馬青山 李 艷

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，聊城252000)

我國(guó)是全球最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖國(guó)家，養(yǎng)殖水產(chǎn)品總量逐年增長(zhǎng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年我國(guó)養(yǎng)殖水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)6 450萬(wàn)t，超過(guò)世界養(yǎng)殖水產(chǎn)品總量的70%，為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的供給以及國(guó)家的糧食安全做出了巨大貢獻(xiàn)。目前，高密度、集約化已成為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要模式[1]，然而，養(yǎng)殖密度的不斷提高極易打破池塘原有的生態(tài)平衡，過(guò)多的殘餌、糞便無(wú)法被池塘中的微生物分解利用，導(dǎo)致氨氮、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)積累，影響?zhàn)B殖動(dòng)物健康[2]。此外，不經(jīng)處理的養(yǎng)殖廢水排放到外環(huán)境中產(chǎn)生面源污染，危害養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。生物脫氮不僅安全環(huán)保，而且具有可續(xù)持性，近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化細(xì)菌因其能夠在有氧的條件下進(jìn)行反硝化作用，脫氮徹底，而且具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快及容易控制等潛在優(yōu)點(diǎn)[3-5]，逐漸成為脫氮益生菌中研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。

在益生菌研究和應(yīng)用中，菌種篩選是一個(gè)十分重要的環(huán)節(jié)。然而，由于在菌種篩選過(guò)程中候選菌株眾多而且篩選條件各異，水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的益生菌菌種篩選的方法、標(biāo)準(zhǔn)非常繁雜，導(dǎo)致菌種篩選效率低下；其次，實(shí)驗(yàn)室篩選得到的菌種在養(yǎng)殖試驗(yàn)驗(yàn)證過(guò)程中，其功能往往不能較好的重現(xiàn)，這主要是由于實(shí)驗(yàn)室篩選益生菌的條件或許同其應(yīng)用的環(huán)境有所區(qū)別，從而使益生菌應(yīng)用后在靶位點(diǎn)難以生長(zhǎng)、定植及發(fā)揮功能[6]；此外，某些對(duì)哺乳動(dòng)物有益的微生物應(yīng)用于水生動(dòng)物可能會(huì)產(chǎn)生不利影響。因此，在益生菌菌種篩選過(guò)程中制定適合水產(chǎn)養(yǎng)殖的方法、標(biāo)準(zhǔn)就顯得非常重要。目前，已有很多關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖中好氧反硝化菌種篩選和應(yīng)用的研究[3,7-10]，但尚未見(jiàn)到對(duì)該菌種篩選及評(píng)價(jià)方法進(jìn)行系統(tǒng)綜述的報(bào)道。因此，本文對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中好氧反硝化細(xì)菌的篩選、評(píng)價(jià)方法進(jìn)行歸納、總結(jié)，以期對(duì)好氧反硝化細(xì)菌篩選和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)提供參考，并對(duì)未來(lái)的研究方向進(jìn)行了展望。

1 菌種篩選流程

隨著研究的深入，已有大量好氧反硝化細(xì)菌的研究報(bào)道，主要菌種包括：假單胞菌(Pseudomonassp.)[8]、芽孢桿菌(Bacillussp.)[11]、副球菌(Paracoccussp.)[3]、海桿菌(Marinobactersp.)[12]、鹽單胞菌(Halomonassp.)[13]和紅球菌(Rhodococcussp.)[14]等，然而，尚缺乏對(duì)該菌種篩選和評(píng)價(jià)的系統(tǒng)報(bào)道。通過(guò)歸納、總結(jié)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，好氧反硝化菌種篩選流程和標(biāo)準(zhǔn)如圖1所示。具體而言，好氧反硝化細(xì)菌的篩選包括了樣品采集、富集培養(yǎng)、安全性評(píng)估、菌種鑒定、耐受性評(píng)估、功能性評(píng)估及應(yīng)用試驗(yàn)評(píng)估等主要組成步驟。通過(guò)層層篩選，獲得的菌種需要符合安全性、適應(yīng)性、功能性和便利性等特點(diǎn)[15]。

BTB：溴百里酚藍(lán) bromothymol blue；Y：通過(guò) pass；N：未通過(guò) fail。

2 樣品處理

理想的益生菌，應(yīng)該能夠在宿主的腸道或環(huán)境中定殖、建立和繁殖，然而，某些應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物的益生菌常出現(xiàn)相對(duì)無(wú)效的情況，這或許是由于非魚(yú)類來(lái)源的益生菌無(wú)法在其腸道中生存或保持最佳的活菌數(shù)[16-17]。基于此，好氧反硝化菌種分離常采集的樣本最好選取池塘的水樣、沉積物、微生物絮團(tuán)及水產(chǎn)動(dòng)物腸道等樣本，從這些樣本中篩得的菌種具有更好的適應(yīng)性，即原位/宿主益生菌策略(autochthonous probiotics/host-associated probiotic)。以往研究也發(fā)現(xiàn)，在水、泥、沉積物及生物絮團(tuán)樣品中更易篩得好氧反硝化細(xì)菌，如濱海芽孢桿菌(Bacilluslitoralis)[18]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[19]、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)[20]及Paracoccussaliphilus[21]等菌種，且具有較好的適應(yīng)性。此外，采集的樣本還可以用高濃度的硝酸鹽、亞硝酸鹽及銨鹽作為唯一氮源進(jìn)行富集培養(yǎng)[22]，培養(yǎng)過(guò)程中需要進(jìn)行間歇曝氣以達(dá)到好氧反硝化微生物數(shù)量增加，同時(shí)確保目的菌種的好氧反硝化性能不退化或可得到進(jìn)一步加強(qiáng)[23-24]，通過(guò)富集培養(yǎng)可大幅度提高后續(xù)菌種的篩選效率。

3 菌種初篩

好氧反硝化菌株初步篩選可應(yīng)用溴百里酚藍(lán)(bromothymol blue，BTB)固體培養(yǎng)基[25]，接種的細(xì)菌由于反硝化作用使pH升高，從而產(chǎn)生藍(lán)色暈圈，選取藍(lán)色菌落即可實(shí)現(xiàn)菌種的初篩。應(yīng)用該方法，Chen等[5]從循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的生物濾池中分離到好氧條件下能脫氮的菌株Z1和Z8，Song等[11]分離篩選得到高效脫氮的好氧反硝化菌株凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)XY-6，Shao等[26]也篩選得到脫氮性能較好的好氧反硝化菌種Pseudomonassp. B5。根據(jù)篩選流程，初篩獲得的菌種還需要進(jìn)行安全性評(píng)估、菌種鑒定及耐受性評(píng)價(jià)。

3.1 安全性評(píng)估

眾所周知，水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的微生物菌種必須是安全的，對(duì)魚(yú)蝦不能有致病性。然而，F(xiàn)u等[27]從92種動(dòng)物用益生菌產(chǎn)品中分離出123個(gè)益生菌菌株，其中45個(gè)菌株對(duì)抗生素耐藥，33.7%的益生菌產(chǎn)品被肺炎克雷伯菌等危及生命的病原體污染，而且還發(fā)現(xiàn)了炭疽毒素陽(yáng)性的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)菌株，這對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物及人類的健康構(gòu)成巨大威脅?？梢?jiàn)，篩選用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌菌種，進(jìn)行安全性評(píng)估為最重要一環(huán)。好氧反硝化候選菌種不能含有任何質(zhì)粒編碼的耐藥基因或基因簇[28]，不產(chǎn)生溶血圈，不含有致病基因，不生成毒性代謝產(chǎn)物，且需要結(jié)合體內(nèi)的急性、慢性毒性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證[29]。

3.2 菌種鑒定

好氧反硝化菌種鑒定方法同常規(guī)微生物菌種鑒定方法類似，包括常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化分析、16S rRNA測(cè)序和全基因測(cè)序等。經(jīng)過(guò)菌種鑒定，可獲知菌株的種、屬等信息，這對(duì)進(jìn)一步研究菌種的性能及實(shí)際應(yīng)用提供了重要參考。具體而言，以飼料添加劑形式飼喂的菌種需符合各個(gè)國(guó)家規(guī)定的菌種目錄，如美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)和美國(guó)飼料控制官員協(xié)會(huì)(AAFCO)公布的可直接飼喂微生物菌種名單(46種)、歐盟準(zhǔn)許飼喂的菌種目錄(72種)、我國(guó)《飼料添加劑品種目錄》允許添加的微生物菌種目錄(35種)；而改良水體環(huán)境的菌種目前尚未有明確規(guī)定，但需要符合之前所提到的安全性要求。

3.3 耐受性評(píng)估

益生菌能夠發(fā)揮效果的關(guān)鍵因素之一為耐受所應(yīng)用的環(huán)境，并且能夠在效應(yīng)位點(diǎn)定植生長(zhǎng)，維持較高的活菌水平，而后才能發(fā)揮功效(圖2)。不同于陸生動(dòng)物，益生菌作用水產(chǎn)動(dòng)物的效應(yīng)位點(diǎn)除了動(dòng)物腸道外，還有水環(huán)境。因此，篩選的候選好氧反硝化菌株需要耐受所應(yīng)用的外環(huán)境，包括溫度、鹽度和pH等，飼喂的益生菌還需經(jīng)過(guò)胃酸、膽鹽等的耐受性評(píng)價(jià)[30]。一般而言，能夠較好滿足這一要求的就是選用池塘或水產(chǎn)動(dòng)物腸道的土著菌群，Boutin等[31]在研究美洲紅點(diǎn)鮭(Salvelinusfontinalis)時(shí)發(fā)現(xiàn)，同外源益生菌相比，本土的益生菌不會(huì)干擾魚(yú)皮膚黏液菌群，是調(diào)節(jié)魚(yú)類微生物群落更好的選擇；Ahmmed等[32]也發(fā)現(xiàn)，源于對(duì)蝦腸道的乳酸桿菌能夠更好地適應(yīng)動(dòng)物腸道，而且可抑制病原弧菌的生長(zhǎng)繁殖；Muthukrishnan等[33]研究發(fā)現(xiàn)，本土菌株越南芽胞桿菌(Bacillusvietnamensis)VCM5、BacillusvietnamensisVCM8和支氣管戈登菌(Gordoniabronchialis)VCM12可顯著降低對(duì)蝦養(yǎng)殖廢水中亞硝酸鹽含量，顯示出較好的適應(yīng)性。此外，某些需要在飼料制作過(guò)程中添加的反硝化菌制劑，還需考慮工廠化水產(chǎn)飼料生產(chǎn)的高溫、高壓耐受性，在這種情況下，應(yīng)用芽孢孢子可能更為適宜。

4 菌種的復(fù)篩

好氧反硝化細(xì)菌的復(fù)篩包括：應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基(selective culture medium)計(jì)算菌種脫氮效率、判斷脫氮類型以及借助分子生物學(xué)和組學(xué)手段研究脫氮機(jī)制等步驟[34-37]。

4.1 脫氮效率研究

在好氧反硝化細(xì)菌脫氮效率的研究中選擇性培養(yǎng)基的配方同養(yǎng)殖水體的化學(xué)組成存在差異，如表1所示，選擇性培養(yǎng)基常用氮源為NH4Cl、NaNO3及NaNO2等，常用的碳源為琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、葡萄糖、蔗糖和甘油等。然而，在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中常為有機(jī)碳源缺乏，而且氮源變?yōu)闋I(yíng)養(yǎng)豐富的有機(jī)氮源[18]。篩選培養(yǎng)基的富碳特性在實(shí)際的養(yǎng)殖環(huán)境中很少存在，池塘養(yǎng)殖環(huán)境多為低碳高氮，不同于工業(yè)污水可以額外提供大量廉價(jià)有機(jī)碳源，養(yǎng)殖中大量有機(jī)碳源的應(yīng)用可能會(huì)造成水產(chǎn)動(dòng)物缺氧風(fēng)險(xiǎn)及病原微生物滋生等問(wèn)題出現(xiàn)。基于此，Ma等[38]直接配制0.05 g/L的NaNO2溶液，并在其中僅補(bǔ)充1 g/L粉碎的魚(yú)飼料及糞便以模擬池塘中積累的有機(jī)物質(zhì)，以此反硝化細(xì)菌池塘模擬培養(yǎng)基(pond-simulating denitrification screening medium,PSDSM)進(jìn)行菌種篩選，獲得了脫氮效率理想的好氧反硝化菌株BacillussubtilisM 7-1，同時(shí)，大田應(yīng)用試驗(yàn)證實(shí)，該菌株對(duì)養(yǎng)殖池塘中的無(wú)機(jī)氮也具有較高的降解率[39]。Cui等[40]在有機(jī)氮(蛋白胨、尿素)存在的情況下，研究反硝化細(xì)菌海洋著色菌(Marichromatiumgracile)YL28脫氮性能，發(fā)現(xiàn)存在有機(jī)氮源且添加海藻寡糖后，YL28對(duì)無(wú)機(jī)氮的去除能力顯著增強(qiáng)?？梢?jiàn)，在反硝化細(xì)菌的篩選過(guò)程中，培養(yǎng)基中氮源、碳源的選擇及適宜的碳氮比關(guān)系著篩得菌株的脫氮性能，研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)好氧反硝化細(xì)菌的最佳碳氮比在8～10[41-42]，然而，養(yǎng)殖池塘中一般碳氮比在6～8，因此在篩選培養(yǎng)基配制需考慮這一差異，或在應(yīng)用中補(bǔ)充緩釋碳源以確保菌種的脫氮功能[43]。

圖2 益生菌在魚(yú)類腸道和水體中定植后的作用

溫度是反硝化過(guò)程的重要參數(shù)之一，已有研究顯示，好氧反硝化細(xì)菌脫氮的適宜溫度范圍為25～37 ℃[37,44-45]。因此，在菌種篩選的過(guò)程中培養(yǎng)溫度可設(shè)定為28～30 ℃(表1)，但考慮冷水魚(yú)養(yǎng)殖及春秋季節(jié)水體脫氮的需要，嗜冷(10～15 ℃)好氧反硝化細(xì)菌的篩選也尤為重要。He等[46]研究發(fā)現(xiàn)，好氧反硝化菌臺(tái)灣假單胞菌(Pseudomonastaiwanensis)在15 ℃下對(duì)硝酸鹽的去除率為100%，具備低溫脫氮能力。然而，隨著溫度的降低，菌種的反硝化效率也會(huì)隨之降低；Saleh-Lakha等[47]研究表明，在10 ℃條件下，好氧反硝化菌孟氏假單胞菌(Pseudomonasmandelii)同硝化和反硝化作用相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生滯后和延遲。由此可見(jiàn)，培養(yǎng)溫度的設(shè)定需要綜合考慮菌種最適條件及所應(yīng)用的環(huán)境這2方面因素。

鹽度也影響著好氧反硝化細(xì)菌的脫氮效率。研究表明，海水養(yǎng)殖的鹽濃度(20‰～35‰)已可抑制常見(jiàn)細(xì)菌的酶系統(tǒng)并可發(fā)生溶菌作用[48]。在反硝化方面，Deng等[49]研究表明，在高鹽濃度下，反硝化過(guò)程的功能基因nirK和nosZ的表達(dá)豐度大大降低，抑制了細(xì)菌的反硝化活性。而同時(shí)，耐鹽好氧反硝化細(xì)菌也已有研究報(bào)道，Al-Rubaye等[50]已從鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)、海源菌屬(Idiomarina)、大洋芽胞桿菌屬(Oceanobacillus)和枝芽孢菌屬(Virgibacillus)等種屬中分篩到反硝化嗜鹽菌；Li等[51]從青島膠州灣海水沉積物中分離出1株反硝化海洋嗜鹽菌弧菌；而Mével等[52]分離篩選的Bacillussp.能夠在16 g/L的NaCl中進(jìn)行好氧反硝化作用，這些研究對(duì)篩選海水養(yǎng)殖中應(yīng)用的耐鹽好氧反硝化細(xì)菌提供依據(jù)。

通過(guò)調(diào)整搖床轉(zhuǎn)速以提供好氧反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)所需的溶氧，一般而言搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為150～200 r/min(表1)。然而，不同菌種適宜的溶氧濃度不同，即便相同種類的好氧反硝化細(xì)菌在不同溶氧情況下脫氮能力也存在差異[4]，比如某些好氧反硝化細(xì)菌對(duì)高溶氧具有較高的耐受。Robertson等[53]研究發(fā)現(xiàn)，在溶解氧濃度為80%～90%的培養(yǎng)基中，泛硫代酵母也具有反硝化酶活性；無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)能夠在溶氧濃度為3～10 mg/L條件下進(jìn)行好氧反硝化脫氮[54]，而芽孢桿菌則可在溶氧濃度為3.93～7.65 mg/L條件下發(fā)生反硝化作用[55]。但考慮到微生物同養(yǎng)殖動(dòng)物可能存在的爭(zhēng)氧問(wèn)題，篩選兼具有好氧和厭氧反硝化能力的微生物或更具有實(shí)用性[56]。

4.2 脫氮類型研究

在脫氮類型方面，能夠同時(shí)進(jìn)行異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的菌株具備更高的脫氮效率，如ParacoccussaliphilusSPUM、BacilluslitoralisN31、Marinobactersp.、BacilluscereusPB45及鹽田鹽單胞菌(Halomonascampisalis)等(表1)。然而，不同菌種脫氮效率、脫氮類型有較大差異，這或許同反硝化細(xì)菌所含酶系的種類和數(shù)量不同有關(guān)。廖紹安等[57]應(yīng)用間歇曝氣法分篩獲得嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)，測(cè)序發(fā)現(xiàn)該菌株未發(fā)現(xiàn)亞硝酸還原酶基因nirK序列，只鑒定了nirS基因序列；從廢水處理的活性污泥中分離篩選的鹽單胞菌屬細(xì)菌(Halomonassp.)則鑒定出多種脫氮相關(guān)的酶類，可同步發(fā)生硝化和反硝化反應(yīng)，脫氮效率較為理想[58]；Wan等[59]對(duì)脫氮類型為好氧反硝化的假單胞菌yy7進(jìn)行分析，確定該菌株含有nirK、norB和nosZ等多個(gè)同反硝化相關(guān)的基因，這些功能基因同菌種的反硝化性能密切相關(guān)。

4.3 脫氮機(jī)制研究

篩選的好氧反硝化菌株可通過(guò)PCR及全基因組測(cè)序獲取脫氮相關(guān)的酶系基因，從而進(jìn)一步分析其脫氮機(jī)制。如表2所示，反硝化反應(yīng)在硝酸還原酶(nitrate reductase)、亞硝酸還原酶(nitrite reductase)、一氧化氮還原酶(nitric oxide reductase)及一氧化二氮還原酶(nitrous oxide reductase)的催化作用下進(jìn)行。

表1 好氧反硝化細(xì)菌篩選培養(yǎng)基及篩選條件

續(xù)表1樣品(來(lái)源)Samples (source)選擇性培養(yǎng)基(每升含)Selective medium (per liter contained)篩選條件Screening conditions菌株Strains脫氮類型Denitrification mode參考文獻(xiàn)Reference水樣(草魚(yú)池) Water (grass carp pond)檸檬酸鈉5.66 g,Na2HPO4 7.9 g,NaNO3 0.841 5 g (DM)/NaNO2 0.683 g (NDM)/NH4Cl 0.529 6 g(NM),KH2PO4 1.5 g,MgSO4·7H2O 0.01 g,TE溶液2 mL30 ℃、200 r/min施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri) F11反硝化[20]30 ℃、200 r/min枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) SC02反硝化[19]30 ℃、180 r/min地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)BSK-4好氧反硝化[60]水樣(海洋養(yǎng)殖系統(tǒng)中的生物曝氣過(guò)濾系統(tǒng)) Water (biological aerated filter in a marine aquaculture system)DM: KNO3 1 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,CaCl2 0.01 g,EDTA (0.5 mol/L) 0.5 mL,KH2PO4 0.5 g,Na2HPO4 0.5 g,FeSO4 0.01 g,NaCl 20 g,TE溶液5 mLNM: (NH4)2SO4 0.66 g,琥珀酸鈉1.35 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,EDTA (0.5 mol/L) 0.5 mL,KH2PO4 0.5 g,Na2HPO4 0.5 g,TE溶液5 mLNDM: NaNO2 0.276 g,琥珀酸鈉3.16 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,EDTA (0.5 mol/L) 0.5 mL,KH2PO4 0.5 g,Na2HPO4 0.5 g,FeSO4 0.01 g,NaCl 20 g,TE溶液5 mL30 ℃、150 r/min海桿菌(Marinobactersp.)異養(yǎng)硝化-好氧反硝化[34]海水(西太平洋) Sea water (Western Pacific ocean)琥珀酸鈉4.72 g,KH2PO4 1 g,MgSO4·7H2O 1 g,CaCl2·2H2O 0.2 g,FeSO4·7H2O 0.05 g,NaNO2 0.002 5 g30 ℃、180 r/min蒙氏假單胞菌(Pseudomonas monteilii) CY06好氧反硝化[8]水及泥樣(蝦池) Water and soil (shrimp pond)琥珀酸鈉4.72 g,NaNO2 0.05 g,KH2PO4 1.5 g,Na2HPO4 0.42 g,MgSO4·7H2O 1 g30 ℃、150 r/min蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus) PB88好氧反硝化[60](NH4)2SO4 0.5 g,KH2PO4 0.7 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl2·2H2O 0.5 g,TE溶液1 mL30 ℃、200 r/min蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus) PB45異養(yǎng)硝化-好氧反硝化[61]琥珀酸鈉4.72 g,NaNO2 0.05 g,KH2PO4 1.5 g,Na2HPO4 0.42 g,MgSO4·7H2O 1 g30 ℃、200 r/min芽孢桿菌(Bacillus sp.)YX-6好氧反硝化[11]檸檬酸鈉8.5 g,KH2PO4 1 g,MgSO4·7H2O 1 g,CaCl2·6H2O 0.2 g, FeCl3·6H2O 0.05 g32 ℃、120 r/min海桿菌(Marinobactersp.)好氧反硝化[62]

表2 反硝化反應(yīng)中的催化酶及基因

5 應(yīng)用研究

6 小 結(jié)

綜上所述，好氧反硝化細(xì)菌在養(yǎng)殖池塘的生物脫氮方面具有突出的優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用潛力，但不同菌種或相同菌種在不同條件下脫氮效率差別較大，可從樣品采集、培養(yǎng)基配制、培養(yǎng)方式及評(píng)價(jià)方法等方面優(yōu)選適合好氧反硝化細(xì)菌的方法、標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)好氧反硝化細(xì)菌菌種的快速、高效篩選。未來(lái)還需重點(diǎn)研究的內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面：1)結(jié)合養(yǎng)殖水環(huán)境特點(diǎn)配制篩選培養(yǎng)基(碳源、氮源和碳氮比等)、設(shè)置篩選條件(溶氧、pH、溫度和鹽度等)，篩選適合養(yǎng)殖水環(huán)境的好氧反硝化細(xì)菌；2)借助宏基因組測(cè)序技術(shù)，對(duì)養(yǎng)殖水體中反硝化脫氮菌群進(jìn)行全面分析，從而挖掘更高效、耐受性更強(qiáng)的生物脫氮菌株；3)應(yīng)用多組學(xué)技術(shù)(如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué))從不同層次闡明好氧反硝化機(jī)理，比如蛋白質(zhì)組學(xué)可用于研究反硝化酶活性中心的鐵、銅等元素功能，通過(guò)代謝組學(xué)還可分析不同碳源在反硝化過(guò)程中關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的變化；4)利用群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)的理論及技術(shù)，開(kāi)展反硝化細(xì)菌之間或同其他益生菌的共培養(yǎng)、共發(fā)酵(co-culture)研究。不同微生物共存的菌系能夠達(dá)到某種協(xié)同效應(yīng)，可進(jìn)一步提高脫氮效率，而且復(fù)合菌系還具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，建議對(duì)其深入研究并應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，從而實(shí)現(xiàn)更持久、更高效的養(yǎng)殖水體生物脫氮。