高紅紅 任麗君 馬豪莉 王利 侯會娟 司馬盼盼 謝驊 宋瑞捧

河南省直第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科（鄭州450002）

2 型糖尿病（T2DM）是一種以胰腺β細(xì)胞功能減退為特征的進(jìn)行性疾病，同時伴隨胰島素抵抗，最終導(dǎo)致血糖控制失?。?］。對于既往口服抗糖尿病藥物（OAD）血糖控制不佳的2 型糖尿病患者，LEAD-2、LEAD-4 研究結(jié)果表明采用利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍方案治療，可以顯著降低患者餐后血糖（FPG）和糖化血紅蛋白（HbA1c）［2-3］。

單核苷酸多態(tài)性（SNP）是人類遺傳變異的主要類型。全基因組關(guān)聯(lián)研究已鑒定出400 多種單核苷酸多態(tài)性與2 型糖尿病和/或嚴(yán)重合并癥如心血管疾病、高血壓、視網(wǎng)膜病變、腎病和糖尿病足等相關(guān)［4］。比如最近研究發(fā)現(xiàn)，SCN5A 基因多態(tài)性與糖尿病心臟病變患者左室功能間具有相關(guān)性［5］。

沉默信息調(diào)節(jié)因子2 相關(guān)酶1（SIRT1）基因是酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Sir2）的同源基因，Rs12778366 單核苷酸多態(tài)性位點位于第10 號染色體（10q21.3）SIRT1 轉(zhuǎn)錄起始位點上游1.3 kb 處，編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）-依賴性去乙?；傅鞍祝?］。該蛋白與胰腺發(fā)育、胰島細(xì)胞分化和胰島素合成相關(guān)，并參與肝臟代謝和糖異生的調(diào)節(jié)［7-8］。在多種疾病中發(fā)現(xiàn)了SIRT1 水平失調(diào)，如2 型糖尿病、糖尿病足、乳腺癌及急性冠脈綜合征等［9］。研究發(fā)現(xiàn)，Rs12778366 的C 等位基因攜帶者的糖耐量升高，且Rs12778366 單核苷酸多態(tài)性（SNP）的C 等位基因不僅與2 型糖尿病風(fēng)險呈正相關(guān)，而且與2 型糖尿病以及糖尿病足易感性之間具有相關(guān)性［9-11］。SIRT1 基因Rs12778366位點對利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍治療既往血糖控制不佳的2 型糖尿病療效尚未明確。因此本研究目的是探討SIRT1 基因多態(tài)性對血糖控制不佳的2 型糖尿病患者接受利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍治療臨床療效的影響，以期為糖尿病治療提供一定的臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象本研究為回顧性分析，納入2016年5 月至2019 年5 月在河南省直第三人民醫(yī)院內(nèi)分泌科接受2 型糖尿病治療的血糖控制不佳患者為研究對象。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18 周歲；（2）診斷為2 型糖尿??；（3）單用二甲雙胍或磺脲類藥物最大可耐受劑量治療后仍然控制不佳患者（使用二甲雙胍、格列美脲等磺脲類藥物至少90 d）；（4）患者空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L 或餐后2 小時血糖（2 h PG）≥11.1 mmol/L，糖化血紅蛋白（HbA1c）7.0% ～11.0%。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有嚴(yán)重胃腸道疾?。ㄈ缪仔阅c病或胃輕癱）患者；（2）胰島素水平嚴(yán)重減低的2 型糖尿病患者（例如體重急劇減輕、血糖控制不佳，尤其是存在酮癥的患者）；（3）有甲狀腺髓樣癌既往史或家族史患者以及2 型多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合癥患者。最終符合入排標(biāo)準(zhǔn)病例組患者216 例。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，每個入組患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 治療方法所有入組的2 型糖尿病患者均采用利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍方案進(jìn)行糖尿病治療，治療26周后評價患者的療效，治療期間記錄不良反應(yīng)情況進(jìn)行安全性評價。用法用量：利拉魯肽（諾和諾德（中國）制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20160037，規(guī)格為3 mL：18 mg）皮下注射，初始劑量每天0.6 mg/次，1 周后劑量增加至1.2 mg 或1.8 mg（根據(jù)患者血糖和尿糖調(diào)整用量，最大劑量不超過1.8 mg/d）。鹽酸二甲雙胍緩釋片，進(jìn)食時或餐后口服，每次1 g，每天2 次。

1.3 DNA 提取及基因分型抽取患者外周靜脈血5 mL，使用全血DNA 提取試劑盒從全血中提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。在Applied Biosystems 7900上按照TaqMan?試劑盒C_1340370_10 說明書對SIRT1 多態(tài)性基因Rs12778366 進(jìn)行分型。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測SIRT1 mRNA表達(dá)收集患者新鮮外周血，獲取新鮮外周血單核細(xì)胞標(biāo)本（PBMC）。用Trizol從PBMC中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后在Applied Biosystems 7900上使用SYBR 進(jìn)行qPCR 評估SIRT1 mRNA 的相對表達(dá)。GAPDH 作為內(nèi)參。采用2-△△Ct進(jìn)行相對定量分析，試驗重復(fù)3 次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用哈迪溫伯格平衡（HWE）檢驗SIRT1 多態(tài)性的基因型分布。在基線臨床資料當(dāng)中，離散型變量和Rs12778366 位點不同基因型的分布采用χ2檢驗，當(dāng)數(shù)據(jù)較少時用Fisher 精確檢驗。連續(xù)型變量和Rs12778366 位點不同基因型的分析用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者基線臨床資料本研究共納入216例既往血糖控制不佳的2 型糖尿病患者，基線資料見表1。患者年齡范圍32 ～65 歲，中位年齡48 歲，其中女99 例（45.83%），男117 例（54.17%）。體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（28.23 ±1.40）kg/m2，空腹血糖（FPG）水平（11.1 ± 0.8）mmol/L，餐后2 h 血糖（2 h PG）為（14.5 ± 1.3）mmol/L，糖化血紅蛋白水平為（9.3±0.6）%。

Rs12778366位點的基因分型結(jié)果：TT型155例（71.76%），TC型56例（25.93%），CC型5例（2.31%），最小等位基因頻率為0.153，三種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.983）。由于CC 型的患者數(shù)較少，在后期分析中將TC 和CC 基因型患者合并。Rs12778366 位點不同基因型患者基線臨床資料基本平衡，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍治療血糖控制不佳的2 型糖尿病患者的臨床療效及Rs12778366 不同基因型對治療效果的影響治療26 周后對216 例患者進(jìn)行療效評價?；颊呖崭寡牵‵PG）、餐后2 h血糖（2 h PG）、體重指數(shù)（BMI）及糖化血紅蛋白（HbA1c）分別為：（5.5±0.6）mmol/L、（9.5±1.2）mmol/L、（26.3 ± 0.8）kg/m2、（7.2 ± 0.3）%，與治療前相比均明顯下降，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療后不同基因型的患者各指標(biāo)與治療前相比均明顯下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療后TC/CC 基因型患者的BMI、FPG、2 h PG 和HbA1c 指標(biāo)與TT 基因型患者相比，各指標(biāo)下降更為明顯，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 病例組的基線臨床資料Tab.1 Baseline clinical characteristics of case group±s

表1 病例組的基線臨床資料Tab.1 Baseline clinical characteristics of case group±s

注：BMI，體質(zhì)量指數(shù)；FPG，空腹血糖；2 h PG，餐后2 h 血糖；HbA1c，糖化血紅蛋白

指標(biāo)年齡（歲）性別［例（%）］男女BMI（kg/m2）FPG（mmol/L）2 h PG（mmol/L）HbA1c（%）總體（n=216）48 117（54.17）99（45.83）28.2±1.1 11.1±0.8 14.5±1.3 9.1±0.6 SIRT1 Rs12778366 TT（n=155）49 86（55.48）69（44.52）28.3±1.2 11.2±0.7 14.5±1.2 9.2±0.7 TC/CC（n=61）48 33（54.09）28（45.91）28.2±1.0 11.1±0.9 14.4±1.1 9.1±1.0 P值0.820 0.854 0.565 0.386 0.573 0.407

表2 Rs12778366 不同基因型對治療效果的影響Tab.2 The influence of Rs12778366 genotypes on the therapeutic effect±s

表2 Rs12778366 不同基因型對治療效果的影響Tab.2 The influence of Rs12778366 genotypes on the therapeutic effect±s

注：*P，26 周后TT 基因攜帶者與TC/CC 基因攜帶者各指標(biāo)之間比較

指標(biāo)BMI（kg/m2）FPG（mmol/L）2 h PG（mmol/L）HbA1c（%）治療前28.2±1.1 11.1±0.8 14.5±1.3 9.1±0.6 26周后26.3±0.8 5.5±0.6 9.5±1.2 7.2±0.3 26周后（SIRT1 Rs12778366）TT（n=155）26.7±0.7 5.8±0.4 9.8±1.1 7.5±0.4 TC/CC（n=61）26.2±0.9 5.4±0.7 9.4±1.0 6.8±0.5*P值＜0.001＜0.001 0.014＜0.001

2.3 SIRT1 基因多態(tài)性位點對SIRT1 基因mRNA表達(dá)的影響提取患者PBMC（由于PBMC 標(biāo)本比較難獲取，標(biāo)本數(shù)少于樣本數(shù)）總RNA，測定各基因型SIRT1 mRNA 的表達(dá)情況。最終提取145 例，TT 型104 例，TC 型36 例，CC 型5 例，三種基因型分布頻率符合哈迪溫伯格平衡（P=0.400）。CC 型患者數(shù)相對較少，因此將其與TC 型患者合并分析。結(jié)果如圖1 所示，TC/CC 型患者的mRNA 表達(dá)水平相對于TT 型患者明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

2.4 SIRT1 基因多態(tài)性位點不同基因型患者的不良反應(yīng)情況采用利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍治療時，不良反應(yīng)主要有惡心（23.6%）、腹瀉（13.9%）、嘔吐（7.4%）、頭痛（4.6%），在整個治療過程中僅有2 例患者發(fā)生了低血糖事件。SIRT1 Rs12778366位點不同基因型各不良反應(yīng)發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

圖1 不同基因型患者外周血單核細(xì)胞中SIRT1 基因mRNA 相對表達(dá)情況Fig.1 Relative expression of SIRT1mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with different genotypes

表3 各基因型患者不良反應(yīng)的發(fā)生率比較Tab.3 Comparison of adverse reactions among patients with different genotypes例（%）

3 討論

二甲雙胍可以降低糖尿病的相關(guān)并發(fā)癥和死亡風(fēng)險［12］，但是對于部分患者血糖控制作用有限，因此對于血糖控制不佳的2 型糖尿病患者臨床上可以采用利拉魯肽與二甲雙胍或磺脲類藥物聯(lián)合應(yīng)用。利拉魯肽通過直接激活胰島β細(xì)胞上的相關(guān)肽，促進(jìn)胰島素的分泌和合成，延長患者胃排空時間，控制患者食欲，抑制胰高血糖素分泌，作用于p-AMPKα/NOX2/JNK1/2 信號通路抑制β-細(xì)胞凋亡等機制來降低血糖水平［13］。除此之外，利拉魯肽在對2 型糖尿病患者進(jìn)行治療過程中可以作用于線粒體ATP-鉀等離子通道，減輕血管損傷，對抗動脈粥樣硬化，對心血管起保護(hù)作用，而且不易引起低血糖，還能降低患者體質(zhì)量［14］。

Sirtuins 是Sir2 的同源物，哺乳動物擁有7 個Sirtuins（SIRT 1-7），不同的成員具有不同的功能，其中研究最多的是SIRT1［15］。SIRT1 通過對各種靶標(biāo)如FOXO（叉頭轉(zhuǎn)錄因子）、PPARγ（過氧化物酶體增殖物激活受體γ）、AMPK（AMP 激活蛋白激酶）、p53 等的調(diào)控參與到許多慢性疾病中［16］。SIRT1 具有8 個基因多態(tài)性位點，其中Rs12778366位點與垂體腺瘤的復(fù)發(fā)性、侵襲性及活動性有關(guān)［17］，且Rs12778366 增加IL-6 相關(guān)的患者病死率，TC/CC攜帶者的病死率高于TT 攜帶者［18］。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)Rs12778366 位點與胰島素抵抗及炎癥等相關(guān)［9］。許多研究表明，基因多態(tài)性對糖尿病藥物治療的有效性有著比較重要的影響作用。因此本研究目的是探索SIRT1 基因多態(tài)性對于血糖控制不佳的2 型糖尿病患者采用利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍治療的臨床療效的影響。

本研究共納入216例既往血糖控制不佳的2型糖尿病患者接受利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍進(jìn)行治療，對SIRT1 基因Rs12778366 不同基因型與患者療效進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。研究發(fā)現(xiàn)，在接受利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍治療26 周后，各項指標(biāo)與治療前相比，各基因組均明顯下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中發(fā)現(xiàn)，TC/CC 型的患者HbA1c、FPG、BMI、2 h PG 指標(biāo)與TT 型的患者相比，各項指標(biāo)下降的更為明顯，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。也就是說攜帶C 等位基因的TC/CC 基因型的患者與TT 型患者相比具有更好的控制血糖的療效。這與FIGARSKA等［10］的研究一致，Rs12778366 C 等位基因攜帶者葡萄糖耐量更高。研究還發(fā)現(xiàn)Rs12778366 TT型患者具有更高的糖尿病風(fēng)險，且會影響SIRT1 mRNA的表達(dá)水平［19］。本研究對145 例患者PBMC 標(biāo)本SIRT1 基因mRNA 表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，TC/CC 型患者SIRT1 mRNA 表達(dá)水平要顯著高于TT 型患者。研究表明SIRT1 缺乏癥小鼠的活性氧產(chǎn)生增加，mTORC2 信號傳導(dǎo)受損而導(dǎo)致胰島素抵抗［6］。因此推測C 等位基因可能對糖尿病患者具有一定的保護(hù)作用，且SIRT1 基因Rs12778366 位點可能通過影響SIRT1 基因mRNA 的表達(dá)，從而改變胰島素抵抗的狀態(tài)，隨著代謝增加減輕患者體質(zhì)量，從而影響利拉魯肽聯(lián)合二甲雙胍對既往血糖控制不佳的2 型糖尿病患者的臨床療效。

安全性方面，與利拉魯肽和二甲雙胍之前報道一致，未出現(xiàn)新的不良事件。惡心嘔吐及腹瀉大部分為輕中度，且呈劑量依賴性。大部分最初出現(xiàn)惡心嘔吐癥狀患者在繼續(xù)治療的情況下，這些癥狀的發(fā)生頻率和嚴(yán)重程度均有所降低，呈一過性，未出現(xiàn)惡心嘔吐導(dǎo)致治療停止。本研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1 Rs12778366 位點不同基因型患者之間不良反應(yīng)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

在過去15 年間，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種與2 型糖尿病相關(guān)的基因組位點和變異體以及潛在的生物標(biāo)志物，從而更深入地了解2 型糖尿病病理生理特征［15］。STIR1 進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)大腦中SIRT1 與肥胖、2 型糖尿病及晝夜節(jié)律是同步的，且SIRT1 是糖尿病引起心肌缺血再灌注（MI/R）損傷的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，SIRT1 的過表達(dá)可以通過調(diào)節(jié)糖尿病條件下的一氧化氮合成酶活性來抑制氧化減少MI/R 損傷［20-21］。SIRT1 因此有望成為糖尿病新型治療靶標(biāo)。本研究對2 型糖尿病患者的基因型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SIRT1 Rs12778366 位點可能直接或間接與2 型糖尿病的遺傳易感性相關(guān)，而且還可能通過影響SIRT1 mRNA 的表達(dá)影響利拉魯肽和二甲雙胍對既往血糖控制不佳2 型糖尿病患者臨床療效。本研究只納入了本院接受治療的患者，大多是本地居住居民，遺傳學(xué)特征單一，且樣本量偏小，后期未進(jìn)行長期患者隨訪，試驗結(jié)果可能存在一定局限性，但為進(jìn)一步研究STIR1 Rs12778366 多態(tài)性位點對2 型糖尿病治療的臨床效果的影響提供基礎(chǔ)，為未來STIR1 成為糖尿病新型治療靶點提供一定的理論依據(jù)。