齊飄飄 陳 敏 于 躍 常樂怡 李亞寧 王凌宇 袁勇超 樊啟學(xué) 沈志剛

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,教育部長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展工程研究中心,池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070)

黃顙魚(Tachysurus fulvidracoRichardson)隸屬于鯰形目、鲿科、黃顙魚屬[1],廣泛分布于我國長(zhǎng)江、黃河和黑龍江等水域,是我國重要的淡水名優(yōu)魚類,因其肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美,無肌間刺,營養(yǎng)價(jià)值高,養(yǎng)殖周期短等優(yōu)點(diǎn),一直受到養(yǎng)殖者和消費(fèi)者的青睞。黃顙魚2018年全國總產(chǎn)量51.0×107kg,從2012年開始年平均增長(zhǎng)16.4%,是我國淡水名優(yōu)魚類中增長(zhǎng)速度最快、增長(zhǎng)速率最穩(wěn)定的養(yǎng)殖品種[2],2018年全國淡水魚類養(yǎng)殖產(chǎn)量排名第9位,是我國名副其實(shí)的淡水名優(yōu)第一魚。黃顙魚生長(zhǎng)具有明顯的性別二態(tài)性,前期研究我們發(fā)現(xiàn),在相同養(yǎng)殖環(huán)境下,雄魚生長(zhǎng)速度比雌魚快120%[3],達(dá)上市規(guī)格時(shí)雄魚體重可達(dá)雌魚的2—3倍[4]。

為了提高黃顙魚養(yǎng)殖群體的生長(zhǎng)速度與養(yǎng)殖效益,我國科研人員做了大量工作,培育出了2個(gè)黃顙魚新品種,黃顙魚“全雄1號(hào)”(2010年認(rèn)定)和雜交黃顙魚“黃優(yōu)1號(hào)”(2019年認(rèn)定),推動(dòng)了黃顙魚產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)步增長(zhǎng)。在新品種的培育過程中,科研人員對(duì)黃顙魚的性別決定與性別分化機(jī)制、性別特異分子標(biāo)記、性別控制技術(shù)、兩性生長(zhǎng)異形進(jìn)行了大量深入的研究,取得了較大的進(jìn)展[3—14]。黃顙魚遺傳性別決定類型為雄性配子異形(XXXY),但是研究發(fā)現(xiàn)黃顙魚性別分化易受到環(huán)境因素的影響。雖然黃顙魚Y染色體上存在潛在性別決定基因pfpdz1[6],但本研究發(fā)現(xiàn),在性別分化關(guān)鍵時(shí)期,短期的高溫(33℃)處理能誘導(dǎo)部分XX個(gè)體發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。高溫誘導(dǎo)遺傳型雌魚性逆轉(zhuǎn)的機(jī)制尚不清楚。

研究發(fā)現(xiàn),高溫[4,15,22—25]、高密度[26,27]等應(yīng)激條件下引起魚苗雄性化的同時(shí)都伴隨著皮質(zhì)醇水平的升高,使魚類的性腺都朝著雄性方向分化[20,28]。Hattori等[15]高溫處理銀漢魚(Odontesthes bonariensis)幼魚中有相當(dāng)大比例的雌魚逆轉(zhuǎn)為雄魚,與對(duì)照組相比,在高溫飼養(yǎng)的幼魚中檢測(cè)到較高的皮質(zhì)醇;Van den Hurk等[29]用皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮處理虹鱒(Oncorhynchus mykiss)仔魚30d,虹鱒仔魚出現(xiàn)明顯的雄性化,未發(fā)生性逆轉(zhuǎn)雌魚卵巢發(fā)育受到抑制;Hayashi等[21]報(bào)道高溫(33℃)處理青鳉(Oryzias latipes)仔魚引起皮質(zhì)醇水平升高,抑制原始生殖細(xì)胞分化和fshrmRNA表達(dá),青鳉仔魚高溫處理過程中加入皮質(zhì)醇合成酶抑制劑(美替拉酮,metyrapone),雄性化完全被藥物所抵消。此外,XX青鳉孵化后暴露于高溫和皮質(zhì)醇中(0—5日齡)抑制雌性生殖細(xì)胞的增值和卵巢芳香化酶(cyp19a1)的表達(dá),而這些影響在高溫和皮質(zhì)醇處理中加入雌二醇(17β-estradiol,E2)后雄性化被抵消[22]。高溫[15—18,20,24,30]和皮質(zhì)醇[15,26,29,31]處理對(duì)性別調(diào)控的作用在許多魚類中得到證實(shí),我們將這些證據(jù)總結(jié)如下:(1)環(huán)境應(yīng)激條件在魚類性別分化關(guān)鍵時(shí)期誘導(dǎo)雄性化過程中無一例外地導(dǎo)致皮質(zhì)醇水平升高;(2)皮質(zhì)醇處理也能誘導(dǎo)雄性化;(3)而皮質(zhì)醇合成酶抑制劑能抵消高溫等應(yīng)激條件誘導(dǎo)的雄性化;(4)雌二醇處理能解救皮質(zhì)醇或高溫誘導(dǎo)的雄性化。這4個(gè)方面的證據(jù)表明,皮質(zhì)醇很可能是環(huán)境應(yīng)激誘導(dǎo)雄性化過程的關(guān)鍵因子。因此我們推測(cè)皮質(zhì)醇參與環(huán)境誘導(dǎo)雄性化的過程。

本研究以我國重要經(jīng)濟(jì)魚類黃顙魚為研究對(duì)象,開展高溫與皮質(zhì)醇誘導(dǎo)黃顙魚XX個(gè)體雄性化組織學(xué)進(jìn)程研究,以期為解密環(huán)境應(yīng)激誘導(dǎo)魚類雄性化的遺傳學(xué)與生理學(xué)機(jī)制提供基礎(chǔ)資料,并為建立環(huán)境友好型全雄黃顙魚的生產(chǎn)方法提供初步的實(shí)踐支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖

實(shí)驗(yàn)魚親本均來自湖北省黃優(yōu)源漁業(yè)發(fā)展有限公司,雌魚親本來源于江蘇地區(qū),雄性親本來源于湖北本地。選取規(guī)格大體一致、無損傷和體質(zhì)健壯的黃顙魚親本,進(jìn)行人工催產(chǎn),實(shí)驗(yàn)魚苗經(jīng)人工授精孵化所得,出膜后3d用豐年蟲開口(天津豐年水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司),然后逐漸轉(zhuǎn)食成微粒配合飼料(山東升索漁用飼料研究中心,主要成分:粗蛋白質(zhì)≥50.0%,粗脂肪＞8.0%,粗纖維≤3.0%,灰分≤16.5%,水分≤12.0%,鈣≤5.0%,總磷≥1.0%,賴氨酸≥2.0%)。每100 g飼料拌30 mL 95%乙醇溶液,將皮質(zhì)醇溶于乙醇溶液,濃度為300 mg每kg飼料,對(duì)照組和高溫組不添加藥物直接與乙醇混合,每100 g飼料伴入30 mL乙醇,均勻地噴灑在微粒配合飼料中,通風(fēng)廚中過夜晾干,使酒精充分揮發(fā),將配好的飼料置于4℃條件下備用。實(shí)驗(yàn)期間魚苗飼養(yǎng)在60 L的水箱中,在12—35日齡每天投喂3次,36日齡后每天投喂2次,每天清理殘餌糞便并及時(shí)換注清水。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)共3個(gè)組:對(duì)照組(CR)、高溫組(HT)和皮質(zhì)醇組(CS),每組3個(gè)平行,每個(gè)平行隨機(jī)放入500尾魚苗。本次實(shí)驗(yàn)在12—35日齡期間,皮質(zhì)醇處理組投喂伴入皮質(zhì)醇的飼料,對(duì)照組和高溫組僅加入95%乙醇伴入的飼料,皮質(zhì)醇和對(duì)照組平均水溫為26℃,高溫組平均水溫為33℃。35日齡之后所有實(shí)驗(yàn)魚轉(zhuǎn)喂未經(jīng)處理的顆粒飼料,水溫全部設(shè)置為26℃(高溫組水溫每天降低1℃)。實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖階段分別在22、32、42、62、122日齡設(shè)置取樣點(diǎn),每個(gè)平行隨機(jī)撈取相同或相近數(shù)量的實(shí)驗(yàn)魚,用MS-222麻醉后測(cè)量全長(zhǎng)(精確到0.1 mm),取每尾魚鰭條保存于95%乙醇中,取軀干部分(鰓蓋后緣之后,肛門之前)或性腺組織于Bouin’s液中固定,48h后轉(zhuǎn)入70%乙醇常溫保存。

1.3 性別鑒定

采用通用型柱式基因組試劑盒提取鰭條DNA(康為世紀(jì)),利用Dan等[5]開發(fā)的黃顙魚性別特異性分子標(biāo)記(XY-F:5′-GATTGTAGAAGCCATC TCCTTAGCGTA-3′;XY-R:5′-CATGTAGATC ACTGTACAATCCCTG-3′),來鑒定每尾魚的遺傳型性別。PCR反應(yīng)體系為10 μL:上下游引物各0.5 μL;模板DNA 1.0 μL;2×TaqPCR Master Mix 5.0 μL(康為世紀(jì));ddH2O 3.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性3min,34個(gè)循環(huán)(95℃變性30s,59℃退火30s,72℃延伸40s),72℃延伸5min。擴(kuò)增完成后,取PCR產(chǎn)物3 μL,以DL2000 Marker作為參照,利用凝膠成像系統(tǒng)依據(jù)片段長(zhǎng)度鑒別出XY和XX,XY為2條帶(826和955 bp),XX為一條帶(955 bp)。

1.4 性腺組織學(xué)觀察

性腺組織學(xué)樣品通過梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后,連續(xù)切片(切片厚度5—6 μm),用于蘇木精伊紅染色(HE染色),中性樹膠封片,組織切片在光學(xué)顯微鏡下用成像系統(tǒng)進(jìn)行檢查和拍照(Olympus DP73,Japan)。各階段性腺中生殖細(xì)胞的鑒別參照前人對(duì)黃顙魚性腺分化的組織學(xué)觀察研究[31—33]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件(version 20.0)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)差異顯著性檢驗(yàn),方差分析前進(jìn)行數(shù)據(jù)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn),如不符合方差分析的條件,將數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)或正弦轉(zhuǎn)換。用Duncan’s多重比較來確定組間差異的顯著性,P＜0.05時(shí)視為顯著性差異。文中的數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 性別鑒定

黃顙魚遺傳性別決定類型為雄性配子異形(XX-XY)。利用黃顙魚性別特異性的分子標(biāo)記,以黃顙魚基因組為模板擴(kuò)增出兩段不同大小的片段(X-955 bp;Y-826 bp),電泳檢測(cè)結(jié)果擴(kuò)增出兩條帶(955和826 bp)的為雄魚,只有一條帶(955 bp)的為雌魚。

圖1A顯示的是對(duì)照組62日齡利用黃顙魚性別特異性分子標(biāo)記的瓊脂糖凝膠電泳圖(部分),檢測(cè)結(jié)果可以清楚地鑒定出每一尾魚的遺傳型性別,并無模糊條帶,跟我們前期研究結(jié)果一致[3]。因此利用黃顙魚性別特異性的分子標(biāo)記可以100%準(zhǔn)確鑒定遺傳型性別。部分結(jié)果如下:62日齡取樣組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)1、3、4、5、6、7、8、9為雌魚,2、10、11、12、13、14為雄魚,與圖1A所表現(xiàn)的遺傳型性別完全一致。

圖1B顯示的是高溫組62日齡瓊脂糖凝膠電泳圖(部分),62日齡取樣組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)5、8、9、11、14為雌性,1、2、3、4、6、7、10、12、13為雄性,說明4、12、13個(gè)體XX雌魚性逆轉(zhuǎn)為XX偽雄魚,其中7是YY超雄魚。

圖1 黃顙魚雌雄基因型鑒定電泳圖(X-955 bp;Y-826 bp)Fig.1 Genotypic sex identification by using sex-linked markers in yellow catfish(X-955 bp;Y-826 bp)

我們統(tǒng)計(jì)了62日齡時(shí)各處理組的存活率,對(duì)照組存活率(79.4±3.2)%顯著高于高溫組(63.6±1.5)%,而高溫組顯著高于皮質(zhì)醇處理組(59.0±0.6)%。

2.2 高溫和皮質(zhì)醇處理對(duì)黃顙魚生長(zhǎng)的影響

利用黃顙魚性別特異分子標(biāo)記和組織學(xué)結(jié)合的方法,我們分別在各處理組間和各處理組之內(nèi)比較了XX偽雄魚、XX雌魚與XY雄魚生長(zhǎng)方面的差異(表1)。高溫或皮質(zhì)醇處理結(jié)束4周,即黃顙魚幼魚62日齡時(shí),我們發(fā)現(xiàn)不論是高溫組還是皮質(zhì)醇組,XX偽雄魚全長(zhǎng)均顯著大于XX雌魚,也較XY雄魚大。這種生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)一直延續(xù)至122日齡,但這種優(yōu)勢(shì)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。

表1 高溫和皮質(zhì)醇處理對(duì)黃顙魚幼魚生長(zhǎng)的影響Tab.1 The effects of high temperature and cortisol treatments on the growth of yellow catfish

2.3 高溫和皮質(zhì)醇對(duì)黃顙魚性腺發(fā)育和性別分化的影響

我們將每一尾黃顙魚個(gè)體通過性別特異性分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳性別鑒定,并對(duì)相應(yīng)的性腺進(jìn)行組織學(xué)觀察,22日齡性腺組織學(xué)如圖2所示。22日齡皮質(zhì)醇和高溫處理組均未發(fā)現(xiàn)XX個(gè)體發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。高溫組、對(duì)照組和皮質(zhì)醇組中的卵巢組織與精巢組織可明顯區(qū)分,標(biāo)志著卵巢解剖學(xué)上分化的開始。高溫組卵巢組織由卵原細(xì)胞組成,精巢組織仍處在發(fā)育最初期(由少量原始生殖細(xì)胞及體細(xì)胞組成)。對(duì)照組卵巢(圖2C、2c)和皮質(zhì)醇組卵巢(圖2E、2e),卵原細(xì)胞細(xì)胞核染色較淺,細(xì)胞質(zhì)呈網(wǎng)狀或絲狀,卵圓形或橢圓形,細(xì)胞處于有絲分裂期,高溫組卵巢(圖2A、2a)發(fā)育比對(duì)照組(圖2C、2c)和皮質(zhì)醇組(圖2E、2e)快。高溫組(圖2B、2b)、對(duì)照組(圖2D、2d)和皮質(zhì)醇組(圖2F、2f)精巢由原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells)和性腺體細(xì)胞(Somatic gonadal cells)組成。

圖2 黃顙魚XX與XY遺傳型幼魚22日齡性腺組織學(xué)Fig.2 Representative gonadal histology at 22 days post-hatching(DPH)of XX and XY yellow catfish

黃顙魚32日齡性腺組織學(xué)如圖3所示,我們觀察到,高溫組、對(duì)照組和皮質(zhì)醇組中的卵巢組織與精巢組織可明顯區(qū)分。高溫和皮質(zhì)醇處理誘導(dǎo)了一部分XX遺傳型雌魚雄性化,并且這些XX雄魚保留了原有的卵巢腔結(jié)構(gòu);而另一部分雌魚保持了原有的卵巢結(jié)構(gòu)和細(xì)胞。在對(duì)照組(圖3D、3d)中觀察到卵原細(xì)胞,在高溫組(圖3A、3a)部分XX雌魚(未性逆轉(zhuǎn))中觀察到較大的初級(jí)卵母細(xì)胞,初級(jí)卵母細(xì)胞的出現(xiàn)標(biāo)志著卵巢細(xì)胞學(xué)上分化的開始,因此高溫促進(jìn)了卵巢發(fā)育。皮質(zhì)醇組(圖3F、3f)部分XX雌魚(未性逆轉(zhuǎn))中也觀察到卵原細(xì)胞和初級(jí)卵母細(xì)胞,在發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的XX個(gè)體性腺中(圖3G、3g),性腺中充滿大量原始生殖細(xì)胞。高溫組(圖3C、3c)與皮質(zhì)醇組(圖3H、3h)XY個(gè)體精巢與對(duì)照組(圖3E、3e)XY個(gè)體相比,形態(tài)上無明顯區(qū)別。

圖4是黃顙魚62日齡組織學(xué),在結(jié)束處理4周之后(35日齡處理結(jié)束),高溫組(圖4B、4b)和皮質(zhì)醇組(圖4G、4g)性逆轉(zhuǎn)的XX偽雄魚精巢結(jié)構(gòu)仍然保留32日齡時(shí)觀察到的卵巢腔結(jié)構(gòu)。對(duì)照組XY雄魚(圖4E、4e)精原細(xì)胞有絲分裂大量增值充滿整個(gè)精巢,精小葉的形成標(biāo)著著精巢解剖學(xué)水平上的分化。高溫組(圖4C、4c)、對(duì)照組(圖4E、4e)和皮質(zhì)醇組(圖4H、4h)XY雄魚精巢處于發(fā)育的第Ⅰ期,精巢中精原細(xì)胞細(xì)胞核較大,位于細(xì)胞中央。高溫組(圖4B、4b)和皮質(zhì)醇組(圖4G、4g)性逆轉(zhuǎn)的XX偽雄魚精巢組織較大,精巢組織充滿大量無明顯核仁的初級(jí)精母細(xì)胞,說明性逆轉(zhuǎn)XX偽雄魚精巢比正常XY雄魚大。高溫組(圖4A、4a)和皮質(zhì)醇組(圖4F、4f)XX雌魚與對(duì)照組XX雌魚(圖4D、4d)相比,初級(jí)卵母細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小等無明顯差異。

圖5是黃顙魚122日齡組織學(xué),在結(jié)束處理11周之后,高溫組(圖5B、5b)和皮質(zhì)醇組(圖5G、5g)性逆轉(zhuǎn)的XX偽雄魚并未觀察到32日齡和62日齡時(shí)觀察到的卵巢腔結(jié)構(gòu),而具有典型精小葉和精小囊結(jié)構(gòu)。對(duì)照組XY雄魚(圖5E、5e)精巢處于發(fā)育第Ⅲ期,精原細(xì)胞和精母細(xì)胞有絲分裂大量增值充滿整個(gè)精巢。高溫組(圖5C、5c)和皮質(zhì)醇組(圖5H、9h)XY雄魚精巢處于發(fā)育的第Ⅳ期,精巢的精小囊內(nèi)除了有精原細(xì)胞外,還有大量的精母細(xì)胞,并向腹壺腔內(nèi)推進(jìn),腹壺腔中央充滿大量精子細(xì)胞。高溫組(圖5B、5b)性逆轉(zhuǎn)的XX偽雄魚精巢處于發(fā)育的第Ⅳ期,精巢中充滿大量的精子細(xì)胞。皮質(zhì)醇組(圖5G、5g)性逆轉(zhuǎn)的XX偽雄魚精巢處于發(fā)育第Ⅲ期,精細(xì)小管出現(xiàn)管腔,精細(xì)小管內(nèi)充滿大量精原細(xì)胞和精母細(xì)胞,細(xì)胞圓形或橢圓形,細(xì)胞質(zhì)嗜堿性。高溫組(圖5A、5a)、對(duì)照組XX雌魚(圖5D、5d)和皮質(zhì)醇組(圖5F、5f)卵巢發(fā)育至第Ⅱ期,細(xì)胞呈圓形或橢圓形,處于初級(jí)卵母細(xì)胞小生長(zhǎng)期細(xì)胞,細(xì)胞核中核仁數(shù)量增多,靠近核膜內(nèi)側(cè)分布,卵母細(xì)胞膜外包圍一層由濾泡細(xì)胞構(gòu)成的濾泡膜。

圖3 黃顙魚XX與XY遺傳型幼魚32日齡性腺組織學(xué)Fig.3 Representative gonadal histology at 32 days post-hatching(DPH)of XX and XY yellow catfish

圖4 黃顙魚XX與XY遺傳型幼魚62日齡性腺組織學(xué)Fig.4 Representative gonadal histology at 62 days post-hatching(DPH)of XX and XY yellow catfish

此外,我們逐條檢查了具有生殖突的個(gè)體21尾,利用性別特異分子標(biāo)記鑒定發(fā)現(xiàn),其中10尾魚為XX基因型。表明XX偽雄魚具有雄魚特有的生殖突結(jié)構(gòu),可能具有正常的生殖能力。

2.4 溫度和皮質(zhì)醇處理對(duì)黃顙魚性比的影響

黃顙魚幼魚發(fā)育至62和122日齡,通過組織學(xué)鑒定生理型性別,并統(tǒng)計(jì)各處理組雌雄性別比例。如圖所示(圖6A、6B)對(duì)照組沒有個(gè)體發(fā)生性逆轉(zhuǎn),高溫和皮質(zhì)醇處理組中均有一定比例的XX雌魚性逆轉(zhuǎn)為XX偽雄魚,62日齡高溫組中幼魚雄性率為63.3%,其中XX雌性個(gè)體中有26.7%發(fā)生性逆轉(zhuǎn),皮質(zhì)醇組中幼魚的雌、雄比例為1﹕29,其中皮質(zhì)醇組XX雌性個(gè)體中有96.7%發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。122日齡高溫組中幼魚的雌、雄比例為1﹕5.3,其中XX雌性個(gè)體中有62.5%發(fā)生性逆轉(zhuǎn),皮質(zhì)醇組中幼魚的雄性率為77.8%,其中皮質(zhì)醇組XX雌性個(gè)體中有55.6%發(fā)生性逆轉(zhuǎn)。

圖5 黃顙魚XX與XY遺傳型幼魚122日齡性腺組織學(xué)Fig.5 Representative gonadal histology at 122 days post-hatching(DPH)of XX and XY yellow catfish

3 討論

3.1 皮質(zhì)醇可能在高溫誘導(dǎo)XX遺傳型雌魚性逆轉(zhuǎn)中起關(guān)鍵作用

高等脊椎動(dòng)物,性別通常由基因決定,而在魚類中,性別由基因或環(huán)境或它們共同決定[35]。魚類的性別分化極易受到環(huán)境因素的影響,包括溫度、密度[26,27,41]、pH[42,43]、餌料豐度、環(huán)境背景色[31]、溶氧水平[44]和鹽度[45]等,因此,對(duì)于很多魚類來說,性別最終是遺傳基因和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果[46]。研究表明,幾乎在所有的應(yīng)激條件下,魚類的性腺都朝著雄性方向分化[47]。應(yīng)激條件主要通過以下三個(gè)方面引起魚類雄性化[8,9]:(1)提高雄激素水平及相關(guān)基因表達(dá);(2)抑制卵巢分化通路;(3)抑制原始生殖細(xì)胞的增值。研究發(fā)現(xiàn),高溫和皮質(zhì)醇處理會(huì)導(dǎo)致魚類芳香化酶活性升高,抑制生殖細(xì)胞的增殖和卵母細(xì)胞的發(fā)育,同時(shí)導(dǎo)致體內(nèi)皮質(zhì)醇、11-甲基睪酮(11-KT)和睪酮(Testosterone,T)水平升高,使魚類雄性化[15,21,24,29,30]。通過4個(gè)方面的證據(jù):(1)環(huán)境應(yīng)激條件在魚類性別分化關(guān)鍵時(shí)期誘導(dǎo)雄性化過程中無一例外地導(dǎo)致皮質(zhì)醇水平升高[47];(2)皮質(zhì)醇處理也能誘導(dǎo)雄性化[15];(3)而皮質(zhì)醇合成酶抑制劑能抵消高溫等應(yīng)激條件誘導(dǎo)的雄性化[22],(4)雌二醇處理能解救皮質(zhì)醇或高溫誘導(dǎo)的雄性化[23],我們推測(cè)皮質(zhì)醇很有可能是環(huán)境應(yīng)激誘導(dǎo)雄性化過程中的關(guān)鍵因子。同時(shí),從單細(xì)胞動(dòng)物偶爾通過有性生殖來抵御不良環(huán)境,到水生甲殼類通過無性生殖轉(zhuǎn)變?yōu)橛行陨硜矶蛇^環(huán)境壓力[48],再到環(huán)境應(yīng)激普遍性誘導(dǎo)魚類與爬行動(dòng)物雄性化[47],這些證據(jù)將個(gè)體抵御環(huán)境應(yīng)激的通路與性起源與維持聯(lián)系在一起,而皮質(zhì)醇作為個(gè)體最主要的抗應(yīng)激激素,在其中可能起到關(guān)鍵作用。

本實(shí)驗(yàn)高溫和皮質(zhì)醇處理黃顙魚幼魚有部分XX遺傳型雌魚性逆轉(zhuǎn)為XX偽雄魚,皮質(zhì)醇組雌性個(gè)體中85.7%發(fā)生性逆轉(zhuǎn),高溫組中有39.2%發(fā)生雄性化,說明部分XX遺傳型雌魚個(gè)體對(duì)皮質(zhì)醇與高溫處理并不敏感。這種同樣基因型個(gè)體存在溫度敏感性差異現(xiàn)象,在斑馬魚(Danio rerio)[26]和羅非魚(Oreochromis niloticus)[49]中有報(bào)道,但是這其中的機(jī)制卻不得而知。我們發(fā)現(xiàn),對(duì)照組32日齡雌性性腺中觀察到卵原細(xì)胞,而此時(shí)高溫組未發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的XX雌性個(gè)體中觀察到較大的初級(jí)卵母細(xì)胞,且高溫處理組的細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組更多。劉菲菲[50]將孵化后5d的尼羅羅非魚(Nile Tilapia)高溫(36±1)℃處理12d,25日齡高溫組未發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的個(gè)體也同樣觀察到較大的卵母細(xì)胞,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似,說明高溫對(duì)未發(fā)生性逆轉(zhuǎn)個(gè)體的生殖細(xì)胞的發(fā)育具有促進(jìn)作用,使卵巢發(fā)育比對(duì)照溫度提前。同樣是XX基因型個(gè)體,同樣在高溫處理下,一部分個(gè)體卵巢發(fā)育加快,而另一部分卵巢發(fā)育受到抑制繼而發(fā)育成精巢,這背后的機(jī)制需要我們進(jìn)一步挖掘。溫度型性別決定兩大問題還未知:(1)溫度型性別決定的遺傳機(jī)制;(2)溫度如何進(jìn)行信號(hào)傳遞從而決定性別或者引起性逆轉(zhuǎn)。而遺傳-環(huán)境共同性別決定的魚類如黃顙魚、羅非魚等是研究這一問題的最好材料。我們推測(cè),相同基因型的XX個(gè)體對(duì)溫度處理表現(xiàn)出完全相反的表型,是因?yàn)樗鼈冊(cè)谶z傳上存在差異,因此尋找這些差異是我們應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)關(guān)注的研究方向,是解開性別決定進(jìn)化與性別決定機(jī)制轉(zhuǎn)換的重要途徑。

圖6 高溫與皮質(zhì)醇處理對(duì)黃顙魚性別比例的影響Fig.6 Effects of high temperature and cortisol treatments on sex ratios of yellow catfish

3.2 XX遺傳型個(gè)體中存在溫度敏感型與溫度不敏感型

目前,溫度對(duì)于黃顙魚性別分化的報(bào)道存在分歧,游鑫等[33]發(fā)現(xiàn)32℃處理黃顙魚受精卵至60日齡能顯著提高雄魚比例,而Zhang等[51]報(bào)道稱,用高溫32℃和34℃處理黃顙魚幼魚45d對(duì)性比沒有顯著影響;而Xiong等[52]報(bào)道稱32℃和34℃能導(dǎo)致XX全雌種群(芳香化酶抑制劑誘導(dǎo)的XX雄魚與XX雌魚的后代)的雄性化,并且在Zhang等[51]研究結(jié)果的基礎(chǔ)上,推測(cè)人工誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)可能導(dǎo)致黃顙魚從GSD轉(zhuǎn)變成了TSD。我們的研究結(jié)果與這種推測(cè)不相符。同一種魚類不同地理種群對(duì)溫度的敏感性具有較大的差異[53,54],可能是造成實(shí)驗(yàn)不同結(jié)果的原因,后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們也將關(guān)注這方面的問題,區(qū)分不同種群對(duì)于溫度處理的敏感性。在本研究中,通過對(duì)每尾實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行遺傳型性別鑒定(性別特異分子標(biāo)記)和生理型性別鑒定(組織學(xué)切片),明確在我們實(shí)驗(yàn)種群中,一定比例的XX遺傳型個(gè)體性腺發(fā)育為精巢樣結(jié)構(gòu)。并且在122日齡時(shí)可明顯觀察到高溫組(圖5B、5b)和皮質(zhì)醇組(圖5G、5g)性逆轉(zhuǎn)的XX偽雄魚具有雄性特有的生殖突,組織學(xué)顯示其具有典型精小葉和精小囊結(jié)構(gòu),精巢的精小囊內(nèi)除了有精原細(xì)胞外,還有大量的精母細(xì)胞和精子細(xì)胞。因此,我們用確切的證據(jù)證明,高溫處理能導(dǎo)致XX遺傳型個(gè)體性逆轉(zhuǎn)為生理型雄魚,并且推測(cè)XX偽雄魚可能具有生殖能力,這些XX偽雄魚生殖能力有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

在之前的報(bào)道中,經(jīng)皮質(zhì)醇(26℃)和高溫(33℃)處理XX青鳉仔魚,皮質(zhì)醇處理組中48%的XX雌性個(gè)體性逆轉(zhuǎn)為XX偽雄魚,而高溫組中只有25%雌性發(fā)生性逆轉(zhuǎn),皮質(zhì)醇處理過的青鳉仔魚皮質(zhì)醇水平明顯高溫處理組[22]。此外,用不同濃度的皮質(zhì)醇(0、100、300 mg/kg)處理Southern flounder(Paralichthys lethostigma)幼魚,性逆轉(zhuǎn)的比例具有明顯的濃度依賴性[27]。血漿中皮質(zhì)醇激素的清除依賴于結(jié)合蛋白、靶組織受體等,外源激素在體內(nèi)消除相對(duì)較慢[28,55],因此,外源皮質(zhì)醇激素比魚體內(nèi)應(yīng)激而導(dǎo)致皮質(zhì)醇激素具有更明顯的性逆轉(zhuǎn)作用,這可能是外源皮質(zhì)醇處理黃顙魚比高溫更能引起魚類雄性化的原因之一。青鳉仔魚用皮質(zhì)醇和高溫處理均可引起雌魚向雄魚的性別逆轉(zhuǎn),組織學(xué)觀察表明性逆轉(zhuǎn)的XX雄魚具有典型的精巢[21]。黃顙魚62日齡組織學(xué),高溫組和皮質(zhì)醇組性逆轉(zhuǎn)的XX偽雄魚精巢結(jié)構(gòu)仍然保留32日齡時(shí)觀察到的卵巢腔結(jié)構(gòu),說明高溫和皮質(zhì)醇處理對(duì)黃顙魚性腺分化具有持續(xù)性。在高溫和皮質(zhì)醇處理組中,62日齡時(shí)XX偽雄魚的精巢與對(duì)照組XY雄魚相比性腺較大,精巢中充滿著無明顯核仁的初級(jí)精母細(xì)胞,但細(xì)胞排列疏松,存在較多的體細(xì)胞,而此時(shí)對(duì)照組XY雄魚精巢組織充滿大量的精原細(xì)胞。122日齡時(shí),精巢中并未觀察到之前32日齡和62日齡時(shí)觀察到的卵巢腔結(jié)構(gòu)。我們對(duì)比發(fā)現(xiàn),62日齡時(shí),XX偽雄魚的卵巢腔較32日齡時(shí)明顯縮減,精巢結(jié)構(gòu)朝卵巢腔內(nèi)延展,開始出現(xiàn)黃顙魚精巢典型的分枝狀結(jié)構(gòu),這可能是122日齡時(shí)卵巢巢消失的主要原因。Kitano等[23]在早期報(bào)道中表示高溫和皮質(zhì)醇處理能使XX青鳉發(fā)生性逆轉(zhuǎn),性逆轉(zhuǎn)的XX偽雄魚精巢生殖細(xì)胞數(shù)目少于正常XY雄魚,高溫和皮質(zhì)醇誘導(dǎo)魚類雄性化,性逆轉(zhuǎn)的個(gè)體性腺細(xì)胞發(fā)育比對(duì)照組快,說明XX偽雄魚精巢發(fā)育比正常XY雄魚快,但性逆轉(zhuǎn)性腺中體細(xì)胞較多而生殖細(xì)胞較少。

3.3 個(gè)體生長(zhǎng)取決于生理型性別而非遺傳型性別

本實(shí)驗(yàn)中高溫和皮質(zhì)醇組性逆轉(zhuǎn)XX偽雄魚全長(zhǎng)高于XX雌魚和XY雄魚,表明高溫或皮質(zhì)醇誘導(dǎo)的XX偽雄魚生長(zhǎng)比正常XY雄魚快。在此之前的報(bào)道中虹鱒仔魚用皮質(zhì)醇處理,性逆轉(zhuǎn)的XX虹鱒偽雄魚的平均體重和平均性腺重明顯增加[29],在尼羅羅非魚也發(fā)現(xiàn)高溫處理XX雄魚比正常XY雄魚生長(zhǎng)快[50],說明高溫和皮質(zhì)醇的作用并不局限性腺,對(duì)魚類的生長(zhǎng)也有一定的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn),高溫處理抑制cyp19a1 mRNA表達(dá),導(dǎo)致雄激素和皮質(zhì)醇水平顯著升高[16],外源皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮激素可以轉(zhuǎn)化為雄激素[15,29],精巢分泌雄激素對(duì)魚類的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[56]。此外,皮質(zhì)醇作為一種糖皮質(zhì)激素可以直接作用于腎上腺,加強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞類固醇合成能力[57],這些可能是導(dǎo)致XX雄魚比正常XY雄魚生長(zhǎng)快的原因。另一方面,我們發(fā)現(xiàn),62日齡時(shí)XX偽雄魚精巢組織遠(yuǎn)比正常XY雄魚大(圖4),可能產(chǎn)生更多的雄激素和生長(zhǎng)激素,表明性腺大小也可能是決定同一性別個(gè)體大小的重要因素。在羅非魚的研究中發(fā)現(xiàn),性腺切除顯著抑制雌雄個(gè)體生長(zhǎng),而這種抑制作用可以通過性腺植入而獲得挽救[58],表明性腺在生長(zhǎng)中的重要作用。

魚類的性腺發(fā)育有2種類型:一種是性腺直接發(fā)育為卵巢或精巢;另一種性腺最初是雌性同體,但隨后發(fā)育為卵巢或者精巢[59]。斑馬魚屬于第二種類型,性腺最初發(fā)育為卵巢,隨后一部分個(gè)體卵巢組織退化,卵母細(xì)胞凋亡,最終發(fā)育為雄性,卵母細(xì)胞凋亡是斑馬魚卵巢-精巢轉(zhuǎn)化的重要原因[60]。本實(shí)驗(yàn)黃顙魚32日齡性腺組織學(xué)我們觀察到高溫和皮質(zhì)醇處理誘導(dǎo)了一部分XX遺傳型雌魚雄性化,一部分未發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的XX雌魚正常發(fā)育為生理型雌魚,有趣的是另一部分性逆轉(zhuǎn)的XX偽雄魚保留了原有的卵巢腔結(jié)構(gòu),內(nèi)部結(jié)構(gòu)卻是雄性生殖細(xì)胞。32日齡組織學(xué)觀察皮質(zhì)醇組未發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的個(gè)體中也觀察到卵原細(xì)胞和部分初級(jí)卵母細(xì)胞,其中有部分未發(fā)生性逆轉(zhuǎn)的XX雌魚性腺中,卵巢含有空泡化組織,細(xì)胞邊緣皺縮,無論從大小還是形狀上,似乎是卵原細(xì)胞退化而形成的,可能是退化的卵巢向精巢分化的過渡階段。在性別分化時(shí)期將青鳉仔魚暴露在高溫(33℃)下,通過提高皮質(zhì)醇水平,抑制雌性生殖細(xì)胞的增值和fshrmRNA的表達(dá),從而導(dǎo)致XX雌性發(fā)生性逆轉(zhuǎn)[22]。研究發(fā)現(xiàn),高溫導(dǎo)致雌性斑馬魚雄性化是由于抑制芳香化酶表達(dá)[19],從而誘導(dǎo)早期卵母細(xì)胞凋亡。高溫處理尼羅羅非魚性腺具有很強(qiáng)的凋亡信號(hào)[50],孵化后的青鳉暴露于高溫和皮質(zhì)醇下會(huì)抑制雌性生殖細(xì)胞的增值和cyp19ala表達(dá),此結(jié)果也在Olive flounder(Paralichthys olivaceus)[21,30]、虹鱒[29]有相應(yīng)報(bào)道。因此,抑制雌性性別分化相關(guān)通路,抑制原始生殖細(xì)胞發(fā)育或誘導(dǎo)其凋亡,在應(yīng)激條件誘導(dǎo)雄性化過程中起關(guān)鍵作用。

本實(shí)驗(yàn)主要研究高溫和皮質(zhì)醇處理對(duì)黃顙魚性別分化的影響,研究表明高溫和皮質(zhì)醇處理通過抑制卵母細(xì)胞發(fā)育,導(dǎo)致性腺細(xì)胞發(fā)生凋亡,啟動(dòng)精巢發(fā)育通路,從而誘導(dǎo)XX遺傳型個(gè)體雄性化。XX遺傳型個(gè)體受到高溫處理后,一部分個(gè)體性腺發(fā)育進(jìn)程加快,一部分個(gè)體原始生殖細(xì)胞受到抑制甚至凋亡繼而發(fā)育成生理型雄魚,它們之間的遺傳差異值得我們進(jìn)一步研究。環(huán)境友好型應(yīng)激條件(如高溫、高密度等)誘導(dǎo)魚類雄性化的研究,將為建立魚類環(huán)境友好型單性種群生產(chǎn)提供重要的理論與生產(chǎn)實(shí)踐意義。