楊文博 許振丹 耿帥

新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院1泌尿外二科，2風(fēng)濕免疫科，3麻醉手術(shù)部（河南新鄉(xiāng)453000）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是人類最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國膀胱癌年新增病例數(shù)約8 萬例，死亡病例達(dá)3.3 萬例［1］。盡管尿道或膀胱切除術(shù)、術(shù)后膀胱內(nèi)輔助化療降低了膀胱癌復(fù)發(fā)率，但BC 患者預(yù)后仍較差。因此，了解膀胱癌進(jìn)展涉及的分子機(jī)制、開發(fā)新的治療策略以改善膀胱癌患者臨床結(jié)局顯得十分迫切。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度大于200 個(gè)核苷酸的非蛋白編碼RNA 轉(zhuǎn)錄本，其通過與微小RNA（miRNAs）、mRNA和蛋白相互作用發(fā)揮生理功能［2］。異常表達(dá)的lncRNA 可作為癌基因或抑癌基因，參與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移［3-4］。近期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA長基因間非蛋白編碼RNA 00689（LINC00689）高表達(dá)與膠質(zhì)瘤大小、分級、患者預(yù)后密切相關(guān)，敲減LINC00689 明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和糖酵解，抑制體內(nèi)腫瘤生長［5］。序列分析發(fā)現(xiàn)，LINC00689 對miR-876-5p 具有潛在靶向調(diào)控作用。miR-876-5p 已被證實(shí)在乳腺癌、肝癌、肺癌等惡性腫瘤中表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［6-8］。然而，LINC00689、miR-876-5p在膀胱癌中作用知之甚少。本研究通過檢測膀胱癌組織中LINC00689、miR-876-5p表達(dá)水平，分析二者在膀胱癌細(xì)胞T24增殖和凋亡中的作用，驗(yàn)證LINC00689 對miR-876-5p調(diào)控作用，以期為膀胱癌治療提供候選靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑膀胱癌細(xì)胞T24、正常膀胱上皮細(xì)胞SV-HUC-1 購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心；Rever Tra Ace qPCR 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TOYOBO 公司；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Gene Copoeia 公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ購于日本Takara 公司；小干擾RNA（si-RNA）、過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-RNA）、miRNA 模擬物（mimics）、miRNA 抑制物（anti-miRNA）以及各組陰性對照、雙熒光素酶報(bào)告載體購自廣州銳博生物公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購自上海研謹(jǐn)生物科技公司；膜聯(lián)蛋白V 異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒購于上海翊圣生物公司；兔源磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）、p21、B 細(xì)胞淋巴瘤（Bcl-2）、Bc 相關(guān)X蛋白（Bax）一抗以及羊抗兔IgG 二抗購于上海賽信通生物公司。

1.2 組織來源選取2015 年5 月至2018 年1 月于我院行手術(shù)切除的39 例膀胱癌患者的癌組織病理標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本（距離腫瘤邊緣＞3 cm 的正常膀胱黏膜組織），其中男29 例，女10 例，年齡40 ～75 歲，平均61.5 歲。所有患者術(shù)前未接受放療或化療等輔助治療。術(shù)中切除的癌組織、癌旁組織置于-80 ℃液氮中儲存。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，所有患者均知情同意。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析LINC00689和miR-876-5p表達(dá)TRIzol試劑提取膀胱癌組織、癌旁組織中總RNA，Nanodrop 2000 測量RNA 濃度。對于lncRNA檢測使用ReverTra Ace qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。對于miRNA 檢測使用miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ進(jìn)行RT-qPCR。LINC00689引物（上游：5′-GCTCACTGCAACCTCTGTCT-3′，下游5′-CACCAGGAACATCCAGGACC-3′）；GAPDH 引物（上游：5′-GGGTCTTATGACCACTGTCC-3′；下游5′-GTAAGCT TCCCATTCAGCTCAG-3′）；miR-876-5p 引物（上游5′-TGAAGTGCTGTGGATTTCTTTGTG-3′，下游5′-TGAATTACTTTGTAAACCACCACCA-3′）；U6 引物（上游5′-GACGAATACCGGCGTGAGAA-3′，下游5′-AAATTCTGTTTGCGGTGCGT-3′）。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組T24細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青鏈霉素）置于37 ℃、5%的CO2的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞80%融合時(shí)加入胰酶消化傳代。將對數(shù)期T24細(xì)胞接種6孔板，利用Lipofectamine 3000試劑將si-NC、si-LINC00689、miR-NC、miR-876-5p mimics 分別轉(zhuǎn)染50%融合細(xì)胞，依次命名為si-NC 組、si-LINC00689 組、miR-NC組、miR-876-5p組。轉(zhuǎn)染48 h后按照上述RT-qPCR方法檢測轉(zhuǎn)染效果，隨后進(jìn)行功能分析。為證實(shí)LINC00689 是通過靶向調(diào)控miR-876-5p 發(fā)揮作用，將si-LINC00689 分別與anti-miR-NC、anti-miR-876-5p共轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞，依次命名為si-LINC00689+antimiR-NC 組、si-LINC00689+anti-miR-876-5p 組，轉(zhuǎn)染48 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)使用Lipofectamine2000將WT-LINC00689、MUT-LINC00689 與miR-876-5p或miR-NC 共轉(zhuǎn)染到T24 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后收獲細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。并將pcDNA、pcDNA-LINC00689、si-NC、si-LINC00689 分別轉(zhuǎn)染T24 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后收獲細(xì)胞，RT-qPCR 檢測miR-876-5p 表達(dá)水平。

1.6 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖活力將各轉(zhuǎn)染組

T24 細(xì)胞接種到96 孔板，培養(yǎng)箱中孵育48 h，每個(gè)孔中加入10 μL CCK-8 試劑，并在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。然后，用酶標(biāo)儀在450 nm 的波長處測量每個(gè)孔的吸光度（OD）以表示細(xì)胞活力。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡胰蛋白酶化各轉(zhuǎn)染組T24 細(xì)胞，用Annexin V 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，按照凋亡檢測試劑盒步驟用FITC Annexin V 和PI進(jìn)行雙染色。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡比例。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印記（Western blot）檢測CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，二喹啉甲酸試劑盒對蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。以GAPDH抗體（1∶2 000）作為對照，加入特異性一抗溶液（均為1∶1 000）4 ℃下孵育膜過夜，然后與對應(yīng)二抗（1∶2 500）室溫孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光顯色，ImageJ 軟件分析目的蛋白相對表達(dá)量（目的蛋白與GAPDH 條帶灰度值比值）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，獨(dú)立重復(fù)3 次。采用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00689和miR-876-5p在膀胱癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)膀胱癌組織中LINC00689表達(dá)較癌旁組織顯著升高，miR-876-5p表達(dá)較癌旁組織顯著降低（P＜0.05），見圖1A、1B。T24 細(xì)胞中LINC00689表達(dá)較SV-HUC-1 細(xì)胞顯著升高，miR-876-5p 表達(dá)較SV-HUC-1細(xì)胞顯著降低（P＜0.05），見圖1C、1D。

2.2 抑制LINC00689 表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞增殖的影響與si-NC組比較，si-LINC00689組T24細(xì)胞LINC00689表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞活力、CyclinD1蛋白表達(dá)量顯著降低，p21 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。見表1、圖2。

2.3 抑制LINC00689 表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞凋亡的影響與si-NC 組比較，si-LINC00689 組T24 細(xì)胞凋亡率、Bax 蛋白表達(dá)量顯著升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。見表2、圖3。

圖1 LINC00689 和miR-876-5p 在膀胱癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of LINC00689 and miR-876-5p in bladder cancer tissues and cells

表1 抑制LINC00689 表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effect of inhibition of LINC00689 expression on proliferation of T24 cells in bladder cancer ±s

表1 抑制LINC00689 表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞增殖的影響Tab.1 Effect of inhibition of LINC00689 expression on proliferation of T24 cells in bladder cancer ±s

注：與si-NC 比較，*P ＜0.05

分組si-NC si-LINC00689 t值P值LINC00689 1.00±0.08 0.53±0.04*15.764＜0.001 OD值（450 nm）0.69±0.05 0.34±0.03*18.007＜0.001 CyclinD1蛋白0.71±0.05 0.31±0.03*20.580＜0.001 p21蛋白0.23±0.02 0.66±0.05*23.955＜0.001

圖2 抑制LINC00689 表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of inhibition of LINC00689 on expression of proliferation-related proteins in bladder cancer T24 cells

表2 抑制LINC00689 表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞凋亡的影響Tab.2 Effect of inhibition of LINC00689 expression on apoptosis of T24 cells in bladder cancer±s

表2 抑制LINC00689 表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞凋亡的影響Tab.2 Effect of inhibition of LINC00689 expression on apoptosis of T24 cells in bladder cancer±s

注：與si-NC 比較，*P ＜0.05

分組si-NC si-LINC00689 t 值P 值凋亡率（%）7.67±0.46 21.34±2.05*19.519＜0.001 Bcl-2 蛋白0.82±0.06 0.37±0.03*20.125＜0.001 Bax 蛋白0.14±0.02 0.57±0.04*28.845＜0.001

2.4 LINC00689 靶向調(diào)控miR-876-5p 的表達(dá)Star Base 預(yù)測LINC00689 靶基因顯示，LINC00689與miR-876-5p 存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，見圖4。熒光素酶活性檢測顯示，與轉(zhuǎn)染miR-NC 比較，轉(zhuǎn)染miR-876-5p 可降低WT-LINC00689 的熒光素酶活性［（1.02±0.07）vs.（0.59±0.05），P＜0.05］，而對MUT-LINC00689 的熒光素酶活性無顯著影響［（1.00 ±0.07）vs.（0.99±0.06），P＞0.05］。與pcDNA組比較，pcDNA-LINC00689組T24細(xì)胞miR-876-5p表達(dá)水平顯著降低［（1.00±0.05）vs.（0.63±0.04），P＜0.05］；與si-NC 組比較，si-LINC00689 組T24 細(xì)胞miR-876-5p 表達(dá)水平顯著升高［（1.02 ± 0.06）vs.（3.07 ±0.25），P＜0.05］。

圖3 抑制LINC00689 表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of inhibition of LINC00689 expression on apoptosis of T24 cells in bladder cancer

2.5 miR-876-5p 過表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞增殖和凋亡的影響與miR-NC 組比較，miR-876-5p 組T24 細(xì)胞miR-876-5p 表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞活力、CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著降低，凋亡率、p21 和Bax 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），見表3、圖5。

圖4 LINC00689 的序列中含有與miR-876-5p 互補(bǔ)的核苷酸序列Fig.4 The sequence of LINC00689 contains nucleotide sequences complementary to miR-876-5p

圖5 miR-876-5p 過表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-876-5p overexpression on proliferation and apoptosis of bladder cancer T24 cells

表3 miR-876-5p 過表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞增殖和凋亡的影響Tab.3 Effect of miR-876-5p overexpression on proliferation and apoptosis of bladder cancer T24 cells±s

表3 miR-876-5p 過表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞增殖和凋亡的影響Tab.3 Effect of miR-876-5p overexpression on proliferation and apoptosis of bladder cancer T24 cells±s

注：與miR-NC 比較，*P ＜0.05

分組miR-NC miR-876-5p t 值P 值miR-876-5p 1.00±0.05 2.46±0.23*18.609＜0.001 OD 值（450 nm）0.71±0.04 0.39±0.03*19.200＜0.001凋亡率（%）6.97±0.60 19.56±1.68*21.172＜0.001 CyclinD1 蛋白0.72±0.05 0.35±0.03*19.036＜0.001 p21 蛋白0.22±0.02 0.61±0.04*26.162＜0.001 Bcl-2 蛋白0.84±0.05 0.43±0.03*21.094＜0.001 Bax 蛋白0.15±0.02 0.51±0.04*24.150＜0.001

2.6 干擾miR-876-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制LINC00689表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞增殖和凋亡的作用與si-LINC00689+anti-miR-NC 組比較，si-LINC00689+anti-miR-876-5p 組T24 細(xì)胞miR-876-5p 表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活力、CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表達(dá)量顯著升高，凋亡率、p21 和Bax 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），見表4、圖6。

表4 干擾miR-876-5p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制LINC00689 表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞增殖和凋亡的作用Tab.4 Interference with miR-876-5p reversed the effect of inhibition of LINC00689 expression on proliferation and apoptosis of bladder cancer T24 cells±s

表4 干擾miR-876-5p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制LINC00689 表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞增殖和凋亡的作用Tab.4 Interference with miR-876-5p reversed the effect of inhibition of LINC00689 expression on proliferation and apoptosis of bladder cancer T24 cells±s

注：與si-LINC00689+anti-miR-NC 比較，*P ＜0.05

分組si-LINC00689+anti-miR-NC si-LINC00689+anti-miR-876-5p t 值P 值miR-876-5p 1.00±0.07 0.49±0.04*18.977＜0.001 OD 值（450 nm）0.33±0.03 0.58±0.04*15.000＜0.001凋亡率（%）22.14±2.23 11.97±1.06*12.357＜0.001 CyclinD1 蛋白0.30±0.02 0.61±0.04*20.795＜0.001 p21 蛋白0.68±0.05 0.32±0.03*18.522＜0.001 Bcl-2 蛋白0.36±0.03 0.71±0.05*18.007＜0.001 Bax 蛋白0.59±0.04 0.25±0.02*22.808＜0.001

圖6 干擾miR-876-5p 表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制LINC00689 表達(dá)對膀胱癌T24 細(xì)胞增殖和凋亡的作用Fig.6 Interference with miR-876-5p reversed the effect of inhibition of LINC00689 expression on proliferation and apoptosis of bladder cancer T24 cells

3 討論

大量研究顯示，lncRNA 表達(dá)失調(diào)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因參與細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、耐藥等各種生物學(xué)過程的調(diào)控，在腫瘤形成、進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用［9-11］。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中LINC00689 表達(dá)較癌旁組織顯著升高，且T24細(xì)胞中LINC00689 表達(dá)較SV-HUC-1細(xì)胞顯著升高，提示LINC00689 高表達(dá)可能是參與膀胱癌進(jìn)展的重要因素。采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染si-LINC00689 抑制LINC00689表達(dá)明顯降低膀胱癌細(xì)胞T24增殖活力，升高細(xì)胞凋亡水平。抑制LINC00689表達(dá)后CyclinD1表達(dá)降低，p21 表達(dá)增加，提示抑制LINC00689 表達(dá)可能影響膀胱癌T24 細(xì)胞周期從而影響其增殖。此外，本研究顯示抑制LINC00689 還顯著下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax 表達(dá)，這進(jìn)一步驗(yàn)證抑制LINC00689 表達(dá)對T24 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。已有研究表明，LINC00689 高表達(dá)不僅影響腫瘤形成，還誘導(dǎo)癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），阻礙細(xì)胞凋亡，從而在骨肉瘤、胃癌、前列腺癌發(fā)展中起致癌lncRNA 作用，抑制LINC00689 表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，是癌癥治療的潛在靶標(biāo)［12-14］。以上結(jié)果表明，LINC00689 在膀胱癌進(jìn)展中具有致癌作用。

近年研究［15］發(fā)現(xiàn)，lncRNA充當(dāng)分子海綿以調(diào)節(jié)miRNA 表達(dá)進(jìn)而影響膀胱癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。如lncRNA 肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）通過靶向miR-124 促進(jìn)膀胱癌腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。lncRNA 尿路上皮癌相關(guān)1（UCA1）通過與miR-196a-5p 作用參與調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞順鉑/吉西他濱耐藥［16］。此外，LINC00689 調(diào)節(jié)miR-655、miR-496、miR-526b-3p 表達(dá)參與骨肉瘤、前列腺癌、胃癌進(jìn)展［12-14］。因此，本研究假設(shè)LINC00689 在胃癌中也具有miRNA 海綿作用。進(jìn)一步研究表明，熒光素酶報(bào)告基因LINC00689 直接靶向miR-876-5p，且抑制LINC00689 可增加miR-876-5p 表達(dá)，而過表達(dá)LINC00689 則抑制miR-876-5p 表達(dá)。已有研究證實(shí)，miR-876-5p 在結(jié)直腸癌中表達(dá)明顯下調(diào)，過表達(dá)miR-876-5p 有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、集落形成和侵襲等惡性行為，抑制裸鼠移植瘤生長，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抗腫瘤作用［17］。miR-876-5p 通過抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP-4）表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞的體外遷移、侵襲、EMT 以及體內(nèi)轉(zhuǎn)移［18］。與上述研究類似，本研究顯示膀胱癌組織、T24 細(xì)胞中miR-876-5p 表達(dá)顯著降低，過表達(dá)miR-876-5p顯著降低T24 細(xì)胞增殖活力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并相應(yīng)影響相關(guān)蛋白表達(dá)。此外，miR-876-5p 表達(dá)抑制可抑制LINC00689 對T24 細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用，這說明LINC00689 通過靶向miR-876-5p 表達(dá)進(jìn)而調(diào)控T24 細(xì)胞的增殖和凋亡。然而，LINC00689、miR-876-5p 在膀胱癌動(dòng)物模型中的作用仍需進(jìn)一步探討。

總之，本研究證實(shí)膀胱癌中LINC00689 表達(dá)增加，抑制LINC00689 通過負(fù)調(diào)控miR-876-5p 進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞T24 增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制膀胱癌進(jìn)展。LINC00689/miR-876-5p 分子軸的發(fā)現(xiàn)可能為膀胱癌患者治療提供有效靶點(diǎn)。