賈春英 張榮明

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院燒傷整形外科（遼寧錦州121000）

瘢痕疙瘩，又稱病理性瘢痕，是由于個(gè)體皮膚損傷后的膠原異常積聚所致，主要與成纖維細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積有關(guān)，瘢痕疙瘩臨床表現(xiàn)為皮膚表面的結(jié)痂與斑塊，顏色呈鮮紅或淡紫，自覺瘙癢與刺痛等［1-3］。研究表明瘢痕疙瘩的形成與多種復(fù)雜因素相關(guān)，如細(xì)胞因子、炎癥因子和基因調(diào)控等［4-5］。近年來，瘢痕疙瘩的形成機(jī)制與調(diào)控機(jī)理已成為目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，瘢痕疙瘩的治療難題亟需突破［6］。

lncRNA 全稱長鏈非編碼RNA，是一種長度超過200nt 的非編碼RNA。相比編碼RNA，lncRNA具有更強(qiáng)的細(xì)胞特異性和組織特異性，并且lncRNA 在不同組織細(xì)胞中的表達(dá)水平存在差異，同時(shí)對細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和代謝等過程產(chǎn)生顯著影響［7］。研究表明lncRNAs 在瘢痕疙瘩組織和細(xì)胞中異常表達(dá)，并對瘢痕疙瘩中機(jī)理形成起著重要作用［8-9］。lncRNA CACNA1G-AS1 在瘢痕疙瘩中通過調(diào)控鈣通道蛋白CACNA1G 參與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移過程［10］。lncRNA ATB 通過調(diào)控EMT 參與瘢痕疙瘩的形成與發(fā)展［11］。

DBH-AS1是一種長度約為2 kb，從9q34染色體轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA［12］。研究表明lncRNA DBH-AS1在骨肉瘤、肝癌等疾病中均發(fā)揮重要作用［13-14］。據(jù)報(bào)道DBH-AS1 在肝癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，過表達(dá)DBH-AS1 通過激活肝癌中的MAPK 信號通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活［15］。然而DBH-AS1 在瘢痕疙瘩中的作用及機(jī)制尚未完全闡明。因此本研究采用qRT-PCR 檢測瘢痕疙瘩和正常皮膚組織中DBHAS1 的表達(dá)水平，并深入探討DBH-AS1 調(diào)控miR-138/HIF-1α通路在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的作用，以驗(yàn)證lncRNA-DBH-AS1/miR-138/HIF-1α軸對瘢痕疙瘩形成的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本選擇2018 年3 月至2019 年10 月在我院接受瘢痕疙瘩治療患者作為研究對象，共50 例，其中男31 例，女19 例，平均年齡（31.2 ±10.6）歲，所有患者在術(shù)前均未接受手術(shù)、化療、放療或生物治療等，并且排除其他腫瘤及重大疾病的可能。在術(shù)中瘢痕疙瘩和少量周圍正常皮膚組織。所有組織標(biāo)本分成相同大小在30 min 內(nèi)液氮速凍，并在入-80 ℃冰箱內(nèi)保存。所有患者均在簽署知情書的條件下自愿參與本研究。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞采購于中國科學(xué)院北京細(xì)胞庫，在37 ℃、5%CO2平衡濕度培養(yǎng)箱環(huán)境中采用含10%胎牛血清的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，參考lipofectamine 2000 試劑說明書轉(zhuǎn)染新增si-NL、LV-NC、si-DBH-AS1、LV-DBHAS1、miR-138 mimics、miR-138 inhibitors、si-HIF-1α和LV-HIF-1α，轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR按照Trizol試劑盒步驟提取瘢痕疙瘩組織和細(xì)胞中總RNA。使用分光光度儀計(jì)量RNA 水平。以β-actin 為內(nèi)參通過260 nm 和280 nm吸光度，qRT-PCR 按照SYBR Green 試劑盒說明書進(jìn)行反應(yīng)體系的配制，通過Prime ScriptTMRT 試劑盒檢測RNA 的濃度，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以β-actin 為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法進(jìn)行相對表達(dá)量分析。

1.2.3 流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡檢測取對數(shù)生長期的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h 后接種到密度為3 × 105個(gè)/孔的6 孔板中，經(jīng)預(yù)冷的70%乙醇處理后，置于4 ℃溫度條件下過夜。加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL 碘化丙啶染色液（0.25 mg/mL），輕輕混勻，室溫避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告將野生型（WT）或突變型（MUT）DBH-AS1 克隆到pmirGLO 質(zhì)粒受體中，同時(shí)將miR-138 mimics 或miR-138 inhibitors 導(dǎo)入293細(xì)胞中，共培養(yǎng)48 h 后采用雙熒光素酶受體分析系統(tǒng)測量雙熒光素活性。

1.2.5 Westrn blot 法收集轉(zhuǎn)染24 h 后的細(xì)胞，常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，SDS-PAGE 凝膠每孔加入40 μg 的待測蛋白，110 V電泳，250 mA 電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，分別加入HIF-1α、caspase-7 和β-actin 一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3×10 min，二抗37 ℃孵育1 h，TBST 洗膜3 × 30 min，ECL 顯影。運(yùn)用Quantity one 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作內(nèi)參，計(jì)算相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DBH-AS1在瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平QRT-PCR結(jié)果顯示DBH-AS1在瘢痕疙瘩組織和成纖維細(xì)胞中明顯高于正常組織和正常成纖維細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染si-DBH-AS1 和LV-DBH-AS1 分別下調(diào)和上調(diào)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的DBH-AS1 表達(dá)水平，見圖1。

2.2 低表達(dá)與過表達(dá)DBH-AS1 對成纖維細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-NC 和si-DBH-AS1 的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡率分別為（6±1.2）%和（17±2.7）%，轉(zhuǎn)染si-DBH-AS1 明顯下調(diào)細(xì)胞中caspase-7 mRNA和蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而轉(zhuǎn)染LV-NC 和LV-DBHAS 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡率分別為（5 ± 0.9）%和（1 ± 0.5）%，過表達(dá)DBH-AS 顯著上調(diào)caspase-7 mRNA和蛋白水平，見圖2。

圖1 DBH-AS1 在瘢痕疙瘩組織和瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.1 DBH-AS1 relative expression level in keloid tissues and keloid fibroblasts

圖2 低表達(dá)與過表達(dá)DBH-AS1 對成纖維細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of low expression and overexpression of DBH-AS1 on apoptosis of fibroblasts

2.3 DBH-AS1能夠靶向結(jié)合miR-138雙熒光素酶報(bào)告顯示DBH-AS1 能作為海綿靶向結(jié)合miR-138，DBH-AS1 野生組轉(zhuǎn)染miR-138 mimics 后，雙熒光素活性顯著下調(diào)，而DBH-AS1 突變組無明顯變化。QRT-PCR 結(jié)果顯示miR-138 在瘢痕疙瘩組織和成纖維細(xì)胞均低于正常組織和正常成纖維細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染si-NC 和si-DBHAS1 的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-138 相對表達(dá)量分別為（1.0±0.2）和（1.7±0.3），而轉(zhuǎn)染LV-NC和LV-DBH-AS1的miR-138相對表達(dá)量為（0.9±0.2）和（0.3±0.2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 DBH-AS1 能夠靶向結(jié)合miR-138Fig.3 DBH-AS1 serves as a sponge of miR-138

2.4 過表達(dá)與低表達(dá)miR-138 對成纖維細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-NC 和miR-138 mimics 的細(xì)胞凋亡率分別為（7 ± 0.5）%和（19 ± 0.8）%，而轉(zhuǎn)染miR-NC 和miR-138 inhibitors 的細(xì)胞凋亡率分別為（15 ± 0.7）%和（6 ± 0.4）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。過表達(dá)和敲低miR-138 也會(huì)顯著上調(diào)或降低caspase-7 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平，見圖4。

2.5 miR-138 能夠靶向結(jié)合HIF-1α雙熒光素酶報(bào)告顯示miR-138 能夠靶向調(diào)控HIF-1α，HIF-1α野生組轉(zhuǎn)染miR-138 mimics 后，雙熒光酶活性顯著低于轉(zhuǎn)染miR-NC 組，然而HIF-1α突變組無明顯差異。HIF-1α在疤痕疙瘩組織和正常組織中相對表達(dá)量分別為（1.0±0.2）和（2.1±0.8），轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-138 mimic 和miR-138 inhibitors 后，成纖維細(xì)胞中HIF-1α相對表達(dá)量分別為（1.0 ± 0.1）、（0.4 ±0.1）和（1.6 ± 0.2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖5。

2.6 DBH-AS1調(diào)控miR-138/HIF-1α通路參與細(xì)胞凋亡的影響回復(fù)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-138 inhibitors能夠逆轉(zhuǎn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染si-DBH-AS1 對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響，卻能夠進(jìn)一步加強(qiáng)單獨(dú)轉(zhuǎn)染LVDBH-AS1 對成纖維細(xì)胞凋亡的影響（P＜0.05）。而轉(zhuǎn)染si-HIF-1α能夠逆轉(zhuǎn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-138 inhibitors 對成纖維細(xì)胞凋亡的影響，卻進(jìn)一步加強(qiáng)單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-138 mimic 對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的作用（P＜0.05），見圖6。

3 討論

瘢痕疙瘩是一種病理性皮膚疾病，輕則影響皮膚外觀，重則導(dǎo)致畸形，出現(xiàn)各種皮膚功能性癥狀，然而疤痕疙瘩的形成機(jī)制尚不清楚［16-18］。研究表明大量lncRNA 在瘢痕疙瘩組織中均存在異常表達(dá)，然而lncRNA 在瘢痕疙瘩的研究還遠(yuǎn)未深入［19-21］。本研究中DBH-AS1 在瘢痕疙瘩組織和成纖維細(xì)胞中都明顯上調(diào)，敲低DBH-AS1 能促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡，然而高表達(dá)DBH-AS1 顯著抑制細(xì)胞凋亡。這提示DBH-AS1 通過調(diào)控成纖維細(xì)胞凋亡參與瘢痕疙瘩的發(fā)生和進(jìn)展，其具體機(jī)理需進(jìn)一步探討。

miRNA 是一種長度僅有20～24 nt的微型RNA，生物體內(nèi)的miRNA 數(shù)量占RNA 總數(shù)的比例不足1.0%，但機(jī)體內(nèi)30%～50%的基因表達(dá)均與miRNA有關(guān)。研究表明miR-194-3p、miR-199a-5p、miR-29a和miR-1224-5p等miRNA在瘢痕疙瘩組織中存在異常表達(dá)［22-24］。JIE 等［14］的研究成果顯示LncRNA DBH-AS1 能靶向結(jié)合miR-138 參與肝細(xì)胞癌的腫瘤形成過程。本研究中，雙熒光素酶結(jié)果顯示DBH-AS1 能夠靶向結(jié)合miR-138，過表達(dá)miR-138促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡，而沉默miR-138 抑制細(xì)胞凋亡，這提示DBH-AS1 通過靶向結(jié)合miR-138 調(diào)控成纖維細(xì)胞凋亡。

圖4 過表達(dá)與低表達(dá)miR-138 對成纖維細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of overexpression and low expression of miR-138 on apoptosis of fibroblast cells

圖5 miR-138 能夠靶向結(jié)合HIF-1αFig.5 miR-138 can directly target HIF-1α

圖6 DBH-AS1 調(diào)控miR-138/HIF-1α通路參與細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 DBH-AS1 participates in the effect of apoptosis by regulating the miR-138/HIF-1α pathway

HIF-1α是一種缺氧誘導(dǎo)因子-1α，葉飛輪等［25］發(fā)現(xiàn)HIF-1α可通過影響血管新生、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡參與瘢痕疙瘩的形成。本研究中，雙熒光素酶結(jié)果顯示miR-138 能夠靶向結(jié)合HIF-1α，證實(shí)miR-138 能特異性靶向結(jié)合HIF-1α，HIF-1α在瘢痕疙瘩組織中的相對含量明顯高于正常皮膚組織，這說明miR-138 靶向結(jié)合HIF-1α參與成纖維細(xì)胞凋亡進(jìn)程。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)lncRNA DBHAS1 能夠通過調(diào)控miR-138/HIF-1α信號通路參與成纖維細(xì)胞凋亡。

本研究首次發(fā)現(xiàn)lncRNA DBH-AS1可作為miR-138 海綿調(diào)控HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而參與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡，但僅考慮了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，還缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。因此，LncRNA DBH-AS1 能否應(yīng)用疤痕疙瘩的臨床治療還有待進(jìn)一步驗(yàn)證，但可為瘢痕疙瘩治療提供了新思路和新選擇。