陳富坤 鄧智勇 劉超 呂娟 賈莉 楊傳周 劉鵬杰 馮志平

1云南省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科（昆明650118）；2昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科（昆明650118）

分化型甲狀腺癌（DTC）是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，雖然僅占全身惡性腫瘤的2.6%，但近年來發(fā)病率迅速增長［1］。放射性核素131I 是治療DTC 的有效方法［2］。然而，由于DTC 細(xì)胞對131I 發(fā)生繼發(fā)性放療抵抗，導(dǎo)致放療后病灶殘留、增殖和轉(zhuǎn)移，無法達(dá)到預(yù)期治療效果。研究［3］發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA（circRNA）的異常表達(dá)與腫瘤的放療抵抗密切相關(guān)。例如，circ_CCDC66［4］和circ_MTDH.4［5］參與調(diào)控腫瘤放療抵抗。前期研究［6］證實，circ_NEK6 在甲狀腺癌組織和細(xì)胞系中異常高表達(dá)，但其在DTC 細(xì)胞131I 耐受的作用機(jī)制尚不清楚。此外，在線生物學(xué)數(shù)據(jù)庫顯示，miR-370-3p 作為circ_NEK6的潛在靶基因之一，且miR-370-3p 在多種惡性腫瘤發(fā)展進(jìn)程中作為抑癌基因，包括甲狀腺癌［6］、宮頸癌［7］和白血?。?］，同時，miR-370-3p 也參與調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的放療耐受性［9］。然而，circ_NEK6通過靶向miR-370-3p 調(diào)控DTC 的131I 放療抵抗分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬探討circ_NEK6對131I 耐受DTC 細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響以及其潛在作用機(jī)制，以期為臨床治療131I 放療抵抗的DTC 患者提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本收集2016 年5 月至2019 年5 月于云南省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科救治的DTC 患者經(jīng)手術(shù)切除的組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理證實為DTC；（2）行甲狀腺全切或次全切除；（3）首次接受131I 治療；（4）預(yù)期生存期不低于1 年。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）治療前血常規(guī)異常者；（2）接受過其他免疫治療或者放化療者；（3）心臟、肝、腎等重要臟器功能出現(xiàn)嚴(yán)重不全者。此外，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會核醫(yī)學(xué)會公布的131I 治療DTC 指南（2014 版）［10］，將患者分為131I 敏感組（20 例）和131I 耐受組（20 例）。其中131I耐受組評判標(biāo)準(zhǔn)［11］：（1）轉(zhuǎn)移灶在清甲成功后首次131I 治療后全身顯像中即表現(xiàn)為不攝碘；（2）原本攝碘的功能性轉(zhuǎn)移灶經(jīng)131I治療后逐漸喪失攝碘能力；（3）部分轉(zhuǎn)移灶攝碘，而部分轉(zhuǎn)移灶不攝碘，且可被18F-FDG PET/CT、CT 或MRI 等其他影像學(xué)檢查所顯示；（4）攝碘轉(zhuǎn)移灶在經(jīng)多次131I 治療后雖然保持?jǐn)z碘能力，但仍在1年內(nèi)出現(xiàn)病情進(jìn)展的患者。131I敏感組評判標(biāo)準(zhǔn)［11］：甲狀腺癌術(shù)后經(jīng)131I治療后殘留甲狀腺組織清甲完全。所有組織標(biāo)本取出后立即儲存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。手術(shù)前均告知患者并簽署知情同意書，并獲得本醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞系和主要試劑人DTC 細(xì)胞、人甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞以及HEK-293T 均購自北納生物；DMEM 和Trizol 試劑盒購自Thermo 公司；胎牛血清購自Gibco 公司；LipofectamineTM3000 和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司；CCK-8 試劑盒購自上海碧云天公司；Transwell 小室購自康寧公司；雙熒光素酶報告基因購自Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染采用含有10%的胎牛血清和雙抗的DMEM 培養(yǎng)上述細(xì)胞系。待Res-BCPAP 細(xì)胞生長密度達(dá)到80%時，將細(xì)胞調(diào)整密度2 × 105個/孔平鋪到6 孔板中，嚴(yán)格參照LipofectamineTM3000 試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，分為敲降circ_NEK6 組、敲降miR-370-3p 組、同時敲降circ_NEK6+miR-370-3p inhibitor 組，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)6 h后，更換正常DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.2.2131I 耐受細(xì)胞構(gòu)建參考前期文獻(xiàn)［12］，將對數(shù)生長期的BCPAP 細(xì)胞置于0.5 mCi 放射性核素131I 照射下培養(yǎng)24 h。更換新鮮的DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)，并觀察細(xì)胞活力，若無明顯死亡則選擇該對數(shù)期細(xì)胞增加劑量，反復(fù)傳代培養(yǎng)，直至最后在131I（1.05 mCi）照射下能夠穩(wěn)定存活，即構(gòu)建成功131I放療抵抗細(xì)胞株Res-BCPAP。

1.2.3 RT-qPCR收集組織和細(xì)胞，采用Trizol提取總RNA，并采用NanoDrop 檢測RNA的濃度。隨后，采用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按照qPCR 試劑盒說明書檢測circ_NEK6 和miR-370-3p 的表達(dá)，以U6 和GAPDH 為內(nèi)參。

1.2.4 細(xì)胞增殖檢測將處理的Res-BCPAP 細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以每孔1 × 105個細(xì)胞接種96孔板，每組設(shè)置6 個復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48 和72 h 后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液（0.5 mg/mL）后繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的每孔光密度（OD450）值。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測將經(jīng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞調(diào)整濃度為1 × 105個/孔接種到6 孔板，過夜培養(yǎng)后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS 洗滌后加入300 μL 結(jié)合液重懸，加入10 μL Annexin V-FITC 室溫避光孵育15 min，再加入5 μL PI 溶液染色，混合均勻后避光孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡百分比。

1.2.6 細(xì)胞侵襲和遷移檢測將經(jīng)轉(zhuǎn)染處理的細(xì)胞，以1 × 105個/孔的濃度接種于Transwell 小室上室，下室加入500 μL DMEM后常規(guī)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后采用1%結(jié)晶紫染色20 min，并于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5 個視野計算侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)。對于侵襲實驗，Transwell 小室上室需采用Matrigel膠包被，其他實驗與遷移實驗步驟一致。

1.2.7 雙熒光素酶報告實驗由湖南普拉特澤生物科技有限公司構(gòu)建circ_NEK6 基因的3′UTR，插入pGL3-Promoter 質(zhì)粒載體中，將該重組質(zhì)粒命名為pGL3-circ_NEK6-3′UTR WT，采用基因突變法定點突變獲得circ_NEK6 突變型載體（pGL3-circ_NEK6-3′UTR MUT）。然后，將HEK-293T 細(xì)胞接種于12 孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時分別將miR-370-3p mimic、miR-NC、circ_NEK6 野生型載體、circ_NEK6 突變型載體共轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h 后更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。最后，采用雙熒光素酶報告基因檢測熒光素酶活。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0 對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，并利用GraphPad Prism 8 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。其中兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ_NEK6在DTC組織和細(xì)胞系中高表達(dá)RT-qPCR結(jié)果顯示，circ_NEK6 在131I 耐受DTC 組織中的表達(dá)明顯高于敏感組織（P＜0.001，圖1A）。相比于Nthy-ori3-1 細(xì)胞，circ_NEK6 在DTC 細(xì)胞系中高表達(dá)（P＜0.001，圖1B），特別是在BCPAP細(xì)胞。此外，circ_NEK6 在Res-BCPAP 細(xì)胞中的表達(dá)高于其親本細(xì)胞BCPAP（P＜0.01，圖1C）。由此可知，circ_NEK6 的高表達(dá)可能與DTC 的131I 耐受相關(guān)。

2.2 敲降circ_NEK6 可顯著抑制Res-BCPAP 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相比于對照組，敲降circ_NEK6 可下調(diào)Res-BCPAP 細(xì)胞中circ_NEK6 的表達(dá)（P＜0.001，圖2A）。同時，敲降circ_NEK6 組細(xì)胞增殖受到抑制（圖2B），凋亡百分?jǐn)?shù)上調(diào)（P＜0.001，圖2C、D）。

圖1 circ_NEK6 在DTC 組織和細(xì)胞系中的表達(dá)水平Fig.1 The expression of circ_NEK6 in DTC tissues and cell lines

圖2 敲降circ_NEK6 對Res-BCPAP 細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.2 Effect of circ_NEK6 knockdown on Res-BCPAP cell proliferation and apoptosis

2.3 敲降circ_NEK6可顯著抑制Res-BCPAP細(xì)胞侵襲和遷移能力Transwell 檢測結(jié)果顯示，相比于對照組，敲降circ_NEK6 組Res-BCPAP 細(xì)胞侵襲（圖3A）和遷移能力（圖3B）顯著下調(diào)（均P＜0.001）。

圖3 敲降circ_NEK6 對Res-BCPAP 細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響Fig.3 Effect of circ_NEK6 knockdown on Res-BCPAP cell invasion and migration abilities

2.4 circ_NEK6 靶向下調(diào)miR-370-3p 的表達(dá)Starbase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，miR-370-3p 與circ_NEK6存在結(jié)合位點（圖4A）。同時，miR-370-3p 在Res-BCPAP 細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于其親本細(xì)胞（P＜0.001，圖4B）。雙熒光素酶報告基因結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-370-3p 顯著下調(diào)野生型circ_NEK6載體的熒光素酶活性（P＜0.01，圖4C），但對突變型circ_NEK6 載體沒有影響。此外，miR-370-3p 在敲降circ_NEK6組中的表達(dá)高于si-NC組（P＜0.01，圖4D）。由此可知，circ_NEK6靶向負(fù)調(diào)控miR-370-3p 的表達(dá)。

2.5 敲降circ_NEK6 靶向上調(diào)miR-370-3p 抑制Res-BCPAP細(xì)胞惡性生物學(xué)行為相比于對照組，miR-370-3p在miR-370-3p inhibitor組中的表達(dá)下調(diào)（P＜0.001，圖5A），但回復(fù)組（miR-370-3p inhibitor和si-NEK6）上調(diào)miR-370-3p的表達(dá)（P＜0.001）。相比于敲降circ_NEK6 組，細(xì)胞增殖活力（圖5B）明顯上調(diào)，細(xì)胞凋亡水平下調(diào)明顯（P＜0.001，圖5C、D）。Transwell檢測結(jié)果顯示，相比于敲降circ_NEK6 組，回復(fù)組細(xì)胞侵襲（P＜0.001，圖5E、G）和遷移（P＜0.001，圖5F、H）能力明顯上調(diào)。由此可知，敲降circ_NEK6 通過靶向上調(diào)miR-370-3p 的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制Res-BCPAP 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

圖4 miR-370-3p 是circ_NEK6 的靶基因Fig.4 miR-370-3p was a target gene of circ_NEK6

圖5 circ_NEK6 靶向miR-370-3p 對Res-BCPAP 細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移能力的影響Fig.5 Effect of circ_NEK6 on the proliferation，apoptosis，invasion，and migration capacities of Res-BCPAP cells via targeting miR-370-3p

3 討論

大量文獻(xiàn)［13-15］證實非編碼RNA（包括miRNA、lncRNA 和circRNA）通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性生物行為介導(dǎo)多種惡性腫瘤放療抵抗。尤其是circRNA可作為惡性腫瘤放療抵抗的重要調(diào)控因子［16］。例如，經(jīng)放療處理的宮頸癌細(xì)胞中有153 個差異circRNA異常表達(dá)（其中76個上調(diào)和77個下調(diào)）［17］。GUAN 等［18］證實，敲降circ_PITX1 通過靶向抑制miR-329-3p 促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對放療的敏感性。LIU 等［19］研究表明，敲降circ_100367 通過抑制放療抵抗KYSE-150R 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，從而緩解食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對放療的抵抗。本研究同樣證實，circ_NEK6 在131I 耐受DTC 組織和細(xì)胞系中異常高表達(dá)，敲降circ_NEK6 通過靶向上調(diào)miR-370-3p 顯著抑制了131I 耐受細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。同時，LIU 等［20］也證實，lncRNA MEG3 通過靶向miR-182 增強(qiáng)甲狀腺癌細(xì)胞對131I 的敏感性。

大量研究證實，circRNA 通過靶向結(jié)合下游miRNA 參與調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。例如，circ_AGFG1 通過靶向抑制miR-370-3p 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移能力［7］。circ_MYO10 通過抑制miR-370-3p 促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而加速腫瘤的惡化進(jìn)程［21］。miR-370-3p作為抑癌基因，在多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞系中低表達(dá)［22］。過表達(dá)miR-370-3p 可明顯抑制腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為［23］，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放療敏感性［9］。然而，目前尚未有研究證實miR-370-3p在DTC 細(xì)胞對131I 耐受過程中的作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，miR-370-3p 在131I 耐受Res-BCPAP 細(xì)胞中的表達(dá)低于BCPAP 細(xì)胞，且敲降miR-370-3p 可緩解circ_NEK6 敲降對Res-BCPAP 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用。也有研究表明，過表達(dá)miR-370-3p 增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性［24］。以上研究提示，miR-370-3p 可能是增強(qiáng)DTC 對131I 放射敏感性的有效性靶點。

綜上所述，本研究證實circ_NEK6/miR-370-3p分子軸與DTC 細(xì)胞對131I 耐受有關(guān)，敲降circ_NEK6通過靶向上調(diào)miR-370-3p 顯著抑制Res-BCPAP 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力。本研究為臨床上治療DTC 患者對131I 放射性粒子植入治療產(chǎn)生抵抗提供有效的治療靶點。