陳其桂，李大文，成俊萍，薛林濤，譚衛(wèi)紅，李金燕，何泳志，黃泰帥

不孕不育癥是全球性難題，據(jù)估計，全球有多達(dá)1.86億人受其影響，雖可通過不同的助孕技術(shù)使不孕不育夫婦獲得生殖機(jī)會，但助孕結(jié)局不理想等問題依然存在[1]。在體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)助孕中，不可避免地會遇到受精失敗的發(fā)生。據(jù)研究報道，IVF的平均受精率為70%～80%[2]，受精失敗發(fā)生率約為10%[3]，導(dǎo)致可移植胚胎減少，甚至周期取消。受精失敗的原因可能與精卵質(zhì)量、精卵識別、結(jié)合異常及體外環(huán)境因素影響等有關(guān)。補(bǔ)救卵胞漿內(nèi)單精子注射術(shù)(rescue intracytoplasmic sperm injection，R-ICSI)是IVF-ET失敗后的挽救方案，目前已廣泛應(yīng)用于IVF完全受精失敗或低受精的不孕不育患者[4]。但是，R-ICSI也存在受精率、臨床妊娠率不高等問題[5]。目前，有部分學(xué)者對精子正常形態(tài)率、精子頂體完整率、頂體反應(yīng)率、精子DNA斷裂指數(shù)(DNA fragmentation index,DFI)與R-ICSI結(jié)局相關(guān)性進(jìn)行了報道[6，7]，但關(guān)于不同不育類型對R-ICSI結(jié)局影響的研究仍鮮見報道。不育類型可根據(jù)既往妊娠情況分為原發(fā)性不育和繼發(fā)性不育，然而輔助生殖技術(shù)治療往往只是依據(jù)男性精液質(zhì)量或女性卵巢、輸卵管功能及性激素水平進(jìn)行，對患者的臨床診斷關(guān)注較少。鑒此，本文通過回顧性研究探討不同不育類型患者精液質(zhì)量情況及其對R-ICSI結(jié)局的影響，旨在為臨床生殖醫(yī)師的診療工作提供理論依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性研究2014-01～2018-12于廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心行常規(guī)IVF-ET失敗而進(jìn)行R-ICSI治療的98對不孕不育夫婦的臨床資料。根據(jù)不育類型將98對夫婦分為原發(fā)性不育組(n=56)和繼發(fā)性不育組(n=42)。原發(fā)性不育指男子從未使女性受孕；繼發(fā)性不育指男子有使女性受孕史[8]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女性年齡<38歲；(2)夫婦雙方染色體檢查正常；(3)精子來源均為丈夫，手淫法獲得；(4)女方體質(zhì)量指數(shù)(Body Mass Index,BMI)在正常范圍(18.5～23.9 kg/m2)；(5)超促排卵用藥方案為長方案；(6)女方均為單純輸卵管因素導(dǎo)致不孕。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫婦雙方生殖器發(fā)育異常、生殖系統(tǒng)感染及男性性功能障礙等；(2)男方吸煙、酗酒及服用影響精子活力的藥物；(3)女方有子宮腺肌癥、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征等疾病。

1.2治療方法

1.2.1 促排卵及采卵 采用促性腺激素激動劑(達(dá)菲林，益普生公司)、促卵泡生成素(果納芬，瑞士雪蘭諾)，和(或)人絕經(jīng)期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，HMG，麗珠制藥)、人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG，瑞士雪蘭諾)長方案超促排卵。自用促性腺激素4 d后開始B超監(jiān)測卵泡發(fā)育，當(dāng)有2個卵泡直徑>18 mm時，于當(dāng)晚21:00左右予HCG 10 000 IU肌肉注射，給藥36 h于手術(shù)室在陰道B超引導(dǎo)下行經(jīng)陰道超聲穿刺取卵。

1.2.2 精液采集 男性患者禁欲2～7 d，采用手淫法取精液置于干燥消毒量杯內(nèi)，標(biāo)本被轉(zhuǎn)送到實驗室過程中，應(yīng)保持在20～37 ℃，置于37 ℃恒溫箱內(nèi)液化。

1.2.3 R-ICSI適應(yīng)證及治療 以第二極體作為早期受精的判斷標(biāo)準(zhǔn)，受精6 h觀察，若患者所有成熟卵母細(xì)胞中出現(xiàn)明確第二極體的比例<30%，建議行R-ICSI，并與患者簽署R-ICSI知情同意書。對IVF周期中未排出第二極體的卵母細(xì)胞于受精6～8 h后再次觀察，如仍未排出第二極體，于當(dāng)晚行R-ICSI，即使用顯微操作設(shè)備挑選單個精子注入未排出第二極體的成熟卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。注射后16～18 h觀察受精情況，48 h觀察卵裂情況，48～72 h選取優(yōu)質(zhì)胚胎由生殖醫(yī)師進(jìn)行移植。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1 一般臨床情況 包括年齡、BMI、不育年限等。

1.3.2 基礎(chǔ)促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)水平檢測 于月經(jīng)周期第3～5天抽靜脈血(患者空腹),采用ADVIA Centaur XP全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑(美國)對基礎(chǔ)FSH、LH進(jìn)行檢測，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.3 HCG日子宮內(nèi)膜厚度檢測 患者取仰臥位,采用邁瑞DC-6、西門子ACUSON Antares彩色超聲診斷儀(陰道超聲探頭頻率5.0～9.0 MHz)對子宮進(jìn)行多切面掃查，取子宮正中矢狀縱切面，在垂直于宮腔線的方向測量子宮中央兩條外側(cè)腔回聲線之間的厚度，即子宮內(nèi)膜厚度。

1.3.4 精液常規(guī)檢測 通過稱重收集量器中的精液來測量精液體積；使用計算機(jī)精子輔助分析(CASA)系統(tǒng)測定精子濃度、精子總數(shù)及前向運(yùn)動精子百分率。檢測方法:全份精液標(biāo)本液化后取20 μl樣品于一次性精液常規(guī)分析玻片上，精液常規(guī)分析嚴(yán)格按照世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行操作，采用精子動態(tài)圖像自動檢測系統(tǒng)檢測標(biāo)本，每份標(biāo)本隨機(jī)采樣>200個精子，獲得精子濃度、精子總數(shù)及前向運(yùn)動精子百分率等參數(shù)，每份標(biāo)本均在3～5 min內(nèi)完成檢測。前向運(yùn)動評估：精子主動地呈直線或沿一大圓周運(yùn)動，不管其速度如何。參考值：精液體積≥1.5 ml；精子濃度≥15×106/ml；一次射精精子總數(shù)≥39×106/ml；前向運(yùn)動精子≥32%[9]。

1.3.5 精子正常形態(tài)率檢測 采用WHO推薦的Diff-Quik快速染色方法進(jìn)行精液涂片染色[9]。評估精子形態(tài)時采用嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)：精子頭外形上應(yīng)是光滑、輪廓規(guī)則，大體上呈橢圓形，頂體區(qū)可清晰分辨，占頭部40%～70%，頂體區(qū)無大空泡，且不超過2個小空泡，空泡大小不超過頭部20%，頂體后區(qū)不含任何空泡；中段應(yīng)細(xì)長、規(guī)則，大約與頭部長度相等，中段主軸應(yīng)與頭部長軸成一條直線；主段應(yīng)比中段細(xì)，均一，其長約45 μm(約為頭部長度的10倍)，尾部應(yīng)沒有顯示鞭毛折斷的銳利折角。只有精子頭、頸、中段和尾部均正常的精子才認(rèn)為是正常精子。至少計數(shù)200個精子，確定正常精子形態(tài)率。

1.3.6 精子頂體完整率及自發(fā)頂體反應(yīng)率檢測 采用豌豆凝集素(pisum sativum agglutinin,PSA)熒光染色法進(jìn)行檢測(試劑盒購自Sigma Chem Co公司),并以異硫氰酸熒光素標(biāo)記。操作方法：使用密度梯度離心法+上游法處理液化好的精液，取10 μl精子懸液均勻涂抹在干凈的載玻片上，自然干燥后置于95%乙醇中固定30 min，再次干燥完畢后置于PSA工作液中，4 ℃避光反應(yīng)8～12 h，反應(yīng)結(jié)束后取出玻片，用去離子水輕微沖洗、干燥并避光保存，熒光顯微鏡450～490 nm激發(fā)光下油鏡觀察涂片。判讀標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格參考試劑盒說明書進(jìn)行，判定方法：正常精子頂體在熒光顯微鏡下有一致且明亮的熒光，頂體區(qū)域占精子頭部40%～70%；異常精子頂體無完整的帽狀半球型熒光，或著色不均勻呈大頭、尖頭樣，或頂體中有空泡，以上皆可認(rèn)為屬于頂體不完整。其中僅精子頭部赤道板附近有明亮帶狀熒光者屬于發(fā)生自發(fā)反應(yīng)后的頂體。見圖1。計算方法：利用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)400條以上精子，統(tǒng)計頂體完整精子數(shù)、頂體不完整精子數(shù)以及自發(fā)頂體發(fā)生數(shù)。頂體完整率=頂體完整精子總數(shù)/檢測精子總數(shù)×100%，自發(fā)頂體反應(yīng)率=自發(fā)頂體發(fā)生數(shù)/檢測精子總數(shù)×100%。

圖1 精子頂體圖(×400，油鏡)

1.3.7 精子DFI檢測 采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗進(jìn)行檢測，染色試劑為瑞氏-姬姆薩(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。精子DNA完整性檢測試劑盒購自西班牙halotech Dna sl公司。計算方法：使用400倍顯微鏡，配合血細(xì)胞計數(shù)器進(jìn)行人工判別，計數(shù)200條以上精子。判讀標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格參考試劑盒說明書進(jìn)行，按照染色暈圈直徑與精子核直徑的比值大小將精子暈圈分為5個等級：1級，大暈圈(>1)；2級，中等暈圈(1/3～1)；3級，小暈圈(<1/3)；4級，無暈圈；5級，精子頭部不著色。200條以上精子計數(shù)完畢后計算出每個等級的百分比，其中DFI為3、4、5等級百分比之和。

1.3.8 受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及臨床結(jié)局觀察 R-ICSI治療后第1天觀察卵母細(xì)胞受精情況，以雙原核(2PN)卵子作為正常受精卵。受精后培養(yǎng)3 d后觀察胚胎狀況，主要從胚胎的卵裂球數(shù)目、卵裂球的均一性及胚胎碎片這三個方面進(jìn)行評估。一般情況下，受精后第3天卵裂球數(shù)目應(yīng)達(dá)到7～9個細(xì)胞，對于第3天時卵裂球數(shù)目達(dá)到7～9個的胚胎，評為優(yōu)質(zhì)胚胎。卵裂球均一性及胚胎碎片分為4個等級:Ⅰ級：卵裂球大小均勻，胞質(zhì)均勻清晰，碎片少(≤5%)；Ⅱ級：卵裂球大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則，有少量碎片(6%～20%)；Ⅲ級：卵裂球大小不均勻，有明顯的形態(tài)不規(guī)則，較多碎片(21%～50%)；Ⅳ級：卵裂球大小嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆粒現(xiàn)象，大量碎片(>50%)。其中Ⅰ、Ⅱ級胚胎評為優(yōu)質(zhì)胚胎。本研究優(yōu)質(zhì)胚胎評估標(biāo)準(zhǔn)為卵裂球數(shù)目達(dá)到7～9個的胚胎以及Ⅰ、Ⅱ級胚胎。生殖醫(yī)師選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，移植胚胎數(shù)≤3個，剩余Ⅲ級以上胚胎予冷凍保存，并給予黃體支持。移植術(shù)后第14天測血β-HCG水平，若陽性則確定妊娠。若妊娠，則分別于第28天、第42天行B超檢查了解胚胎發(fā)育情況，若B超見宮腔內(nèi)孕囊及心管搏動則確立臨床妊娠。黃體支持自妊娠8周起逐漸減量至妊娠10周停用,隨訪至妊娠12周轉(zhuǎn)入產(chǎn)科門診建檔立卡及定期產(chǎn)檢。我科進(jìn)行電話隨訪記錄最終結(jié)局。指標(biāo)計算方法：受精率=受精卵母細(xì)胞數(shù)/卵母細(xì)胞數(shù)×100%；卵裂率=卵裂數(shù)/受精卵母細(xì)胞數(shù)×100%；優(yōu)胚率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠例數(shù)/移植周期例數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活嬰分娩數(shù)/移植周期例數(shù)×100%；早產(chǎn)率=早產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%；單胎率=單胎例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%；雙胎率=雙胎例數(shù)/臨床妊娠例數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1兩組一般情況比較 兩組患者女方年齡及獲卵數(shù)的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩組患者不育年限、男方年齡、女方BMI、基礎(chǔ)FSH值、基礎(chǔ)LH值、竇卵泡數(shù)、HCG日子宮內(nèi)膜厚度方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2兩組精液質(zhì)量比較 繼發(fā)性不育組前向運(yùn)動精子百分率大于原發(fā)性不育組，精子DFI小于原發(fā)性不育組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但兩組患者在精液體積、精子濃度、精子總數(shù)、精子正常形態(tài)率、精子頂體完整率及精子自發(fā)頂體反應(yīng)率方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組精液質(zhì)量比較

2.3兩組胚胎發(fā)育情況及臨床結(jié)局比較 兩組患者臨床妊娠率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。另外，兩組患者受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、活產(chǎn)率、早產(chǎn)率、流產(chǎn)率、單胎率及雙胎率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組胚胎發(fā)育情況及臨床結(jié)局比較[n(%)]

3 討論

3.1不育癥可對男性生殖健康造成重大影響，近年來，不育癥發(fā)病率逐年增加，原發(fā)性不育的發(fā)生率大于繼發(fā)性不育[10]，這除了男性自身機(jī)體內(nèi)分泌紊亂外，體外環(huán)境也占據(jù)了一大部分原因。近十幾年來，男性精液質(zhì)量呈現(xiàn)明顯下降情況，這與男性不育關(guān)系密切。男性精子受精能力可通過精液參數(shù)表現(xiàn)，精液分析是評估不育癥的重要方法。另外，男科醫(yī)師可結(jié)合精液質(zhì)量檢測結(jié)果與患者的不同不育類型而合理地選擇治療方案。目前，關(guān)于不育類型與精液質(zhì)量的研究結(jié)論不一。成潔和趙君利[11]的研究結(jié)果顯示，繼發(fā)性不育者的精子活力顯著優(yōu)于原發(fā)性不育者。楊東等[12]的研究顯示，原發(fā)性不育患者的精子活力異常情況更為常見。王軍和呂紅蕾[13]認(rèn)為精子質(zhì)量欠佳是導(dǎo)致原發(fā)性不育的主要原因。但是，Gowri等[14]的研究結(jié)果顯示，原發(fā)性不育與繼發(fā)性不育癥患者精液參數(shù)評價差異無顯著性。本研究通過比較原發(fā)性不育與繼發(fā)性不育的精液質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)繼發(fā)性不育組前向運(yùn)動精子百分率大于原發(fā)性不育組，精子DFI小于原發(fā)性不育組，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但兩組患者在精液體積、精子濃度、精子總數(shù)、精子正常形態(tài)率、精子頂體完整率及精子自發(fā)頂體反應(yīng)率方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示原發(fā)性不育男性的精液質(zhì)量劣于繼發(fā)性不育患者。而這可能與原發(fā)性不育患者承受更大的心理、精神及社會壓力有關(guān)[15]。生育力是男性雄性魅力的體現(xiàn)，原發(fā)性不育患者對此則更為敏感，自我價值評價下降，這種慢性的不良應(yīng)激會影響精子發(fā)育、成熟，導(dǎo)致精液質(zhì)量的下降。上述結(jié)果提示臨床醫(yī)師在行R-ICSI治療前，應(yīng)注重原發(fā)性不育者精液質(zhì)量檢測及診療，適當(dāng)予以心理疏導(dǎo)，緩解患者焦慮情緒。

3.2雖然目前IVF技術(shù)逐漸成熟，但仍不能達(dá)到100%的受精成功率。胚胎室技術(shù)人員可采用對IVF授精后6 h去除卵丘細(xì)胞方法初步觀察卵子受精情況，從而決定是否進(jìn)行R-ICSI治療。Xiong等[16]研究指出該方案是安全有效的，有利于早期觀察受精情況。王雪瑩等[17]認(rèn)為IVF受精失敗及受精率低下的患者可通過早期行R-ICSI治療，從而優(yōu)化妊娠結(jié)局。關(guān)于不孕不育類型對輔助生殖助孕結(jié)局的影響，有研究[18，19]指出，原發(fā)不孕不育者常規(guī)IVF受精失敗率較高，建議采用短時受精結(jié)合R-ICSI方法優(yōu)化臨床結(jié)局。施曉鋆等[20]則強(qiáng)調(diào)R-ICSI應(yīng)積極應(yīng)用于不孕年限長且IVF反復(fù)失敗的原發(fā)性不孕者。但是，陳大霞和雷小敏[21]的研究認(rèn)為受精障礙并不歸因于原發(fā)性不孕。本文則進(jìn)一步研究了不育類型對R-ICSI結(jié)局的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性不育組女方年齡較繼發(fā)性不育組小，獲卵數(shù)較繼發(fā)性不育組多。在R-ICSI結(jié)局上，原發(fā)性不育組臨床妊娠率高于繼發(fā)性不育組，但兩組的胚胎發(fā)育情況及其余臨床結(jié)局無顯著差異。雖然原發(fā)性不育組精液質(zhì)量較繼發(fā)性不育組稍差，但是臨床妊娠率卻比繼發(fā)性不育組高。分析可能是由于兩組間女方年齡差異導(dǎo)致，繼發(fā)性不育組女方年齡較大，隨著女方年齡增大，可獲得卵泡數(shù)減少，非整倍體染色體數(shù)目增多，卵子生長環(huán)境發(fā)生改變，卵母細(xì)胞質(zhì)量降低，卵巢功能減退，子宮內(nèi)膜變薄，從而不利于臨床結(jié)局[22]。據(jù)研究報道[23]，女性年齡與卵母細(xì)胞質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，影響妊娠成功率。也可能是由于卵母細(xì)胞對精子DNA損傷具有修復(fù)作用，而女性年齡影響卵母細(xì)胞質(zhì)量，質(zhì)量較高的卵母細(xì)胞具備更優(yōu)的DNA修復(fù)能力[24]，這也使得兩組間精液質(zhì)量的差異并不會很大程度地影響R-ICSI結(jié)局，同時這也造成了研究偏倚。另外，由于R-ICSI是人為挑選高質(zhì)量的精子行助孕治療，使一條精子受精成為可能，降低了精液質(zhì)量對妊娠結(jié)果的影響。本研究結(jié)果顯示，兩組女方患者基礎(chǔ)性激素、竇卵泡數(shù)無顯著差異，且研究對象均采用常規(guī)長方案超促排卵，并嚴(yán)格按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。這排除了內(nèi)分泌異常、卵巢儲備功能異常及不同促排卵方案對結(jié)局造成的影響，故該研究雖然存在一定偏倚，但結(jié)果、結(jié)論仍具有較高的可信度。

綜上所述，本研究通過回顧性研究比較不同不育類型患者的精液質(zhì)量情況及其對R-ICSI臨床結(jié)局的影響，發(fā)現(xiàn)不同的不育類型患者精液質(zhì)量存在差異，且其可對R-ICSI臨床妊娠率產(chǎn)生影響。這提示臨床醫(yī)師在R-ICSI助孕方案中，應(yīng)注意不同不育類型的影響以制定詳細(xì)規(guī)范的診療方案。