提高BSH基因的表達(dá)量,本試驗(yàn)擬利用PCR技術(shù)克隆BSH基因,將其重組于表達(dá)載體pMJ67-sp中,電轉(zhuǎn)入L.caseiCECT5276中進(jìn)行表達(dá)研究,以期獲得能夠高效表達(dá)BSH的重組L.caseiCECT5276,將其開發(fā)成為功能性活菌飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn),能夠高效降低動(dòng)物性產(chǎn)品中膽固醇含量,從而為人類提供更為健康的動(dòng)物性食品。
1.1.1 菌株與質(zhì)粒
L.plantarumDPP8,本實(shí)驗(yàn)室分離保存;pMD18-T,購自大連寶生物工程有限公司;表達(dá)質(zhì)粒pMJ67、L.caseiCECT5276由荷蘭Gasper教授贈(zèng)送;pMJ67-sp,本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。
1.1.2 培養(yǎng)基
MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,牛肉膏10 g,酵母提取物5 g,磷酸氫二鉀2 g,乙酸鈉5 g,檸檬酸二銨2 g,葡萄糖20 g,吐溫-80 1 mL,七水硫酸鎂0.58 g,四水硫酸錳0.25 g,瓊脂粉 15 g,水1 000 mL,調(diào)pH至6.2~6.4,115 ℃、0.105 MPa滅菌15 min。
降膽固醇培養(yǎng)基:含2%膽固醇的MRS液體培養(yǎng)基。
BSH誘導(dǎo)培養(yǎng)基:含2%?;悄懰徕c的MRS液體培養(yǎng)基。
LB液體培養(yǎng)基:胰化蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉5 g,調(diào)pH至7.0,121 ℃、0.12 MPa滅菌20 min。
1.1.3 生化試劑及工具酶
聚合酶PyrobestTMDNA Polymerase、DL2000 Marker、λDNA/HindⅢ、限制性切酶NdeⅠ、EcoRⅠ,PCR回收試劑盒、T4 DNA Ligase,IPTG、X-gal、Goldview購自大連寶生物工程有限公司;細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購自天根生化科技(北京)有限公司。
1.3.1 引物設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank中已登錄的L.plantarumBSH基因(登錄號(hào):MBUL90)序列,利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物,bsh1:5’-CGCATATGATGTGTACTGCCATAACT-3’(劃線部分為NdeⅠ位點(diǎn))和bsh2:5’-CGGAATTCGTTAACTGCATAGTATTG-3’(劃線部分為EcoRⅠ位點(diǎn)),送至上海生物工程股份有限公司合成。
1.3.2L.plantarumDPP8基因組DNA的提取
將培養(yǎng)的L.plantarumDPP8按照天根生化科技(北京)有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的方法提取其基因組DNA。
1.3.3BSH基因的克隆
以L.plantarumDPP8基因組DNA為模板,利用引物bsh1和bsh2進(jìn)行擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系為:上游引物1.5 μL(20 pmol/L)、下游引物1.5 μL(20 pmol/L、10×PCR Buffer 5μL、dNTPs 1 μL (10 pmol/L)、Pyrobest DNA Polymerase 0.5 μL(5 U/μL)、模板DNA 4 μL,加滅菌超純水至50 μL。反應(yīng)條件:模板DNA 95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 40 s、62 ℃ 1 min、72 ℃ 90 s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。利用天根生化科技(北京)有限公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收,然后將擴(kuò)增產(chǎn)物連接于pMD18-T,得到克隆質(zhì)粒pMD18-BSH。將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,并進(jìn)行同源性比較,確定是否是BSH基因。
1.3.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建
利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ分別對(duì)鑒定正確的克隆質(zhì)粒pMD18-BSH與表達(dá)載體pMJ67-sp進(jìn)行雙酶切,分別回收目的條帶,16 ℃條件下經(jīng)T4連接酶連接過夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)109,在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性菌株。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,采用PCR法、雙酶切及測(cè)序進(jìn)行鑒定,將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pMJ67-sp-BSH。
將100 μL感受態(tài)乳酸桿菌與5 μL(300~500 ng) pMJ67-sp-BSH在冰浴下混勻,然后加入到冰浴預(yù)冷的0.1 cm的電轉(zhuǎn)化杯中,冰上放置10 min。在電壓600~1 200 V、電容25 μF、電阻100 Ω條件下進(jìn)行電擊,電擊后立即加入0.9 mL預(yù)冷的含10%蔗糖的MRS,轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,37 ℃孵育2 h后,取200 μL涂于含5 μg/mL的紅霉素抗性的MRS平板上,37 ℃厭氧培養(yǎng)40 h。在平板上挑取陽性克隆,采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取乳酸桿菌基因組,利用引物bsh1和bsh2參照步驟1.3.3進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定,并將擴(kuò)增后的序列進(jìn)行測(cè)序,鑒定正確的即為重組L.caseiCECT5276——L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)。
1.3.5 重組L.caseiCECT5276 BSH的表達(dá)與純化
1)表達(dá)產(chǎn)物濃縮:將陽性重組L.caseiCECT5276接種于加有2%牛磺膽酸鈉的MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)至600 nm處吸光度值(OD600 nm)=0.5時(shí)加入0.5%的乳糖,誘導(dǎo)培養(yǎng)36 h,將菌液5 000 r/min離心8 min,取上清液。向100 mL上清液中加入150 mL聚乙二醇6000(PEG6000),攪拌至完全沉淀,5 000 r/min離心10 min,棄上清液,用0.01 mol/L(pH 7.4)的磷酸鹽緩沖液(PBS)懸浮沉淀,4 ℃透析48 h,重復(fù)5~6次,4 ℃、10 000 r/min離心20 min,棄沉淀,上清液透析48 h,重復(fù)5~6次,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
3)鑒定:將濃縮液和純化液于15%的垂直板凝膠中進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),以未誘導(dǎo)的L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)、L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)和誘導(dǎo)的L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)為對(duì)照。
1.3.6L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH) BSH活力測(cè)定
將L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)于37 ℃用0.5%的乳糖厭氧誘導(dǎo)培養(yǎng)36 h,離心分離上清和沉淀。后者用PBS(pH 6.0)洗2次后,加冰預(yù)冷的PBS,混勻,于冰上用超聲破碎儀破碎細(xì)胞后,于4 ℃、5 000 r/min離心10 min,取上清液。分別以上述培養(yǎng)上清液和菌體裂解上清液為粗酶液進(jìn)行BSH活力測(cè)定,同時(shí)以野生型菌株L.plantarumDPP8為對(duì)照。樣品管和空白對(duì)照管分別加入55 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液0.3 mL,0.01 mmol/L巰基乙醇溶液0.3 mL,0.5 mmol/L pH 6.0 PBS 0.3 mL,0.12 mmol/L?;悄懰徕c0.1 mL,雙蒸水0.3 mL。將上述溶液用移液槍反復(fù)吹打混勻后,置37 ℃恒溫水浴鍋中孵育10 min,向樣品管和空白對(duì)照管中分別加入1.5和1.2 mL 15%的三氯乙酸,同時(shí)吸取0.2 mL的粗酶液加入樣品管中,徹底混勻后,于4 ℃、1 000 r/min離心10 min,分別吸取0.8 mL樣品管和空白對(duì)照管上清液,各加入1.8 mL顯色液(0.3 mL 2%茚三酮-檸檬酸鹽溶液、1.5 mL 30%甘油),當(dāng)樣品管和空白對(duì)照管與顯色液徹底混勻后,塞上棉塞于水浴鍋中沸水浴15 min,冷卻至常溫,在570 nm處測(cè)定吸光度值(OD570 nm)。BSH活力定義為:每分鐘每毫升粗酶液反應(yīng)產(chǎn)生?;撬岬奈⒛枖?shù)。
BSH活力(U/mL)=A×4 000/30。
式中:A表示牛磺酸的微摩爾數(shù)。
取0.5 mmol/L的牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)液,配制成5個(gè)不同濃度的工作液(0.083、0.167、0.250、0.333、0.417 mmol/L),繪制?;撬針?biāo)準(zhǔn)曲線。
1.3.7L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)降膽固醇能力測(cè)定
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定:取1.0 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液,配制成5個(gè)不同濃度的工作液(20、40、60、80、100 μg/mL),然后各取1.0 mL參照文獻(xiàn)[17]采用鄰苯二甲醛(OPA)法對(duì)膽固醇含量進(jìn)行測(cè)定。以1.0 mL無水乙醇作為空白對(duì)照,每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次,取平均值。
將L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)接種到MRS培養(yǎng)基中活化后,按2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種于10 mL降膽固醇培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧靜止培養(yǎng),每隔12 h搖勻1次,培養(yǎng)48 h后,吸取混勻的菌液1.0 mL,5 000 r/min離心10 min,檢測(cè)培養(yǎng)液中膽固醇的殘余量。分別以L.caseiCECT5276 (pMJ67-sp)和L.plantarumDPP8為對(duì)照。膽固醇降解率計(jì)算公式為:
D(%)=[(A-B)/A]×100。
式中:D為膽固醇降解率;A為未接種菌株培養(yǎng)上清液中膽固醇含量;B為重組干酪乳桿菌發(fā)酵后培養(yǎng)上清液中膽固醇含量。
試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2017軟件進(jìn)行處理,試驗(yàn)結(jié)果以平均值+標(biāo)準(zhǔn)誤表示,并采用Excel 2017軟件進(jìn)行圖形繪制。
以L.plantarumDPP8基因組DNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增后,擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳,結(jié)果如圖1所示,在約975 bp處有1條特異性條帶,與預(yù)期大小相符。將克隆質(zhì)粒pMD18-BSH測(cè)序,結(jié)果表明該基因全長(zhǎng)為975 bp。同源性比較顯示該基因與L.plantarumMBUL69的BSH基因同源性高達(dá)99.6%。進(jìn)化樹分析顯示該基因與L.plantarumMBUL69的BSH基因在同一分支。上述結(jié)果表明本試驗(yàn)克隆獲得了L.plantarumDPP8源的BSH基因(GenBank登錄號(hào)為:KT343778)。
1和2:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;3:陰性對(duì)照;M:DL2000 Marker。
將表達(dá)載體pMJ67-sp與pMD18-BSH同時(shí)用NdeⅠ和EcoRⅠ酶切后進(jìn)行連接,得到重組表達(dá)載體pMJ67-sp-BSH。質(zhì)粒pMJ67-sp-BSH PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切鑒定結(jié)果見圖2,NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切后得到2條分別約為5 000和975 bp的條帶,EcoRⅠ單酶切得到1條約為6 000 bp的條帶,采用引物bsh1/bsh2進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到1條約為975 bp的條帶,均與預(yù)期大小相符,說明重組表達(dá)載體pMJ67-sp-BSH構(gòu)建成功。
M1:DL2000 Marker;1:NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切pMJ67-sp-BSH:2:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;3:EcoRⅠ單酶切pMJ67-sp-BSH;M2:λDNA/HindⅢ Marker。
表達(dá)載體pMJ67-sp-BSH電轉(zhuǎn)化L.caseiCECT5276,通過紅霉素抗性平板篩選陽性菌株后,利用引物bsh1/bsh2對(duì)陽性菌株基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖3可知,L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)能夠擴(kuò)增出約975 bp的條帶,證明BSH基因已成功整合到了L.caseiCECT5276基因組上。
經(jīng)乳糖誘導(dǎo)后的重組L.caseiCECT5276用15%凝膠進(jìn)行SDS-PAGE,其結(jié)果見圖4。由圖4可知,在泳道1約37 ku處有1條清晰的蛋白條帶,與推測(cè)的BSH蛋白分子質(zhì)量大小相符,說明BSH在L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)中得到了表達(dá)。而未誘導(dǎo)的重組L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)和誘導(dǎo)的原始菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)在約37 ku處也有淺淡的條帶,說明原始菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)和未誘導(dǎo)重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)基因組上也能分泌產(chǎn)生類似大小的蛋白,但該蛋白的表達(dá)不受乳糖誘導(dǎo)的影響。
1和2:L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;3: L.casei CECT5276(pMJ67-sp)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;M: DL2000 Marker。
1:L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)未誘導(dǎo)產(chǎn)物;2:L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)誘導(dǎo)產(chǎn)物;3:L. casei CECT5276(pMJ67-sp)未誘導(dǎo)產(chǎn)物;4:L. casei CECT5276(pMJ67-sp)誘導(dǎo)產(chǎn)物;5:純化蛋白;M:標(biāo)準(zhǔn)Marker。
L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)經(jīng)乳糖誘導(dǎo)發(fā)酵,采用牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)定法測(cè)定BSH的活力,結(jié)果見圖5。由圖5可知,L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)的培養(yǎng)上清液中BSH活力為42.57 U/mL,其細(xì)胞裂解液中的BSH活力為4.34 U/mL,說明L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)代謝產(chǎn)生的BSH有90.7%的量全部分泌到了胞外。而野生型菌株L.plantarumDPP8的培養(yǎng)上清液中BSH活力為5.71 U/mL,L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)的培養(yǎng)上清液中BSH活力是野生型菌株L.plantarumDPP8的7.46倍。
1:L. plantarum DPP8培養(yǎng)上清液;2:L. plantarum DPP8細(xì)胞裂解液;3:L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)培養(yǎng)上清液;4:L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)細(xì)胞裂解液。
采用OPA法對(duì)發(fā)酵的含膽固醇MRS培養(yǎng)基中的膽固醇含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表1。由表1可知,野生型菌株L.plantarumDPP8的膽固醇降解率為35.77%,重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)的膽固醇降解率為94.43%,說明重組菌株的降膽固醇能力得到了提升。
表1 L. casei CECT5276(pMJ67-sp-BSH)降膽固醇解能力測(cè)定結(jié)果
BSH是一種能夠?qū)R凰饽懰猁}和甘氨酸鹽等類物質(zhì)生成氨基酸和非結(jié)合態(tài)膽酸的蛋白酶,其降低膽固醇的機(jī)理是代謝產(chǎn)生的非結(jié)合態(tài)膽酸能與膽固醇結(jié)合形成沉淀,隨糞便排出體外,從而降低介質(zhì)中的膽固醇含量[18-19]。它常常存在于微生物體內(nèi),是由微生物代謝產(chǎn)生的一種酶,尤其是在乳酸桿菌類中最為常見,經(jīng)常服用乳酸桿菌制劑或酸奶能夠改善血脂調(diào)節(jié)血流變,這可能就是因?yàn)檫@類產(chǎn)品具有降膽固醇功效的原因[20-21]。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中分離獲得了1株產(chǎn)BSH的L.plantarumDPP8[16],本試驗(yàn)又成功克隆了其BSH基因。從GenBank中提交的BSH基因的信息分析,BSH基因絕大部分來自于L.plantarum、格氏乳桿菌(L.gasseri)、棒狀乳桿菌(L.coryniformis)、發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)、唾液乳桿菌(L.salivarius)等[22],但這些不同菌株來源的BSH基因差異較大,同源性最低35.7%,最高可達(dá)99.6%,所以BSH存在基因多樣性,說明這些不同來源的BSH在關(guān)鍵酶活性位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)是相同或相近的。因此,L.plantarumDPP8BSH基因的克隆豐富了BSH基因庫,對(duì)于進(jìn)一步研究其降膽固醇機(jī)制具有重要意義。
目前,關(guān)于產(chǎn)BSH的乳酸菌的報(bào)道很多,但BSH的體外活力一般均較低[22-23]。本團(tuán)隊(duì)所分離篩選的1株降膽固醇乳酸菌L.plantarumDPP8,其所產(chǎn)BSH的活力僅為5.78 U/mL,對(duì)培養(yǎng)基中膽固醇的降解率為35.93%[16],說明野生型乳酸菌產(chǎn)BSH以及降膽固醇能力均有限。通過基因工程技術(shù)利用高效表達(dá)系統(tǒng)是實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)BSH的最有效途徑之一。Yu等[10]將來源于L.plantarumM1-UVS29的BSH基因重組于乳酸乳球菌(L.lactis)NZ9000表達(dá)系統(tǒng),表達(dá)的BSH活力為0.77 μmol/min。唐雅茹等[24]將4種BSH基因(BSH1、BSH2、BSH3、BSH4)在L.plantarumKLDS1.0386中進(jìn)行表達(dá),并證明了不同濃度的不同膽鹽底物均可上調(diào)BSH的表達(dá)。黃艷娜等[25]同樣也是將4種BSH基因(BSH1、BSH2、BSH3、BSH4)在L. case LC2w中進(jìn)行表達(dá)研究,表達(dá)產(chǎn)物中BSH活力分別為85.06、77.75、45.75、46.50 U/mL。本研究所利用的L.case表達(dá)系統(tǒng)L.caseiCECT5276(pMJ67-sp),前期對(duì)表達(dá)載體pMJ67進(jìn)行了改造,將短小乳桿菌(L.brevis)1.2028的信號(hào)肽基因插入到了pMJ67的啟動(dòng)子之后,從而能夠?qū)崿F(xiàn)目的蛋白的分泌表達(dá)。試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這個(gè)載體分泌的有效性,約90.7%的BSH被分泌到了胞外,其活力是野生型菌株L.plantarumDPP8的7.46倍,而且能降解培養(yǎng)基中94.43%的膽固醇,遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了野生型菌株L.plantarumDPP8 35.77%的膽固醇降解率,說明重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)不僅實(shí)現(xiàn)了BSH的高效表達(dá),而且所分泌的BSH具有天然的蛋白活性。L.casei本身就是一種益生菌,國(guó)際上公認(rèn)許可用作食品或飼料添加劑,因此重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)更具有重要的現(xiàn)實(shí)意義,如可用于酸奶發(fā)酵可制作功能奶,用于秸稈青貯制作高質(zhì)量的飼料,或直接將其作為活菌飼料添加劑,這些產(chǎn)品用于人或動(dòng)物均會(huì)使重組菌株L.caseiCECT5276(pMJ67-sp-BSH)及其代謝產(chǎn)生的BSH進(jìn)入機(jī)體內(nèi),從而可以降低體內(nèi)膽固醇的含量,間接達(dá)到預(yù)防或改善體內(nèi)脂類的代謝的目的。
本試驗(yàn)成功克隆了L.plantarumDPP8的BSH基因,并將其重組入了L.casei表達(dá)系統(tǒng)L.caseiCECT5276(pMJ67-sp)中,實(shí)現(xiàn)了BSH在L.caseiCECT5276中的高效分泌表達(dá),其活力可達(dá)42.57 U/mL,并可使培養(yǎng)基中膽固醇的降解率達(dá)94.43%。