逄 宇，王玉峰，高興輝，湯一葦

結(jié)核病是全球面臨的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，2019年全球新發(fā)結(jié)核病患者1 000萬(wàn)例，死亡141萬(wàn)例[1]。結(jié)核病患者的早期快速檢測(cè)對(duì)提高患者的療效，并有效阻斷結(jié)核人際傳播至關(guān)重要，但目前病例發(fā)現(xiàn)率和報(bào)告率仍然較低，特別是在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，估算超過(guò)1/3的病例并未被登記報(bào)告[1,2]。結(jié)核病診斷能力不足是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的根本原因，尤其在患者面對(duì)交通、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等一系列問(wèn)題時(shí)，進(jìn)一步加劇患者的漏診[3]。此外，當(dāng)患者感染利福平耐藥或耐多藥(同時(shí)對(duì)利福平和異煙肼耐藥)的結(jié)核分枝桿菌時(shí)，患者的臨床管理將更為復(fù)雜，但是全球僅有33%的新發(fā)菌陽(yáng)結(jié)核患者開展了抗結(jié)核藥物敏感性檢測(cè)，提高對(duì)結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的快速診斷迫在眉睫[1,4]。然而傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)方法已無(wú)法滿足臨床的實(shí)際需求，亟待在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家使用和推廣新型診斷技術(shù)。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)的發(fā)展，涌現(xiàn)出一批結(jié)核病快速檢測(cè)產(chǎn)品和技術(shù)(見(jiàn)表1)[5～7]，本文就這些產(chǎn)品的主要研究應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)回顧。

表1 結(jié)核病診斷路徑(翻譯和修改于參考文獻(xiàn)[6]的圖1)

續(xù)表1

1 傳統(tǒng)病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

直接觀察到結(jié)核分枝桿菌或者分離到結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核診斷的重要方法，特別是痰涂片和痰培養(yǎng)在結(jié)核病防治歷程中發(fā)揮了重要的作用，然而受限于痰涂片的靈敏度以及痰培養(yǎng)時(shí)效性，限制了其在結(jié)核診斷中的應(yīng)用，如何充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)服務(wù)臨床檢測(cè)是傳統(tǒng)病原學(xué)診斷的基礎(chǔ)。近年來(lái)結(jié)核特有的抗原也可作為結(jié)核診斷的重要標(biāo)志物之一，其在特殊人群的應(yīng)用得到世界衛(wèi)生組織的認(rèn)可和推薦，下面主要對(duì)四類技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)介紹。

1.1痰涂片鏡檢 痰涂片鏡檢作為結(jié)核病診斷的主要手段，應(yīng)用時(shí)間已經(jīng)超過(guò)120年[8]。它操作相對(duì)簡(jiǎn)單且對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求較低，目前仍是許多結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家的主要診斷技術(shù)。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用直接涂片聯(lián)合萋尼氏染色的方法。通過(guò)收集晨痰、夜痰和即時(shí)痰等方式提高患者發(fā)現(xiàn)率，但是由于需要多次往返醫(yī)療機(jī)構(gòu)，世界衛(wèi)生組織建議在醫(yī)院采集兩份質(zhì)量良好的痰標(biāo)本也可滿足檢測(cè)要求。多種對(duì)涂片和染色方法的改進(jìn)，包括離心集菌、熒光染色、添加漂白劑等，可以提高痰涂片的檢測(cè)靈敏度[9]。但是痰涂片檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本需要痰中菌的濃度達(dá)到10 000個(gè)結(jié)核桿菌/ml，對(duì)于含菌量較少的患者，如兒童結(jié)核、HIV/TB雙感、肺外結(jié)核患者，痰涂片診斷能力較差[10]。來(lái)自不同研究結(jié)果表明，痰涂片鏡檢在培養(yǎng)陽(yáng)性的肺結(jié)核患者中的陽(yáng)性率為20%～70%[11]，提示不同實(shí)驗(yàn)室人員能力對(duì)于痰涂片鏡檢產(chǎn)生明顯的影響。痰涂片顯微鏡還有多項(xiàng)其他缺點(diǎn)，包括不能區(qū)分菌體的死活，不能區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌，無(wú)法開展后續(xù)的藥物敏感性試驗(yàn)(以下簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn))等。因此，世界衛(wèi)生組織推薦采用快速的分子生物學(xué)方法作為痰涂片的替代方法用于結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的患者篩查[12～14]。

1.2分枝桿菌培養(yǎng) 結(jié)核分枝桿菌最快分裂增殖速度為18 h一代，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)一般為2～6周，因此結(jié)核分枝桿菌的分離培養(yǎng)時(shí)間相比普通微生物耗時(shí)更長(zhǎng)。此外，由于生物安全原因，分枝桿菌的培養(yǎng)需在生物安全Ⅱ級(jí)及以上級(jí)別實(shí)驗(yàn)室才可以開展。在中低收入國(guó)家，一般在結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室開展培養(yǎng)，主要包括固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法(MGIT)兩種，從采集樣本至報(bào)告陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果，固體培養(yǎng)法一般需4～6周，而MGIT由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，可能提前到1～2周上報(bào)陽(yáng)性結(jié)果[15]。我國(guó)大多數(shù)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室使用羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)分枝桿菌，在結(jié)核病可疑癥狀者中陽(yáng)性率為28%～34%，其所需時(shí)間較長(zhǎng)，不利于早期發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核病患者和早期診斷耐藥肺結(jié)核病患者[16]。Brum等[17]評(píng)估了MGIT320診斷結(jié)核病的價(jià)值，在涂片陽(yáng)性的患者中，固體培養(yǎng)和MGIT的報(bào)陽(yáng)時(shí)間分別為17.3 d和8.8 d，在涂片陰性的患者中分別為24.1 d和13.2 d?？梢?jiàn)MGIT診斷結(jié)核病陽(yáng)性率更高，用時(shí)更短，在結(jié)核病早期診斷非常有效。

1.3藥敏試驗(yàn) 表型藥敏試驗(yàn)(phenotypic drug sensitivity test，PDST)是在含一定藥物濃度的固體培養(yǎng)基上接種一定數(shù)量的分枝桿菌，當(dāng)分枝桿菌能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)被界定為耐藥菌株，反之則定為敏感菌株。目前結(jié)核分枝桿菌PDST方法有絕對(duì)濃度法、固體比例法、液體藥敏法以及7H10或7H11瓊脂法。固體法藥敏試驗(yàn)根據(jù)操作方法不同分為絕對(duì)濃度法和比例法，丁北川等[18]按照世界衛(wèi)生組織規(guī)定的絕對(duì)濃度法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果與比例法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。劉宇紅等[19]研究表明比例法和國(guó)內(nèi)絕對(duì)濃度法結(jié)果存在明顯差異的藥物是異煙肼、乙胺丁醇，而濃度界限接近的利福平則差異不明顯，有差異的菌株最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)均在比例法和絕對(duì)濃度法濃度界限之間。說(shuō)明兩種檢測(cè)方法之間主要差異是耐藥界限。液體藥敏試驗(yàn)作為比例法藥敏試驗(yàn)的一種，因培養(yǎng)和藥敏檢測(cè)到出報(bào)告的時(shí)間大大縮短，而被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室采用。但液體藥敏試驗(yàn)需專用設(shè)備和專用試劑，成本較高，因此，限制了液體藥敏方法的廣泛推廣，尤其是在中低收入國(guó)家或地區(qū)[7]。目前，世界衛(wèi)生組織推薦用于結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測(cè)的方法中，可進(jìn)行MGIT液體法藥敏的檢測(cè)藥物為11種，多于其他LJ固體法和7H10/7H11法。目前基于MGIT的液體藥敏是診斷二線抗結(jié)核藥物，特別是貝達(dá)喹啉、利奈唑胺等藥物耐藥性的核心方法。

1.4結(jié)核抗原檢測(cè) 脂阿拉伯糖(lipoarabinomannan,LAM)是分枝桿菌細(xì)胞壁脂多糖的組成成分，其核心骨架為甘露聚糖，側(cè)鏈為甘露糖、阿拉伯糖單位，分子以磷脂酰肌醇錨定在胞質(zhì)膜上，具有高免疫原性。具有免疫缺陷癥狀的HIV-TB共感染患者的尿液中可檢測(cè)到LAM抗原，使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法或者TB-LAM檢測(cè)試紙條，這種檢測(cè)試紙條造價(jià)便宜且在30 min內(nèi)可以獲得結(jié)果[20,21]。在HIV-TB共感染、免疫缺陷(CD4<200個(gè)/μl)人群，其診斷結(jié)核病靈敏度超過(guò)70%[7]。Broger等[22]研究了檢測(cè)感染HIV患者使用便攜式的商業(yè)化LAM檢測(cè)試劑盒進(jìn)行尿檢，發(fā)現(xiàn)改進(jìn)后的SILVAMP-LAM在檢測(cè)CD4細(xì)胞數(shù)量≤100個(gè)/μl時(shí)靈敏度為87.1%(95%CI：79.3%～93.6%)，高于未改進(jìn)的LF-LAM檢測(cè)方法，同時(shí)比較了感染HIV患者CD4細(xì)胞數(shù)量分布為≤100個(gè)/μl，101～200個(gè)/μl和>200個(gè)/μl時(shí)SILVAMP-LAM檢測(cè)靈敏度，發(fā)現(xiàn)在CD4≤100個(gè)/μl時(shí)靈敏度最高。世界衛(wèi)生組織推薦其用于HIV陽(yáng)性住院患者有結(jié)核病癥狀，伴CD4≤100個(gè)/μl或者重癥HIV陽(yáng)性患者[23]。

2 免疫學(xué)檢測(cè)

傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)方法效果有限，無(wú)法真正滿足臨床需求，基于宿主和病原相互作用的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)在結(jié)核病輔助診斷中可能具有重要作用，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法包括結(jié)核抗體、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)、γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-γ release assay,IGRA)等，其中后兩種方法對(duì)于區(qū)分潛伏感染和健康人群具有重要價(jià)值，近年來(lái)基于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的新型宿主診斷標(biāo)志物的篩選和應(yīng)用為結(jié)核病免疫學(xué)診斷提供了新的思路，下面主要對(duì)此類技術(shù)進(jìn)行介紹。

2.1結(jié)核抗體檢測(cè) 基于血液標(biāo)本的活動(dòng)結(jié)核診斷產(chǎn)品已應(yīng)用多年，特別是在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家。世界衛(wèi)生組織于2008年對(duì)不同國(guó)家報(bào)送的19種結(jié)核病血清學(xué)快速診斷產(chǎn)品進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)估，結(jié)果表明，與痰培養(yǎng)相比，這些試劑盒在涂陽(yáng)患者中檢測(cè)的靈敏度在1%～60%之間，特異度在53%～99%之間[24]。在涂陰患者和HIV陽(yáng)性患者的靈敏度和特異度比涂陽(yáng)患者平均低22%左右。后續(xù)的對(duì)抗體檢測(cè)方法的薈萃分析也表明這類檢測(cè)方法準(zhǔn)確性偏低，因此，世界衛(wèi)生組織不建議將抗體檢測(cè)方法用于活動(dòng)性結(jié)核的診斷[25]。盡管有學(xué)者認(rèn)為這種靈敏度的差別是由于結(jié)核感染的不同階段分泌不同的蛋白從而產(chǎn)生不同抗體，并建議使用多種抗體的組合以提升試劑盒檢測(cè)的靈敏度，但是這種改良方法在提高靈敏度的同時(shí)，導(dǎo)致檢測(cè)特異度的顯著下降，因此，對(duì)基于抗體的免疫學(xué)診斷方法需要不斷的改進(jìn)和優(yōu)化。

2.2TST 在IGRA出現(xiàn)前，TST一直是診斷潛伏感染及輔助診斷活動(dòng)性結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)[26]。借助皮下注射結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌株蛋白衍生物，觀察人體對(duì)其免疫應(yīng)答，從而判斷患者是否被結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染。早期使用的TST是牛型分枝桿菌的蛋白衍生物，因此無(wú)法有效區(qū)分卡介苗(BCG)接種與結(jié)核分枝桿菌感染造成的陽(yáng)性結(jié)果。近來(lái)，出現(xiàn)了以人型結(jié)核分枝桿菌制備的蛋白衍生物，可以有效排除BCG接種造成的假陽(yáng)性結(jié)果。但是TST對(duì)于部分特殊人群，包括營(yíng)養(yǎng)不良和HIV感染引起的免疫抑制人群，容易由于免疫應(yīng)答不足造成假陰性的情況[27,28]。此外，注射方式及判讀結(jié)果等都可能影響最終的檢測(cè)結(jié)果，48～72 h后的判讀方式可能會(huì)影響TST在人群中的使用范圍。

2.3IGRA IGRA是近10余年新型的一種潛伏感染人群的免疫診斷方法。通過(guò)檢測(cè)受試者外周血中是否存在結(jié)核抗原特異性的記憶淋巴細(xì)胞，此方法能夠精準(zhǔn)鑒定其結(jié)核感染狀態(tài)[29]。相比于TST，IGRA具有更高的特異性，可能區(qū)別結(jié)核自然感染和BCG疫苗誘發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。然而其在臨床中使用的主要問(wèn)題在于無(wú)法區(qū)分潛伏感染和活動(dòng)性結(jié)核，因此，IGRA陽(yáng)性結(jié)果不能作為活動(dòng)性結(jié)核的確診標(biāo)準(zhǔn)[30]。盡管有研究表明結(jié)核抗原特異性的γ干擾素釋放水平隨著治療過(guò)程明顯下降，但是世界衛(wèi)生組織在相關(guān)指南中不建議在結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家診斷活動(dòng)性結(jié)核，同時(shí)反對(duì)用于預(yù)測(cè)結(jié)核病患者的治療轉(zhuǎn)歸或者疫苗接種后的保護(hù)效力評(píng)價(jià)[31]。然而，IGRA對(duì)于部分菌陰結(jié)核、兒童結(jié)核等缺乏病原學(xué)依據(jù)的活動(dòng)結(jié)核病患者的臨床診斷存在一定的價(jià)值。

2.4結(jié)核宿主反應(yīng) 結(jié)核感染人體后，宿主的免疫系統(tǒng)啟動(dòng)一系列應(yīng)答反應(yīng)應(yīng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的入侵，尋找基于宿主特異性的診斷標(biāo)志物成為解決菌陰結(jié)核診斷難題的突破口。多項(xiàng)研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法探究活動(dòng)性結(jié)核患者全血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，鑒定出干擾素誘導(dǎo)的多個(gè)基因標(biāo)志物可用于診斷活動(dòng)性結(jié)核，這些標(biāo)志物僅在活動(dòng)性結(jié)核患者中高表達(dá)，可有效排除健康人群及潛伏感染者[32]。一項(xiàng)小范圍的病例對(duì)照研究顯示，F(xiàn)CGR1B基因僅在活動(dòng)性結(jié)核患者外周血中高表達(dá)，且與CD64、LTF、GBP5和GZMA四個(gè)基因聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核和潛伏感染者的鑒別診斷靈敏度和特異度分別達(dá)到94%和97%，具有良好的應(yīng)用前景[33]。此外，Kaforou和其合作者研究了活動(dòng)性結(jié)核、潛伏感染和其他疾病的外周血轉(zhuǎn)錄組后，篩選獲得44個(gè)基因組成的標(biāo)志物組合，在病原學(xué)陽(yáng)性的結(jié)核病患者和其他患者的鑒別診斷中，其靈敏度為100%，特異度為96%[34]。上述結(jié)果均表明，基于宿主的免疫學(xué)診斷標(biāo)志物將成為結(jié)核病診斷的重要組成部分[35]。結(jié)核-宿主免疫互作機(jī)制的深度挖掘和大隊(duì)列的臨床驗(yàn)證將幫助我們建立診斷活動(dòng)性結(jié)核的新方法。英國(guó)Berry等[36]學(xué)者應(yīng)用轉(zhuǎn)錄芯片技術(shù)對(duì)眾多結(jié)核患者血中393種轉(zhuǎn)錄因子水平進(jìn)行系統(tǒng)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有86種轉(zhuǎn)錄因子水平在活動(dòng)性結(jié)核與其他炎癥或感染性患者之間有明顯區(qū)別。美國(guó)斯坦福大學(xué)Sweeney團(tuán)隊(duì)分析篩選了來(lái)自11個(gè)國(guó)家的14個(gè)獨(dú)立隊(duì)列的2 572例結(jié)核患者全血中結(jié)核感染相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因表達(dá)水平在活動(dòng)性結(jié)核與其他患者之間有顯著不同。其中GBP5和DUSP3兩個(gè)因子在活動(dòng)性結(jié)核患者中表達(dá)上調(diào)，而另一個(gè)KLF3表達(dá)則下調(diào)[37]。Warsinske等[38]進(jìn)一步將這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)因子相加減創(chuàng)建了一個(gè)3-基因結(jié)核分?jǐn)?shù)(3-gene TB score),可以在臨床上用于隱匿性結(jié)核感染和活動(dòng)性結(jié)核的鑒別診斷以及治療效果的快速準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)。賽沛Xpert MTB HR產(chǎn)品將這一技術(shù)移植到GeneXpert系統(tǒng)中，該試劑盒采用0.1 ml末梢或采集靜脈血，隨到隨測(cè)，可以在30 min完成檢測(cè)。結(jié)果直接應(yīng)用3個(gè)因子的CT值加減獲得，期望在結(jié)核病的快速篩查、鑒別診斷以及治療監(jiān)測(cè)上起到一定作用[39]。

3 基因檢測(cè)與分子耐藥檢測(cè)產(chǎn)品

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，使結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)、鑒定和藥敏試驗(yàn)技術(shù)取得了很大的進(jìn)展。分子生物學(xué)技術(shù)可特異性擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌的目標(biāo)基因，直接檢測(cè)痰液、支氣管肺泡灌洗液等樣本，快速得到檢測(cè)結(jié)果，極大縮短了結(jié)核病診斷時(shí)間，提高了結(jié)核病診斷的準(zhǔn)確性和效率。目前應(yīng)用在結(jié)核分枝桿菌基因檢測(cè)與分子耐藥檢測(cè)方面的產(chǎn)品主要有實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)品、等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)品和基因測(cè)序產(chǎn)品等(見(jiàn)表2)[40]。

表2 世界衛(wèi)生組織支持肺結(jié)核檢測(cè)和藥物敏感性檢測(cè)的分子檢測(cè)產(chǎn)品(翻譯和修改于參考文獻(xiàn)[40]的表1)

3.1實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)品 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是通過(guò)熒光基團(tuán)標(biāo)記的特異性探針或分子信標(biāo)對(duì)基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析。與傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢查相比，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)快、特異性強(qiáng)、可重復(fù)性好、可自動(dòng)化且通量高等優(yōu)點(diǎn)。目前實(shí)時(shí)定量PCR主要用于臨床標(biāo)本是否存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及其對(duì)藥物的耐藥性，主要有賽沛的Xpert MTB/RIF、Xpert MTB/RIF Ultra、Xpert MTB/XDR產(chǎn)品，羅氏的Cobas TaqMan MTB產(chǎn)品，雅培的RealTime MTB和MTB RIF/INF產(chǎn)品，Hain公司的Genotype MTBDRplus、Genotype MTBDRsl、FluoroType MTBDR產(chǎn)品，BD公司的MAX-MDR-TB產(chǎn)品，廈門致善公司的MeltPro-TB產(chǎn)品等。

3.1.1 賽沛Xpert MTB/RIF產(chǎn)品 這是一種基于巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，能自動(dòng)進(jìn)行核酸提取擴(kuò)增檢測(cè)，可直接從痰液標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其對(duì)利福平的耐藥性，整個(gè)過(guò)程在密閉環(huán)境中進(jìn)行，手動(dòng)操作時(shí)間不超過(guò)1 min，對(duì)操作者和周圍環(huán)境安全，全程約110 min即獲得結(jié)果。在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方面，Xpert MTB/RIF的靈敏度約為88%，特異度約為99%[40]；對(duì)涂片陽(yáng)性、培養(yǎng)陽(yáng)性患者有較高的敏感性(靈敏度為98.2%)，顯著高于涂片陰性、培養(yǎng)陽(yáng)性患者(靈敏度為72.5%)[41]；在HIV陰性患者中靈敏度約為88%，HIV陽(yáng)性患者中靈敏度約為81%，特異度在兩種人群中約為98%[42]。在57項(xiàng)利福平耐藥檢測(cè)研究中，其靈敏度約為96%，特異度約為98%[42]。在15項(xiàng)兒童肺結(jié)核研究中，與培養(yǎng)相比，其在咳痰或誘導(dǎo)痰樣本中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的合并靈敏度和特異度分別為62%和98%；在胃液中合并靈敏度和特異度分別為66%和98%。相比涂片鏡檢，其檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的靈敏度提高了36%～44%。其在檢測(cè)利福平耐藥方面合并靈敏度和特異度分別為86%和98%[43,44]。Xpert MTB/RIF不僅在肺結(jié)核得到廣泛應(yīng)用，而且也可用于肺外結(jié)核病及非痰標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)和耐藥檢測(cè)。但其研究結(jié)果尚不一致，部分靈敏度欠佳，但其特異度較高，總體上顯示上較好的診斷效能[40,43,45]。

3.1.2 賽沛Xpert MTB/RIF Ultra產(chǎn)品 通過(guò)改進(jìn)試劑盒設(shè)計(jì)、PCR和突變檢測(cè)，提高對(duì)低細(xì)菌負(fù)荷肺疾病和肺外疾病的結(jié)核患者檢出率和改善利福平耐藥檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)時(shí)間縮短為80 min。在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方面，Ultra比MTB/RIF更靈敏(88% vs 83%)，但特異度略差(98% vs 96%)；在利福平耐藥方面，兩者的靈敏度和特異度是相似的，分別為95%和98%。在痰標(biāo)本中，Ultra的靈敏度為87.5%，而MTB/RIF為81%；在痰涂片陰性Ultra靈敏度為78.9%，MTB/RIF為66.1%，兩者的特異度均為98.7%，且兩者在利福平耐藥性檢測(cè)結(jié)果一致[42,46]。世界衛(wèi)生組織在全球結(jié)核病報(bào)告中強(qiáng)烈推薦了Xpert MTB/RIF和Ultra技術(shù)的臨床應(yīng)用。Xpert MTB/RIF和Ultra被強(qiáng)烈推薦作為有肺結(jié)核癥狀和體征的成人及兒童的初始檢測(cè)；在有肺結(jié)核體征和癥狀或胸片存在肺部異?；騼烧呒嬗械钠胀ǔ扇酥斜煌扑]作為肺結(jié)核初始檢測(cè)；被推薦作為有肺結(jié)核癥狀和體征的成人和兒童的重復(fù)檢測(cè)；被推薦作為成年人和兒童懷疑MDR-TB感染或并發(fā)HIV感染的首選檢測(cè)方法，從而替代傳統(tǒng)的涂片鏡檢、培養(yǎng)和藥物試驗(yàn)方法；被推薦對(duì)疑似肺外結(jié)核患者的肺外標(biāo)本如腦脊液、淋巴結(jié)和其他組織進(jìn)行檢測(cè)；還被推薦用于痰標(biāo)本鏡檢的后續(xù)檢測(cè)，特別是對(duì)于痰涂片檢測(cè)陰性的患者[1,47]。

3.1.3 賽沛Xpert MTB/XDR產(chǎn)品 它可檢測(cè)對(duì)異煙肼(靶基因：inhA啟動(dòng)子、katG、fabG1、aphC-oxyR基因間區(qū))、乙氧酰胺(inhA啟動(dòng)子)、氟喹諾酮類(gyrA和gyrB)以及二線注射藥阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素(rrs和eis啟動(dòng)子)的耐藥性，并被定位為MTB/RIF或Ultra檢測(cè)到利福平耐藥患者的附加檢測(cè)。在結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性痰標(biāo)本與臨床分離株中，以PDST為參考標(biāo)準(zhǔn)，異煙肼檢測(cè)耐藥性的靈敏度和特異度分別為98.3%和95%；氟喹諾酮類耐藥性的靈敏度和特異度分別為91.4%和98.5%；阿米卡星耐藥性的靈敏度和特異度分別為91%和99%；卡那霉素耐藥性的靈敏度和特異度分別為98.1%和97%；卷曲霉素耐藥性的靈敏度和特異度分別為70%和99.7%；乙氧酰胺耐藥性的靈敏度和特異度分別為65.4%和97.3%。當(dāng)以測(cè)序結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，其靈敏度為：異煙肼99.7%，氟喹諾酮類97.5%，阿米卡星100%，卡那霉素96.5%，卷曲霉素94.1%，乙氧酰胺88.5%；除了乙氧酰胺特異度為97.3%，其他藥物的特異度均為100%[48,49]。Xpert MTB/XDR旨在作為結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性標(biāo)本的反射試驗(yàn)，并作為診斷結(jié)核分枝桿菌/廣泛耐藥結(jié)核中存在的主要耐藥類型的輔助診斷。為應(yīng)對(duì)全球耐多藥結(jié)核病危機(jī)和加快診斷，世界衛(wèi)生組織確定擴(kuò)大快速檢測(cè)和檢測(cè)耐藥結(jié)核病是當(dāng)務(wù)之急。獲得快速、敏感和安全的基因型檢測(cè)方法，如Xpert MTB/RIF、Ultra和Xpert MTB/XDR，這些方法通過(guò)識(shí)別已知的突變來(lái)檢測(cè)大多數(shù)臨床菌株對(duì)一線和二線藥物的抗藥性，將最大限度地減少生物危害，并將樣品制備減少到幾個(gè)手動(dòng)步驟，更便于在護(hù)理點(diǎn)使用。當(dāng)與Xpert MTB/RIF或Ultra聯(lián)合使用時(shí)，Xpert MTB/XDR可將結(jié)核病檢測(cè)和耐藥性檢測(cè)擴(kuò)展到醫(yī)療服務(wù)不足的人群[50]。

3.1.4 羅氏Cobas TaqMan MTB產(chǎn)品 這是一種基于實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)、針對(duì)16S RNA基因的高通量檢測(cè)試劑盒。由于標(biāo)本需要用NALC-NaOH進(jìn)行液化、去污和濃縮，容易出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。與培養(yǎng)方法相比，該產(chǎn)品在呼吸道標(biāo)本中的靈敏度為88.4%，特異度為98.8%；非呼吸性標(biāo)本中靈敏度為63.6%，特異度為94.6%[51,52]。

3.1.5 雅培RealTime MTB和MTB RIF/INF產(chǎn)品

RealTime MTB也是一種基于實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)方法，可與全自動(dòng)DNA提取平臺(tái)接口，可以從痰或支氣管肺泡灌洗液中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌。9項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其在檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的合并靈敏度為96%，特異度為97%。4項(xiàng)研究表明雅培MTB RIF/INF產(chǎn)品對(duì)利福平和異煙肼的合并靈敏度為88%，合并特異度為99%，同時(shí)未發(fā)現(xiàn)偏倚[53]。

3.1.6 Hain公司Genotype MTBDRplus、Genotype MTBDRsl、FluoroType MTBDR產(chǎn)品 Hain公司的Genotype MTBDRplus產(chǎn)品是基于PCR-線性探針雜交技術(shù)，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其異煙肼和利福平耐藥性的分子診斷試劑盒。多個(gè)研究表明其對(duì)利福平與異煙肼的靈敏度分別為83.4%、94.6%，特異度分別為99.6%、98.2%，而Xpert MTB/RIF對(duì)利福平的靈敏度和特異度更高，分別為96.8%和98.4%[54]。Genotype MTBDRsl產(chǎn)品是一種用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體中與氟喹諾酮類和二線注射藥物耐藥相關(guān)的特異突變檢測(cè)試劑盒。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其在氟喹諾酮耐藥性方面性能：直接檢測(cè)，其靈敏度和特異度分別為97%和98%；涂陽(yáng)標(biāo)本：80%和100%。二線注射藥物方面：直接檢測(cè)，其靈敏度和特異度分別為89%和90%；涂片陽(yáng)性標(biāo)本：80%和100%。廣泛耐藥結(jié)核?。褐苯訖z測(cè)，其靈敏度和特異度分別為79%和97%；涂片陽(yáng)性標(biāo)本：50%和100%[55]。FluoroType MTBDR產(chǎn)品在涂片陽(yáng)性和涂片陰性標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物的靈敏度分別為98%和92%。涂片陰性標(biāo)本對(duì)利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為100%和97%；異煙肼耐藥性的靈敏度和特異度分別為100%和98%；耐多藥結(jié)核病的靈敏度和特異度分別為100%和100%。同時(shí)能鑒定rpoB、katG和inhA啟動(dòng)子突變的靈敏度分別為98%、97%和97%。該產(chǎn)品可用于利福平和異煙肼的快速藥敏試驗(yàn)，此外能同時(shí)識(shí)別rpoB、katG和inhA啟動(dòng)子中幾乎所有突變的能力，可能對(duì)個(gè)體化治療有用[56]。

3.1.7 BD公司MAX-MDR-TB產(chǎn)品 這是一款檢測(cè)臨床標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物并同時(shí)檢測(cè)異煙肼和利福平耐藥性的分子平臺(tái)。與培養(yǎng)相比，該產(chǎn)品的總體靈敏度和特異度分別為86.6%和100.0%；涂片陽(yáng)性和涂片陰性標(biāo)本的靈敏度分別為100%和64.5%。與PDST相比，異煙肼和利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為58.3%、99.3%和100%、98.2%；與Genotype MTBDRplus相比，異煙肼和利福平耐藥的靈敏度和特異度分別為100%、99.4%和100%、99.4%[57,58]。

3.1.8 廈門致善公司MeltPro-TB產(chǎn)品 這是一種基于熔融曲線分析的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法，有結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)和利福平、異煙肼、鏈霉素和氟喹諾酮等耐藥突變檢測(cè)等多種產(chǎn)品。耐藥檢測(cè)產(chǎn)品可檢測(cè)痰標(biāo)本的耐多藥和廣泛耐藥，以PDST為參考標(biāo)準(zhǔn)，該產(chǎn)品檢測(cè)利福平耐藥的靈敏度為94.2%，異煙肼耐藥的靈敏度為84.9%；二線藥物耐藥氧氟沙星靈敏度為83.3%，阿米卡星耐藥的靈敏度為75.0%，卡那霉素耐藥?kù)`敏度為63.5%?？傮w而言，MeltPro-TB法檢測(cè)耐多藥結(jié)核分枝桿菌和廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌具有良好的性能，其靈敏度分別為86.7%和71.4%[59]。鏈霉素耐藥突變檢測(cè)產(chǎn)品在臨床菌株種的檢測(cè)靈敏度和特異度分別為88.8%和95.8%[60]。在疑似脊柱結(jié)核的患者中，MeltPro-TB檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的靈敏度為57.68%，高于培養(yǎng)法(51.72%)和涂片法(24.45%)，但顯著低于Xpert MTB/RIF(85.27%)[61]。MeltPro-TB法業(yè)已作為我國(guó)檢測(cè)耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核病例的可選擇方法。

3.2等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)品 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)基于其獨(dú)特的擴(kuò)增原理，其靈敏度高但特異度相對(duì)較低，對(duì)防污染措施要求嚴(yán)格，其自動(dòng)化程度越高，檢測(cè)結(jié)果可信度越高。常見(jiàn)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、交叉引物擴(kuò)增技術(shù)(cross primer amplification,CPA)等。LAMP的特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件下保溫30～60 min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。CPA可在恒定的溫度條件下，通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的引物和探針，高效擴(kuò)增指定的目標(biāo)核酸。與常規(guī)PCR相比，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過(guò)程。LAMP和CPA是全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，主要用于檢測(cè)臨床標(biāo)本中是否存在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。

3.2.1 TB-LAMP產(chǎn)品 日本榮研株式會(huì)社TB-LAMP產(chǎn)品是利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，快速、高效、特異性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群新型分子診斷產(chǎn)品。在375例結(jié)核培養(yǎng)陽(yáng)性痰標(biāo)本中，TB-LAMP檢出率為75.6%，其中涂陽(yáng)肺結(jié)核樣本檢出率為97.9%，痰涂片陰性結(jié)核樣本檢出率為46.6%。477例未接受結(jié)核病治療的培養(yǎng)陰性受試者特異度為98.7%[62]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)以培養(yǎng)作為參考標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，TB-LAMP的總體靈敏度為99%，特異度為94%，而Xpert MTB/RIF靈敏度和特異度更高，分別為99.1%和96%，說(shuō)明TB-LMAP有較高的靈敏度和特異度[63]。世界衛(wèi)生組織推薦TB-LAMP或許可替代顯微鏡檢查(有條件推薦)，以幫助診斷有結(jié)核病癥狀和體征的成人肺結(jié)核。對(duì)于有肺結(jié)核癥狀和體征的成人，特別是痰涂片陰性標(biāo)本需要進(jìn)一步檢測(cè)時(shí)，或許也可考慮作為顯微鏡檢查的后續(xù)檢查[13]。但TB-LAMP不能代替快速分子試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)TB和利福平耐藥，尤其是MDR-TB高危人群[13]。

3.2.2 DeFast.TB產(chǎn)品 廣州迪澳公司的DeFast.TB結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑采用恒溫?cái)U(kuò)增法。在初診肺結(jié)核患者中其檢出率為48.4%，高于涂片法；對(duì)涂陽(yáng)患者的總檢出率為90.2%，對(duì)涂陰患者的檢出率為15.4%[64]。

3.2.3 EasyNAT TB-CPA產(chǎn)品 優(yōu)思達(dá)的EasyNAT TB-CPA產(chǎn)品是基于交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA試劑盒，用于結(jié)核分枝桿菌感染的輔助診斷。研究發(fā)現(xiàn)與培養(yǎng)法相比，該產(chǎn)品的靈敏度為66.7%，對(duì)涂片陰性和培養(yǎng)陽(yáng)性患者的靈敏度僅為10%，對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性患者的特異度為100%[65]。在結(jié)核性淋巴結(jié)炎兒童中，以培養(yǎng)和(或)細(xì)胞學(xué)綜合參考標(biāo)準(zhǔn)，Xpert-MTB/RIF和EasyNAT的靈敏度和特異度分別為58%和93%、19%和100%[66]。

3.3基因測(cè)序分析 基因測(cè)序是通過(guò)對(duì)結(jié)合分枝桿菌的靶標(biāo)基因中基因序列的測(cè)定，并與國(guó)際核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)合分枝桿菌及其耐藥性的精準(zhǔn)檢測(cè)，目前主要用于分枝桿菌病原菌的耐藥檢測(cè)和菌種鑒定。應(yīng)用于結(jié)核檢測(cè)方面的測(cè)序分析主要有Sanger測(cè)序、焦磷酸測(cè)序、二代測(cè)序(next-generation sequencing,NGS)等。

3.3.1 Sanger測(cè)序 這是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，并且在每個(gè)堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得可見(jiàn)DNA堿基序列的一種方法。Sanger測(cè)序是最為經(jīng)典的一代測(cè)序技術(shù)，目前仍是獲取核酸序列最為常用的方法。與DST方法相比，Sanger測(cè)序在耐多藥和廣泛耐藥結(jié)核中檢出率分別為84.31%和83.33%，其中利福平、異煙肼和氟喹諾酮耐藥性的靈敏度和特異度分別為96.92%和98.35%、86.89%和99.20%、77.5%和97.26%[67]。同時(shí)Sanger測(cè)序法也用于結(jié)核耐藥表型結(jié)果和基因結(jié)果不一致時(shí)確認(rèn)[68]。

3.3.2 焦磷酸測(cè)序 這是利用引物鏈延伸時(shí)所釋放的焦磷酸基團(tuán)激發(fā)熒光，通過(guò)峰值高低判斷與其相匹配的堿基數(shù)量。由于使用了實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)的概念，焦磷酸測(cè)序?qū)崿F(xiàn)了對(duì)特定位點(diǎn)堿基負(fù)荷比例的定量，因此在SNP位點(diǎn)檢測(cè)、等位基因(突變)頻率測(cè)定、細(xì)菌和病毒分型檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛。通過(guò)16S rRNA焦磷酸測(cè)序檢測(cè)肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)其中的微生物群比健康人多，且發(fā)現(xiàn)許多外來(lái)細(xì)菌，如狹養(yǎng)單胞菌、銅綠假單胞菌、嗜熱菌、鞘氨醇單胞菌、甲基桿菌、發(fā)汗桿菌、單胞菌和運(yùn)動(dòng)菌等，這些細(xì)菌都是肺結(jié)核患者特有的[69]。用16S rRNA焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)了結(jié)核病感染患者的痰菌群發(fā)現(xiàn)硬壁菌、蛋白細(xì)菌、擬桿菌、放線桿菌和梭桿菌是五大細(xì)菌門，它們共同構(gòu)成了98%以上的微生物群落。結(jié)核標(biāo)本中蛋白質(zhì)細(xì)菌和類桿菌較多，對(duì)照組中硬壁菌更為突出。在所有結(jié)核病標(biāo)本中均發(fā)現(xiàn)放線菌、梭桿菌、瘦肉桿菌、普雷沃特菌、鏈球菌和維管束菌，可能代表了結(jié)核痰菌群的核心屬。用高通量焦磷酸化測(cè)序技術(shù)分析了結(jié)核病患者痰中微生物群的組成和多樣性。它為研究不同微生物群在結(jié)核病發(fā)病和發(fā)展中的潛在作用奠定了框架，并最終促進(jìn)了結(jié)核病治療的進(jìn)展[70]。

3.3.3 NGS 其最大特征是通量高，可測(cè)定幾百萬(wàn)甚至上億條DNA或者RNA序列，大大加快了宏基因組測(cè)序的速度，從而可以極大地降低單個(gè)堿基測(cè)序的成本。NGS還提供了更大的檢測(cè)能力，通過(guò)深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)新的或罕見(jiàn)的變體。NGS診斷傳染病的靈敏度和特異度分別為50.7%和85.7%，優(yōu)于培養(yǎng)法，尤其對(duì)結(jié)核分枝桿菌診斷優(yōu)勢(shì)比達(dá)到4，但也存在假陽(yáng)性結(jié)果，可能是定植、潛在感染等原因?qū)е耓71]。同時(shí)NGS更多應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性測(cè)定，為指導(dǎo)耐藥結(jié)核病合理治療提供準(zhǔn)確的依據(jù)。通過(guò)NGS獲得的數(shù)據(jù)使得檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌遺傳變異的能力無(wú)與倫比，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)的分析有助于重建結(jié)核分枝桿菌的系統(tǒng)發(fā)育，這有助于我們更好地了解結(jié)核分枝桿菌的全球分布[72]。NGS已被用來(lái)解答有關(guān)結(jié)核病傳播的問(wèn)題，并將在不久的將來(lái)成為結(jié)核分枝桿菌分型的常規(guī)方法，因?yàn)樗葌鹘y(tǒng)的分型方法具有更高的分辨率。NGS的高分辨率能夠區(qū)分結(jié)核的復(fù)發(fā)和再感染[73]。這對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)估治療和預(yù)防方案至關(guān)重要。NGS已被用于了解結(jié)核高負(fù)荷環(huán)境下的傳播動(dòng)力學(xué)，證明了這種方法在確定高負(fù)荷環(huán)境下結(jié)核分枝桿菌傳播動(dòng)力學(xué)方面確實(shí)具有最大的影響[74,75]。NGS分析得出一線和二線藥物的易感結(jié)果，這些數(shù)據(jù)也可能是了解各國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)的寶貴資源。NGS已成功地用于烏干達(dá)的一項(xiàng)耐藥性調(diào)查，該調(diào)查使用NGS分析了一小部分對(duì)異煙肼和利福平具有表型抗性的菌株，以嘗試了解耐藥性的程度。隨著技術(shù)的迅速發(fā)展，NGS的成本繼續(xù)下降。然而，這項(xiàng)技術(shù)仍然昂貴，而且對(duì)于高負(fù)擔(dān)、低收入的環(huán)境來(lái)說(shuō)是不可能的。預(yù)計(jì)在不久的將來(lái)，結(jié)核分枝桿菌NGS將適用于低收入、高負(fù)擔(dān)的環(huán)境中，用于定期進(jìn)行耐藥性監(jiān)測(cè)，以了解耐藥機(jī)制，并為設(shè)計(jì)更廉價(jià)的分子診斷提供依據(jù)[76,77]。

4 總結(jié)與展望

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及其耐藥性檢查等表型方法技術(shù)仍然是結(jié)核病診斷中的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于其操作復(fù)雜、周轉(zhuǎn)時(shí)間冗長(zhǎng)、生物安全要求比較高等難以在結(jié)核病診療中發(fā)揮主導(dǎo)作用。分子生物學(xué)技術(shù)以及宿主反應(yīng)檢測(cè)具有快速敏感的特點(diǎn)，但特異性有待提高(見(jiàn)表3)[6]。在研發(fā)中的一系列結(jié)核病的新技術(shù)方法中，以定性或定量檢測(cè)感染后的結(jié)核病原體以及宿主反應(yīng)的代謝產(chǎn)物的代謝質(zhì)譜技術(shù)值得關(guān)注[78]。2014年Choi等[79]教授應(yīng)用Gas Isotope Ratio質(zhì)譜技術(shù)建立呼吸實(shí)驗(yàn)快速測(cè)定異煙肼藥物的敏感性。來(lái)自南非的Mahapatra等[80]利用液相質(zhì)譜方法檢測(cè)患者尿液中特異代謝產(chǎn)物去早期判斷治療效果。來(lái)自巴西的學(xué)者[81]采用基于質(zhì)譜的代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)并鑒別敏感、多重和廣泛耐藥結(jié)核菌落。這一系列結(jié)果提示組學(xué)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核菌感染后代謝產(chǎn)物可能成為結(jié)核感染診斷以及治療效果監(jiān)測(cè)的新興重要技術(shù)。

表3 開發(fā)能夠滿足需求的創(chuàng)新結(jié)核病技術(shù)的轉(zhuǎn)化挑戰(zhàn)(翻譯和修改于參考文獻(xiàn)[6]的表3)