崔耀明 管軍軍 王金榮 齊廣海

(1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州450000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京100081)

據(jù)中國(guó)畜牧業(yè)協(xié)會(huì)公布的數(shù)據(jù)，2019年我國(guó)商品代白羽肉雞、黃羽肉雞、肉雜雞出欄量分別為44億、49億和18億只，肉雞出欄量總量達(dá)到111億只?？梢?jiàn)，肉雞產(chǎn)業(yè)在我國(guó)占據(jù)著非常重要的地位?，F(xiàn)代肉雞在品種選育過(guò)程中，因過(guò)分注重肉雞肌肉生長(zhǎng)速度而導(dǎo)致其骨骼發(fā)育相對(duì)滯后，腿病問(wèn)題嚴(yán)重[1]。因此，改善肉雞骨骼發(fā)育狀況，提高骨骼質(zhì)量，對(duì)于肉雞的優(yōu)質(zhì)、高效生產(chǎn)具有重要意義。

當(dāng)前，畜牧業(yè)生產(chǎn)中抗生素替代已經(jīng)成為行業(yè)趨勢(shì)和研究熱點(diǎn)。飼用益生菌作為抗生素的有效替代物，受到了越來(lái)越多的關(guān)注。益生菌定義為“一類當(dāng)以足夠劑量給予宿主時(shí)，通過(guò)促進(jìn)腸道微生態(tài)平衡對(duì)宿主產(chǎn)生有利影響的活的微生物制劑”[2]。飼用益生菌主要分為三大類[3]：1)益生乳酸菌[如嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、詹氏乳桿菌、拉曼乳桿菌等]；2)益生雙歧桿菌類(如長(zhǎng)雙歧桿菌、短雙歧桿菌、卵形雙歧桿菌、嗜熱雙歧桿菌等)；3)益生芽孢桿菌類(如地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌等)。此外，還有一些酵母菌亦可歸入益生菌的范疇。近來(lái)研究表明，飼糧添加益生乳酸菌能夠改善骨骼發(fā)育，提高骨骼質(zhì)量。然而，益生乳酸菌提高骨骼質(zhì)量的機(jī)理尚不明確。因此，本文綜述了益生乳酸菌對(duì)肉雞骨骼發(fā)育的影響，并分析了益生乳酸菌影響骨骼發(fā)育的潛在作用途徑，期待為益生乳酸菌改善肉雞骨骼發(fā)育、提高骨骼質(zhì)量的機(jī)制探究提供借鑒，為其更好地應(yīng)用于肉雞生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 肉雞骨骼健康及其發(fā)育機(jī)制研究

1.1 肉雞骨骼健康的意義

當(dāng)前，肉雞骨骼質(zhì)量受到了越來(lái)越多的關(guān)注。腿骨脆弱和骨質(zhì)疏松能夠造成肉雞跛足和死亡率上升，這已經(jīng)成為動(dòng)物福利關(guān)注的主要問(wèn)題[4]。生產(chǎn)中，肉雞通常遭受跛腳、骨骼畸形、骨質(zhì)疏松等的折磨，這也會(huì)引起抓捕和運(yùn)輸過(guò)程中骨骼斷裂，后者又會(huì)在肉制品加工過(guò)程中影響肉品質(zhì)[5-6]。骨骼的易碎性和多孔性也會(huì)增加去骨肉制品加工過(guò)程中骨骼斷裂發(fā)生的概率，斷裂的骨骼會(huì)刺破肌肉和血管，造成血液浸出、肉品褪色，肉制品會(huì)因此失去對(duì)消費(fèi)者的吸引力?？傊?，肉雞生產(chǎn)中骨骼質(zhì)量非常重要，與之相關(guān)的經(jīng)濟(jì)損失每年高達(dá)數(shù)十億元[7]。

當(dāng)代肉雞經(jīng)過(guò)幾十年育種體系的不斷選擇，肌肉生長(zhǎng)速度快，骨骼發(fā)育卻相對(duì)滯后。骨骼發(fā)育不良，由此誘發(fā)的骨骼斷裂及其相關(guān)感染引起的死亡、生產(chǎn)效率低和肉制品品質(zhì)差等[8-9]是肉雞生產(chǎn)中面臨的主要難題。骨骼質(zhì)量差造成肉雞腿病的發(fā)病率越來(lái)越高，嚴(yán)重影響了肉雞正常的運(yùn)動(dòng)和采食能力，制約了肉雞的生長(zhǎng)、增重速度，降低了養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。因此，肉雞的骨骼健康狀況需要獲得更多關(guān)注。肉雞整個(gè)生產(chǎn)周期的骨骼質(zhì)量主要取決于生長(zhǎng)發(fā)育階段結(jié)構(gòu)骨的形成[10]，即骨骼的發(fā)育狀況。因此，改善骨骼發(fā)育對(duì)于維持肉雞骨骼健康和促進(jìn)肉雞的優(yōu)質(zhì)、高效生產(chǎn)具有重要意義。

1.2 肉雞骨骼的發(fā)育機(jī)制研究

骨骼相關(guān)的功能失調(diào)嚴(yán)重影響肉雞生產(chǎn)和動(dòng)物福利，這激起了人們對(duì)骨骼生物學(xué)研究的濃厚興趣。自層架式肉雞養(yǎng)殖籠具引入生產(chǎn)，籠養(yǎng)肉雞癱瘓問(wèn)題就隨之產(chǎn)生。肉雞癱瘓和骨骼質(zhì)量差密切相關(guān)，最典型的例子是肉雞骨質(zhì)疏松[11]。

肉雞骨骼發(fā)育包括2個(gè)過(guò)程：四肢長(zhǎng)骨縱向生長(zhǎng)和橫向生長(zhǎng)[10]。四肢骨骼的長(zhǎng)骨縱向生長(zhǎng)是軟骨成骨作用的結(jié)果。骨形成有2種模式：1)膜內(nèi)成骨(圖1)，即直接將間質(zhì)組織轉(zhuǎn)換成骨，該模式主要發(fā)生在顱骨；2)軟骨內(nèi)成骨(圖2)，即先是間充質(zhì)細(xì)胞分化形成軟骨組織，然后軟骨組織被骨取代[12]，該模式主要發(fā)生在骨盆、四肢及脊柱骨[13]。在四肢長(zhǎng)骨中，初級(jí)骨化中心形成后，不斷向兩端生長(zhǎng)板延伸，從而使骨骼不斷縱向加長(zhǎng)；之后，隨著次級(jí)骨化中心、骨髓腔和骨骺端的形成以及血管進(jìn)入，骨骼繼續(xù)生長(zhǎng)[14-16]。

骨骼直徑增加是骨骼以環(huán)形擴(kuò)張的方式橫向變寬的過(guò)程(在骨內(nèi)膜的表面，破骨細(xì)胞分解骨骼；在骨膜，成骨細(xì)胞不斷沉積骨質(zhì)形成結(jié)構(gòu)骨)。長(zhǎng)骨橫向變寬的過(guò)程中，涉及長(zhǎng)骨內(nèi)膜的成骨作用。成骨細(xì)胞在軟骨膜中發(fā)育，并形成骨針，骨針融合形成了包含空腔的網(wǎng)狀骨。這些空腔逐漸被成骨細(xì)胞填滿，成骨細(xì)胞在其中持續(xù)分泌同軸向的、薄片狀的皮質(zhì)骨。在骨內(nèi)膜的表面，破骨細(xì)胞分解骨骼；在外部，隨著結(jié)構(gòu)骨形成，骨骼以環(huán)形擴(kuò)張的方式橫向變寬，即內(nèi)部重吸收外部骨骼形成并向外擴(kuò)張[17]。在生長(zhǎng)的早期階段，骨骼橫向生長(zhǎng)呈環(huán)狀迅速擴(kuò)張，以至于在骨內(nèi)膜重吸收開(kāi)始之前骨骼生長(zhǎng)過(guò)程中空腔尚未被完全填滿。但隨生長(zhǎng)速度減慢，骨骼空腔的填充程度不斷增加[18-19]。

改善肉雞骨骼健康狀況，獲得更好的骨骼質(zhì)量，不僅與動(dòng)物健康狀況及動(dòng)物福利密切相關(guān)，更是關(guān)乎肉雞產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。然而，圍繞肉雞的研究絕大多數(shù)集中在生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)方面，骨骼健康尚未受到足夠的重視。因此，改善肉雞骨骼質(zhì)量的研究不僅十分重要而且非常必要。了解骨骼發(fā)育機(jī)制有助于更好地改善骨骼發(fā)育，提高骨骼質(zhì)量。

2 益生乳酸菌改善肉雞骨骼發(fā)育作用效果研究

乳酸菌屬于厚壁菌門(mén)，是一類革蘭氏陽(yáng)性菌，主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、乳明串珠菌屬(Leucocostoc)、片球菌屬(Pediococcus)、酒球菌屬(Oenococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)和鏈球菌屬(Streptococcus)等。乳酸菌是一類耐酸、桿形或球形、缺乏過(guò)氧化氫酶、微量需氧的微生物，其代謝特征是能夠發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸。此外，乳酸菌適應(yīng)性強(qiáng)，適合多種腸道微環(huán)境，能夠定植在動(dòng)物口腔、胃腸道黏膜表面。

越來(lái)越多的研究表明，益生乳酸菌能夠促進(jìn)骨骼發(fā)育、維護(hù)骨骼健康。將益生乳酸菌混合物[副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)DSM 13434、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)DSM 15312和LactobacillusplantarumDSM 15313]制成膠囊(1×1010CFU/粒)，絕經(jīng)早期女性每天服用，持續(xù)12個(gè)月，結(jié)果表明腰椎椎間盤(pán)骨骼礦物質(zhì)密度損失大幅減少，這可能是由于益生乳酸菌加速了成骨作用，促進(jìn)了骨骼的形成和礦物質(zhì)的沉積[20]。此外，以小鼠為動(dòng)物模型的研究也得到了相似的結(jié)果?；谇捌谘芯縖21]，篩選出具有抗炎癥特性的單一乳桿菌(LactobacillusparacaseiDSM13434)和混合乳桿菌(包含LactobacillusparacaseiDSM13434、LactobacillusplantarumDSM 15312和LactobacillusplantarumDSM 15313)，通過(guò)飲水的方式飼喂卵巢切除前的小鼠，持續(xù)6周，結(jié)果表明，無(wú)論是單一乳桿菌還是混合乳桿菌，均能使小鼠免于卵巢切除造成的骨質(zhì)損失和骨骼重吸收[22]。Britton等[23]研究表明，羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri，一種能夠分泌有益免疫調(diào)控因子的共生微生物)能夠改變腸道微生物的組成，并能減少因卵巢切除造成的骨質(zhì)損失和骨骼重吸收。另有研究表明，口服Lactobacillusreuteri能夠減少腸道炎癥，并能夠增加性腺完整的雄性小鼠的小梁骨骨量，這可能是由于Lactobacillusreuteri在小鼠生長(zhǎng)發(fā)育階段促進(jìn)了軟骨內(nèi)的成骨作用，使其體內(nèi)的骨量積累增多。Lactobacillusreuteri飼喂小鼠，4周后股骨小梁骨礦物質(zhì)密度及其含量顯著提高[24]；飼喂Lactobacillusreuteri、Lactobacillusparacasei或Lactobacillusparacasei與Lactobacillusplantarum的混合物均能顯著改善由于卵巢切除造成的小鼠皮質(zhì)骨含量及皮質(zhì)骨礦物質(zhì)含量降低[25]。Amdekar等[26]研究表明，8周齡威斯塔鼠口服Lactobacilluscasei、Lactobacillusacidophilus以及兩者的混合物，能夠改善弗氏佐劑造成的骨骼損傷，這可能是由于這些益生乳酸菌加速了骨骼形成，從而促進(jìn)了骨骼損傷的修復(fù)。斑馬魚(yú)幼魚(yú)飼喂鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)10周后，脊柱骨鈣化顯著提前[27]，這表明Lactobacillusrhamnosus能夠促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育階段斑馬魚(yú)鈣沉積和骨骼形成。通過(guò)以上分析可以得出，益生乳酸菌能夠調(diào)控骨骼代謝，從而改善骨骼質(zhì)量。

a：骨先質(zhì)細(xì)胞聚集 aggregates of osteoprogenotor cells；b：在聚集的中心及細(xì)胞間形成無(wú)定型基質(zhì)和膠原蛋白網(wǎng)狀組織 amorphous ground substance and collagen meshwork formed in the center and in between the cells；c：間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞，繼而在聚集的中心合成類骨質(zhì) the mesenchymal stem cell transform to osteoblasts which synthesize osteoid in the center of the aggregate；d：成骨細(xì)胞形成初步的骨組織，部分成骨細(xì)胞進(jìn)入類骨質(zhì)成為骨細(xì)胞 a rudimentary bone tissue formed by the osteoblasts and some of these get incorporated within the osteoid to become osteocytes。

a：骨先質(zhì)細(xì)胞聚集 aggregates of osteoprogenitor cells；b：透明軟骨形成 model of hyaline cartilage；c：初級(jí)骨化中心形成 primary center of ossification；d：次級(jí)骨化中心形成 secondary center of ossification；e：骨髓腔和骨骺端形成 bone with medullary cavity and epiphyseal ends；f：血管輸送增加 highlighting feeding blood vessels。

益生乳酸菌作為飼料添加劑，已經(jīng)在禽類生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，之前的研究絕大部分集中在益生乳酸菌對(duì)禽類生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、肉品質(zhì)、腸道健康、抗應(yīng)激、免疫等方面，很少關(guān)注到其對(duì)禽類骨骼質(zhì)量的影響。

肉雞生長(zhǎng)過(guò)程中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如鈣、磷)和能量供應(yīng)充足能夠促進(jìn)骨骼發(fā)育。并且，大量研究表明肉雞飼糧添加益生乳酸菌能夠改善腸道形態(tài)、微生物菌群，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收效率[3]。據(jù)此可推測(cè)飼糧添加益生乳酸菌能夠促進(jìn)肉雞骨骼發(fā)育、提高骨骼質(zhì)量。并且已經(jīng)有大量的研究以多種動(dòng)物為模型驗(yàn)證了該推測(cè)。事實(shí)上，肉雞飼糧添加益生乳酸菌取得了很好的改善骨骼質(zhì)量的效果：飼糧添加6×107CFU/kg芽胞乳酸菌(Lactobacillussporogenes)顯著提高43日齡肉雞脛骨強(qiáng)度和灰分含量[28]；飲水添加乳酸菌(106CFU/只)顯著提高了30日齡肉雞脛骨指數(shù)、強(qiáng)度、直徑以及總灰分、鈣、磷含量[29]。飼糧添加Lactobacillusplantarum和Lactobacillusacidophilus顯著增加了肉雞脛骨磷(21日齡)和鈣(40日齡)的含量[30]?？梢?jiàn)，飼糧添加益生乳酸菌能夠促進(jìn)肉雞軟骨內(nèi)的成骨作用、脛骨橫向生長(zhǎng)、骨量增加以及礦物質(zhì)在骨骼中沉積，進(jìn)而改善骨骼發(fā)育，提高骨骼質(zhì)量。

3 益生乳酸菌調(diào)控肉雞骨骼發(fā)育的潛在機(jī)理研究

探究益生乳酸菌調(diào)控肉雞骨骼發(fā)育的機(jī)制有助于更好地利用益生乳酸菌改善肉雞骨骼質(zhì)量，進(jìn)而提高肉雞生產(chǎn)效率。大量研究表明，益生乳酸菌改善骨骼健康狀況很可能是通過(guò)改變腸道微生物實(shí)現(xiàn)的[31-32]。腸道微生物影響骨骼組織潛在的途徑主要有3條：1)調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)素吸收；2)調(diào)節(jié)黏膜和全身的免疫反應(yīng)；3)微生物及其小分子代謝產(chǎn)物穿過(guò)腸道內(nèi)皮屏障，通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)遷移至骨骼組織[33-34](圖3)。

3.1 益生乳酸菌通過(guò)調(diào)控營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收影響肉雞骨骼發(fā)育

目前為止，已有大量研究表明，益生乳桿菌能夠改變腸道微生物菌群，降低腸道pH，抑制有害菌群生長(zhǎng)，改善腸道形態(tài)，維持腸道黏膜的完整性，促進(jìn)鈣、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量的吸收[35]。

據(jù)此推測(cè)益生乳酸菌很可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物改善營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(包括能量)的吸收，繼而調(diào)控肉雞骨骼發(fā)育。例如，改善鈣吸收能夠促進(jìn)骨骼發(fā)育，其主要途徑為以下2條：1)鈣離子通過(guò)誘導(dǎo)runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)和骨鈣素基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，從而促進(jìn)骨骼形成；2)鈣增加能夠減少破骨細(xì)胞的活性，進(jìn)而減少骨骼重吸收[34]。研究表明，改變腸道微生物能夠促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量吸收，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和骨骼發(fā)育[36]。

3.2 益生乳酸菌通過(guò)調(diào)控免疫反應(yīng)影響肉雞骨骼發(fā)育

腸道是動(dòng)物體最大的免疫器官，集中了約80%的免疫細(xì)胞，產(chǎn)生全身將近80%的抗體。益生乳酸菌進(jìn)入消化道后，能夠通過(guò)調(diào)控腸道免疫反應(yīng)，最終影響骨骼代謝活動(dòng)。許多免疫因子參與調(diào)控成骨和破骨作用。

腸道微生物及其代謝產(chǎn)物刺激腸道內(nèi)皮免疫細(xì)胞，被激活的免疫細(xì)胞釋放抗炎或促炎介導(dǎo)因子(或細(xì)胞因子)，這些因子能夠通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)作用于骨組織，通過(guò)成骨或破骨作用調(diào)節(jié)骨骼的形成和分解[35]；激活的免疫細(xì)胞還能夠遷移至骨髓組織，釋放免疫反應(yīng)產(chǎn)物，如核因子-κB(NF-κB)配體激活受體(RANKL)，直接作用于骨組織，調(diào)節(jié)骨骼代謝[37]。

3.3 益生乳酸菌通過(guò)調(diào)控微生物相關(guān)模式分子(MAMPs)遷移影響肉雞骨骼發(fā)育

飼喂益生乳酸菌能夠改變腸道微生物，繼而引起腸道內(nèi)MAMPs的種類和數(shù)量發(fā)生改變。MAMPs包括脂多糖、肽聚糖、鞭毛蛋白和游離DNA，它們是細(xì)菌分泌或者細(xì)胞死亡后保留下來(lái)的，體積足夠小能夠穿過(guò)腸道內(nèi)皮屏障，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，到達(dá)遠(yuǎn)離腸道的器官(如骨骼)。因此，益生乳酸菌很可能通過(guò)MAMPs進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)對(duì)骨骼組織發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。MAMPs可以直接刺激骨細(xì)胞的免疫受體，包括Toll樣受體2(TLR2，與肽聚糖反應(yīng))[38]、Toll樣受體4(TLR4，與脂多糖反應(yīng))[39]和Toll樣受體5(TLR5，與肽鞭毛蛋白反應(yīng))[40]，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨骼代謝。

然而，目前為止，關(guān)于益生乳酸菌影響骨骼發(fā)育機(jī)理的研究非常有限，僅有的報(bào)道又不夠系統(tǒng)。因此，需要做更多工作來(lái)探究益生乳酸菌改善骨骼發(fā)育的機(jī)理，為更好地將益生乳酸菌應(yīng)用于改善肉雞骨骼質(zhì)量的生產(chǎn)實(shí)踐提供理論指導(dǎo)。

4 小 結(jié)

綜上可知，骨骼健康對(duì)肉雞生產(chǎn)意義重大，深入了解骨骼發(fā)育機(jī)制有助于采用適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)策略調(diào)控骨骼代謝，維持骨骼健康。益生乳酸菌作為抗生素的有效替代物，能夠促進(jìn)骨骼發(fā)育，提高骨骼質(zhì)量，然而，其對(duì)骨骼質(zhì)量的有益影響尚未受到足夠的重視。本文詳述了益生乳酸菌對(duì)肉雞骨骼質(zhì)量的影響，并在此基礎(chǔ)上分析了益生乳酸菌影響骨骼代謝的潛在途徑。在這方面仍需要進(jìn)行大

量的研究工作去探究和深化益生乳酸菌影響骨骼代謝的機(jī)制。本文將為益生乳酸菌改善肉雞骨骼質(zhì)量的生產(chǎn)實(shí)踐提供理論指導(dǎo)。

DC：樹(shù)狀細(xì)胞 dendritic cell；EC：腸道內(nèi)皮細(xì)胞 endothelial cell；MAMPs：微生物相關(guān)模式分子microbial-associated molecular patterns；Nutrients：營(yíng)養(yǎng)素；Vitamins：維生素；Metabolites：代謝物；Cytokines：細(xì)胞因子；Systemic circulation：體循環(huán)。