周 奇 楊芳炬 郝 莉

［1.華潤(rùn)三九（雅安）藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610000］

金關(guān)片為臨床中常用的中成藥，具有補(bǔ)益肝腎，祛寒止痛，活血通絡(luò)的功效，臨床用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等［1-3］。金關(guān)片作為一個(gè)上市多年的藥物，臨床療效明確［4-7］，但缺乏系統(tǒng)的研究及評(píng)價(jià)資料報(bào)道。為擴(kuò)大產(chǎn)品的影響力，有效地指導(dǎo)臨床安全用藥，根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的《中藥、天然藥物長(zhǎng)期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中“慢性毒性試驗(yàn)”要求，本研究進(jìn)行了金關(guān)片對(duì)大鼠口服灌胃的長(zhǎng)期毒性（180 d）試驗(yàn)，以期為臨床安全用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥物 金關(guān)片由雷公藤、續(xù)斷、山藥、細(xì)辛、附子（制）、茯苓、桑枝、桂枝、鹿角霜、秦艽、丹參、枸杞子、牛膝、雞血藤、黃精、淫羊藿、薏苡仁、黃芪等組成，每克藥粉相當(dāng)于生藥3.112 g，由雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)并提供，批號(hào)K-060301，長(zhǎng)期毒性研究用時(shí)稱取藥粉以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成8%、4%、2%濃度藥液備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，雌雄各半，健康一級(jí)，體質(zhì)量90～120 g。由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第10號(hào)。動(dòng)物分籠飼養(yǎng)觀察1周。室溫18～25℃，條狀基礎(chǔ)飼料。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)分別計(jì)算均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，以t檢驗(yàn)或t′檢驗(yàn)進(jìn)行各劑量組與對(duì)照組比較。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組和給藥 大鼠按體質(zhì)量分為4組，即高劑量組（0.8 g/kg體質(zhì)量，相當(dāng)于生藥2.49 g/kg，約為臨床用量的16倍）、中劑量組（0.4 g/kg質(zhì)量，相當(dāng)于生藥1.25 g/kg，約為臨床用量的8倍）、低劑量組（0.2 g/kg體質(zhì)量，相當(dāng)于生藥0.62 g/kg，約為臨床用量的4倍）、生理鹽水對(duì)照組（給予相同體積生理鹽水），每組30只大鼠，雌雄各半?？诜辔附o藥，每只大鼠給藥容量為1 mL/100 g，根據(jù)體質(zhì)量增長(zhǎng)調(diào)整給藥量，每周給藥6 d，每天給藥時(shí)間相同。共給藥180d，每組于給藥第90天處死6只大鼠，進(jìn)行指標(biāo)監(jiān)測(cè)。6只停藥觀察2周（試驗(yàn)時(shí)間為104 d），然后處死作同樣檢測(cè)。余下18只繼續(xù)給藥，待180d時(shí)處死余下12只進(jìn)行檢測(cè)，余下6只停藥觀察2周（試驗(yàn)時(shí)間為194 d），然后處死檢測(cè)。

2.2 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）一般觀察：每日觀察體征和行為活動(dòng)、糞便性狀及食量。每周稱體質(zhì)量1次。2）實(shí)驗(yàn)室檢查：于給藥90、104、180、194 d經(jīng)股動(dòng)脈采血，進(jìn)行血液學(xué)（紅細(xì)胞計(jì)數(shù)及血紅蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間、血小板計(jì)數(shù)）和血液生化指標(biāo)［谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸梅（ALP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TAG）、血糖（GLU）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（Tbil）、尿素氮（BUN）、肌酐（Crea）、鈉離子濃度、鉀離子濃度、氯離子濃度、肌酸磷酸激酶］。3）病理組織學(xué)檢查：于給藥90、104、180、194 d處死動(dòng)物進(jìn)行系統(tǒng)解剖。取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、子宮、腦、胸腺、卵巢、附睪、睪丸測(cè)定濕重并計(jì)算臟器系數(shù)。取腦、垂體、胸腺、甲狀腺、甲狀旁腺、食管、唾液腺、小腸、大腸、腎上腺、心、肝、脾、肺、腎、胰、胃、卵巢、氣管、主動(dòng)脈、前列腺、乳腺、膀胱、坐骨神經(jīng)、骨髓等組織常規(guī)固定、包埋、切片、HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

2.3 各組常規(guī)觀察和體質(zhì)量增長(zhǎng) 給藥期間，與生理鹽水對(duì)照組比，試藥組未出現(xiàn)體征及行為活動(dòng)異常，體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各組食量亦無(wú)明顯差異。各劑量組與對(duì)照組體質(zhì)量增長(zhǎng)差別見圖1。

圖1 金關(guān)片對(duì)雄性大鼠體質(zhì)量的影響

2.4 各組血液學(xué)及生化指標(biāo)測(cè)定 試驗(yàn)90 d時(shí)處死各組大鼠各6只（每組雌雄各3只）進(jìn)行血液學(xué)、生化結(jié)果顯示，血液學(xué)與生化檢查見0.8、0.4 g/kg用藥組尿素氮、肌酐明顯升高（P＜0.05～0.01），其余各項(xiàng)指標(biāo)未見異常，停藥2周動(dòng)物上述血液學(xué)、生化指標(biāo)檢查未見異常，中結(jié)果見圖2～圖6。

圖2 金關(guān)片給藥180 d、停藥14 d對(duì)大鼠血常規(guī)及免疫細(xì)胞的影響

圖3 金關(guān)片給藥180 d、停藥14 d對(duì)大鼠血清酶的影響

圖4 金關(guān)片給藥180 d、停藥14 d對(duì)大鼠血清TC、TAG、GLU、Tbil的影響

圖5 金關(guān)片給藥180 d、停藥14 d對(duì)大鼠血清尿素氮、肌酐和電解質(zhì)的影響

圖6 金關(guān)片給藥180 d、停藥14 d對(duì)血漿蛋白的影響

實(shí)驗(yàn)180 d時(shí)處死剩余動(dòng)物12只同樣進(jìn)行血液與生化檢查結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，0.8 g/kg用藥組尿素氮均明顯升高（P＜0.05），其余各組各項(xiàng)指標(biāo)未見異常；給藥180 d后停藥2周動(dòng)物（各組大鼠雌雄各3只）同上法處理和檢測(cè)結(jié)果顯示，血液學(xué)、生化指標(biāo)未見異常。結(jié)果詳見圖7～圖11。

圖7 金關(guān)片給藥180 d、停藥14 d對(duì)大鼠血常規(guī)及免疫細(xì)胞的影響

圖8 金關(guān)片給藥180 d、停藥14 d對(duì)大鼠血清酶的影響

圖9 金關(guān)片給藥180 d、停藥14 d對(duì)大鼠血清TC、TAG、GLU、Tbil的影響

圖10 金關(guān)片給藥180 d、停藥14 d對(duì)大鼠血清BUN、Crea和電解質(zhì)的影響

圖11 金關(guān)片給藥180 d、停藥14 d對(duì)血漿蛋白的影響

2.5 各組系統(tǒng)解剖及病理組織學(xué)檢查 給藥90 d、停藥14 d各用藥組進(jìn)行系統(tǒng)解剖觀察結(jié)果顯示，肉眼未見臟器明顯異常；腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、甲狀腺、胰、胃臟器濕重和臟器系數(shù)與對(duì)照組比，無(wú)顯著差異；臟器稱重結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，0.8、0.4 g/kg用藥組雄鼠睪丸質(zhì)量均出現(xiàn)明顯減輕（P＜0.05），0.8 g/kg用藥組雌鼠子宮質(zhì)量亦出現(xiàn)明顯減輕（P＜0.05）；病理切片檢查見0.8 g/kg用藥組雄鼠睪丸出現(xiàn)病理改變，表現(xiàn)為生精細(xì)胞減少，精管細(xì)胞減少甚至消失，停藥14 d亦無(wú)明顯改善，見圖12。其他各組各臟器未見明顯病理改變。

給藥180 d、停藥14 d各用藥組進(jìn)行的系統(tǒng)解剖觀察結(jié)果顯示，180 d用藥（0.8 g/kg）組肉眼見大鼠脾臟淤血，但其質(zhì)量無(wú)增加或減輕；0.8、0.4、0.2 g/kg用藥組雄鼠睪丸質(zhì)量明顯減輕（P＜0.01）；同時(shí)，0.8 g/kg用藥組雌鼠子宮質(zhì)量明顯減輕（P＜0.01）；各給藥動(dòng)物經(jīng)病理切片觀察仍見0.8 g/kg組雄鼠睪丸出現(xiàn)類似90 d用藥組改變；子宮雖見質(zhì)量減輕，但未見結(jié)構(gòu)異常改變，脾臟亦未見結(jié)構(gòu)異常；其余各臟器或組織亦無(wú)異常病理改變。各試藥組子宮、睪丸、附睪質(zhì)量結(jié)果詳見圖13、圖14。

圖13 金關(guān)片給藥90 d后對(duì)生殖系統(tǒng)臟器質(zhì)量的影響

圖14 金關(guān)片給藥180 d后對(duì)生殖系統(tǒng)臟器質(zhì)量的影響

給藥90、104、180、194 d分別取部分大鼠骨髓涂片檢查，結(jié)果顯示：骨髓有核細(xì)胞增生活躍，粒細(xì)胞、紅細(xì)胞各系各階段比例基本正常，形態(tài)無(wú)異常改變。表明該藥物對(duì)骨髓無(wú)不良影響。

3 討 論

金關(guān)片每日0.2 g/kg（相當(dāng)于0.62 g生藥/kg，約為臨床用藥量的4倍）連續(xù)給藥180 d，各項(xiàng)指標(biāo)及病理學(xué)觀察，均未見毒性反應(yīng)和對(duì)臟器器官的損害。故認(rèn)為金關(guān)片臨床治療量（0.06 g/kg，相當(dāng)于0.1556 g生藥/kg）是安全的。綜上可以看出，金關(guān)片對(duì)大鼠未見明顯的長(zhǎng)期毒性，提示金關(guān)片在臨床推薦劑量下服用是安全的。

結(jié)合金關(guān)片的藥效研究報(bào)道［1，3，8］，該藥能治療寒濕阻絡(luò)證、瘀血阻絡(luò)證、肝腎兩虛證之類風(fēng)濕頑痹。由于雷公藤是金關(guān)片中的君藥，是治療關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕病的特效藥材，大量文獻(xiàn)報(bào)道其對(duì)精子有殺傷力［9-11］。從長(zhǎng)期毒性研究中可以看出金關(guān)片對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)作用存在一定的影響，但關(guān)金片中雷公藤的含量低，且發(fā)現(xiàn)停藥90 d后，精子數(shù)量和功能完全恢復(fù)，不影響生育［12］。金關(guān)片與同類產(chǎn)品雷公藤片臨床療效比較［3］，療效無(wú)明顯差異，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎均有較好療效（總有效率分別為97.2%、96.4%），但雷公藤片不良反應(yīng)高、復(fù)發(fā)率高，因而金關(guān)片是值得推廣應(yīng)用的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病的較好藥物。

近期研究發(fā)現(xiàn)，金關(guān)片能顯著降低高尿酸血癥小鼠尿酸水平；并顯著降低高尿酸血癥所致的高BUN、高Crea水平；對(duì)模型形成過(guò)程小鼠血清中尿酸水平有良好抑制效果［9］。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎［13］以及高尿酸血癥［14-15］均是臨床中常見的疾病，其癥狀和并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。隨著金關(guān)片新功效的不斷發(fā)現(xiàn)以及臨床應(yīng)用的推廣，金關(guān)片主要用于慢性疾病的治療，需要較長(zhǎng)時(shí)間服用藥物，因此系統(tǒng)的評(píng)價(jià)和報(bào)道金關(guān)片的長(zhǎng)期毒性具有重要的臨床指導(dǎo)意義。通過(guò)本研究表明金關(guān)片屬于副作用較小，毒性不明顯的中成藥，為藥物綜合評(píng)價(jià)提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。