馬浩然 龔愛秀 湯根兄，2

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（南京210008）；2國(guó)家衛(wèi)健委抗體技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（南京211166）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是分化程度不同、早期可能出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術(shù)后容易局部復(fù)發(fā)的一種惡性腫瘤［1］。OSCC 目前仍采取手術(shù)為主的綜合治療，患者口腔手術(shù)破壞面部和口腔的解剖結(jié)構(gòu)，患者術(shù)后生存質(zhì)量偏低［2］。因此找到合適的非創(chuàng)傷性輔助治療方案，盡量減少手術(shù)破壞的口腔頜面部組織，提高患者的生存質(zhì)量尤為重要。

摻釹釔鋁石榴石激光（neodymium yttrium-aluminium-garnetm，Nd：YAG）因其具有水吸收率高、殺菌、凝血、對(duì)周圍組織熱損傷小等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)顯示出較高的醫(yī)學(xué)價(jià)值和前景［3-4］。應(yīng)用于常見的窩洞預(yù)備、口腔小手術(shù)、牙周炎、種植體周圍炎、頜面部血管瘤的治療等［5-6］。在腫瘤方面有皮膚基底細(xì)胞癌的治療［7］，但在口腔腫瘤方面Nd：YAG 激光的應(yīng)用暫未見研究。人滋養(yǎng)層細(xì)胞表面抗原2（human trophoblast cell-surface antigens 2，TROP2）是一種無內(nèi)含子的基因，編碼323個(gè)氨基酸，構(gòu)成約36 kDa 的細(xì)胞表面糖蛋白。其在口腔鱗癌中高表達(dá)，且能促進(jìn)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，反之亦然［8-9］。但是Nd：YAG 激光能否調(diào)控TROP2影響口腔鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)擬通過體外實(shí)驗(yàn)研究Nd：YAG 激光調(diào)控TROP2 干預(yù)口腔鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，探討抑制口腔鱗癌細(xì)胞HN6 增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲的合適激光劑量及可能的作用機(jī)制，為激光在口腔鱗癌的輔助治療方面提供理論依據(jù)，以期為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料舌鱗癌細(xì)胞株HN6（美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)）；Nd：YAG 口腔激光治療儀（KJZ 脈沖）（合肥泓博醫(yī)學(xué)科技有限公司）；CCK-8 試劑（日本同仁公司）；Transwell 小室（美國(guó)Corning 公司）；DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞（中國(guó)諾唯贊公司）；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Thermo 公司）；兔抗人TROP2單克隆抗體、HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體（英國(guó)Abcam 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法本實(shí)驗(yàn)采用160 mJ、5 Hz的激光能量并用同心圓式的照射方法進(jìn)行照射，使用激光波長(zhǎng)為1 064 nm 的KJZ 脈沖Nd：YAG 口腔激光治療儀，光斑直徑2 mm，頻率1 ～10 Hz 可調(diào)，100 ～250 mJ 能量范圍脈沖。實(shí)驗(yàn)前測(cè)定激光頭距離板底部的垂直距離為20 mm。Nd：YAG 激光垂直照射24 孔板，使用激光能量測(cè)定儀測(cè)定其透過24 孔板的能量，其激光能量穩(wěn)定為740 mJ/s。

Nd：YAG 照射時(shí)間設(shè)5 組，分別為0、120、240、360、480 s，對(duì)應(yīng)的激光照射能量密度分別為0 J/cm2（未照射）、44.4 J/cm2（低劑量）、88.8 J/cm2（中劑量1）、133.2 J/cm2（中劑量2）和177.6 J/cm2（高劑量）。

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

1.3.1 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)96孔板中接種細(xì)胞懸液，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，四周加入PBS 溶液防止水分蒸發(fā)，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h（37 ℃，5%CO2）。棄去原有培養(yǎng)基，向培養(yǎng)板每孔中加入10 μL CCK-8 試劑，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 ～3 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 細(xì)胞劃痕試驗(yàn)HN6 細(xì)胞按不同劑量照射后進(jìn)行劃痕，用200 μL 無菌槍頭比對(duì)直尺，垂直于孔板底細(xì)胞劃痕，槍頭劃痕要求直，洗去劃下的漂浮細(xì)胞，將其加入無血清DMEM 培養(yǎng)基后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞在培養(yǎng)0、12、24、48 h 后劃痕寬度的變化，分組拍照記錄，利用Image J 軟件來測(cè)量劃痕區(qū)的像素定量比較各組細(xì)胞劃痕愈合的能力。同等條件下，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.3.3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)預(yù)冷的槍頭吸入100 μL Matrigel 膠加到500 μL 無血清培養(yǎng)基，稀釋至終濃度為1 mg/mL。在Transwell 小室底部中央垂直加入100 μL 稀釋后的Matrigel 膠。無血清的DMEM培養(yǎng)基將五組激光照射后HN6 細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，Transwell 的上室中加入細(xì)胞懸液200 μL，下室中加入含10%FBS 的500 μL 培養(yǎng)基。將其放于37 ℃、5% CO2環(huán)境中孵育48 h。去除Transwell 小室內(nèi)培養(yǎng)液，棉簽擦去上室中未穿過的細(xì)胞和Matrigel 膠，95%的甲醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定后使用0.1%結(jié)晶紫避光染色5 s。隨機(jī)取5 個(gè)高倍鏡視野取平均值。顯微鏡下觀察穿過微孔移到濾膜下層的細(xì)胞總數(shù)，以穿過膜底的細(xì)胞數(shù)來代表腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，取平均數(shù)為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.4 熒光定量PCR（qRT-PCR）應(yīng)用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)說明書步驟使用SuperScript IV First-Strand 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)熱10 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30 次；72 ℃10 min。引物序列如下：TROP2，上游5′-TGTCCTGATGTGATATGTCTGAG-3′，下游5′-GGGTGAGAGTGGGTTGGG-3′；GAPDH，上游5-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。以GAPDH 為參照基因，計(jì)算TROP2 相對(duì)定量值2-△△Ct。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次。

1.3.5 免疫印跡法（Western blot）每1×106個(gè)細(xì)胞加入100 μL RIPA裂解液，搖勻置于冰上30 min，每隔10 min 來回?fù)u動(dòng)EP 管，使細(xì)胞充分裂解。4 ℃下，12 000 r/min，離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移到另一EP 管中，4 ℃，12 000 r/min，離心10 min，取上清液與蛋白上樣緩沖液混合，95 ℃加熱10 min，-20 ℃保存。聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。室溫下5 %脫脂牛奶封閉2 h，4 ℃兔抗人TROP2單克隆抗體（1∶2 000）孵育過夜。PBST 漂洗三次后HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體（1∶2 000）孵育1 h。ECLA 液和B 液按1∶1 比例混合，完全覆蓋PVDF 膜，采用ChemiDoc XRS 曝光軟件拍照后采用Image-Pro Plus 6.0 軟件檢測(cè)其灰度值。

1.3.6 TROP2敲減質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定通過NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）查詢TROP2 基因所有序列，根據(jù)TROP2 基因序列設(shè)計(jì)TROP2 shRNA 序列，序列為：gtgtcccaccaacaagatgac，敲減質(zhì)粒以下稱為shTROP2。TROP2 敲減質(zhì)粒的構(gòu)建由廣州Gene-Copoeia 公司完成。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，加入800 μL不含氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基，于37 ℃搖床培養(yǎng)60 min，200 r/min，離心3 min，取上清加入到含氨芐青霉素溶液（100 μg/mL）LB 固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。24 h 后挑取菌落放于1 mL 含氨芐青霉素溶液的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌，次日將菌液與10 %的甘油混勻后保存于-80 ℃?zhèn)溆?。部分菌落送南京金斯瑞生物公司測(cè)序，并根據(jù)質(zhì)粒制備試劑盒說明來提取及純化質(zhì)粒。

1.3.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將細(xì)胞接種至六孔板內(nèi)。待細(xì)胞匯合度為90% ～95%時(shí)，將4 μg 質(zhì)粒DNA 加至250 μL 的OPTI-MEM 培基中，混勻。將10 μL 的Lipo2000 加至另外250 μL 的OPTI-MEM 中，輕輕混勻，室溫靜置5 min。將DNA 懸液和Lipo2000 懸液混合，總體積500 μL，輕輕混勻，室溫靜置20 min。將DNA 和Lipo2000 混合液加至六孔板的孔內(nèi)，前后左右晃動(dòng)孔板混勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4～6 h 后，細(xì)胞換液，每孔2 mL 培養(yǎng)基。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間方差齊時(shí)采用單因素方差分析，不齊時(shí)則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 激光照射對(duì)HN6 細(xì)胞增殖能力的影響在相同照射時(shí)間下，低劑量組、中劑量組相對(duì)于未照射組的HN6 細(xì)胞增殖受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量組相對(duì)于未照射組，HN6 細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The results of CCK-8 experiment

2.2 激光照射對(duì)HN6 細(xì)胞轉(zhuǎn)移影響24、48 h 兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)四組不同劑量激光照射細(xì)胞后劃痕，低劑量組和中劑量組劃痕寬度小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高劑量組劃痕寬度明顯大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨照射時(shí)間間隔的增加，劃痕寬度差異增大（表1、圖2）。

表1 HN6 細(xì)胞各組各時(shí)刻的劃痕寬度Tab.1 The scratch width of HN6 cells in different groups and time±s

表1 HN6 細(xì)胞各組各時(shí)刻的劃痕寬度Tab.1 The scratch width of HN6 cells in different groups and time±s

0 h 24 h 48 h 0 J/cm2（0 s）235.5±4.6 189.5±15.3 145.8±9.5 44.4 J/cm2（120 s）231.5±5.7 102.1±12.3 58.0±20.1 88.8 J/cm2（240 s）234.1±4.1 105.9±10.3 68.1±19.3 133.2 J/cm2（360 s）232.3±4.7 105.1±9.9 60.2±21.0 177.6 J/cm2（480 s）236.0±5.2 225.5±4.4 209.9±5.6

不同照射劑量下，細(xì)胞劃痕在0、24、48 h 時(shí)間點(diǎn)，三組兩兩之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。相同劃痕時(shí)間下，低劑量vs.中劑量組與對(duì)照組vs.高劑量組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而高劑量組與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量組與中劑量組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3）。結(jié)果表明，低劑量和中劑量激光照射后促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，高劑量激光照射后，細(xì)胞轉(zhuǎn)移受到抑制。

2.3 激光照射對(duì)HN6 細(xì)胞侵襲的影響倒置顯微鏡下觀察，44.4、88.8、133.2 J/cm2照射組與未照射組對(duì)比，細(xì)胞數(shù)量增多且密度增大；177.6 J/cm2組照射后，細(xì)胞數(shù)量減少、密度降低（圖4、5）。

2.4 激光照射對(duì)HN6細(xì)胞TROP2表達(dá)的影響激光照射HN6 細(xì)胞480 s 后，qRT-PCR 檢測(cè)HN6 細(xì)胞中TROP2 的mRNA 表達(dá)水平，低劑量組和中劑量組TROP2 的mRNA 水平高于對(duì)照組，高劑量組低于未照射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖6）。Western blot 在蛋白水平上驗(yàn)證了TROP2 的表達(dá)變化，低劑量組和中劑量組TROP2蛋白水平高于未照射組，高劑量組低于未照射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖7、8）。

圖2 HN6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The results of HN6 cell scratch experiment

圖3 HN6 細(xì)胞各組各時(shí)刻的劃痕寬度柱形圖Fig.3 The bar charts of the scratch width in different groups and time of HN6 cells

2.5 抑制TROP2 表達(dá)對(duì)激光照射后細(xì)胞增殖與侵襲的影響CCK-8 實(shí)驗(yàn)表明，不同劑量激光照射對(duì)轉(zhuǎn)染shTROP2 的HN6 細(xì)胞增殖的影響無差異（P＞0.05，圖9）。Transwell 實(shí)驗(yàn)表明，不同劑量激光照射組中HN6 細(xì)胞侵襲性差異消失（P＞0.05，圖10）。

3 討論

口腔鱗癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤之一，5 年生存率僅約50%［10-11］。目前口腔鱗癌的治療主要是采取以手術(shù)為主的綜合序列治療［12-13］，包括手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療、靶向治療或綜合序列治療等［14-15］，當(dāng)前的治療方式雖然提高口腔鱗癌患者的5 年存活率，但仍然約30%的患者因局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失?。?6-17］。因此，非侵入性、非創(chuàng)傷性的治療方式已成為口腔癌輔助治療的方向，優(yōu)化的治療方式亟需進(jìn)一步研究并應(yīng)用于臨床。

圖4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of cell invasion experiment

圖5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)各組對(duì)比柱形圖Fig.5 The bar charts of cell invasion test groups

圖6 qRT-PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中TROP2 mRNA 表達(dá)Fig.6 TROP2 mRNA expression in each group was detected by qRT-PCR

圖7 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞中TROP2 蛋白表達(dá)Fig.7 TROP2 protein expression in each group was detected by Western blot

圖8 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞中TROP2 蛋白表達(dá)的灰度統(tǒng)計(jì)圖Fig.8 Gray-scale statistical image of TROP2 protein expression in each group was detected by Western blot

圖9 CCK-8 檢測(cè)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后各組細(xì)胞增殖情況Fig.9 Cell proliferation in each group was detected by CCK-8 after transfection with interfering plasmids

圖10 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后各組細(xì)胞侵襲情況Fig.10 Cell invasion in each group was detected by Transwell assay after transfection with interfering plasmids

Nd：YAG激光屬于近紅外激光，波長(zhǎng)為1 064 nm，分為連續(xù)式和脈沖式兩種［18］，能分散或滲透到生物組織中［19］，Nd：YAG 激光具有選擇性光熱作用，能減少對(duì)周圍正常組織的熱損傷［20］，減輕瘢痕等不良反應(yīng)的發(fā)生，且其具備高效的軟硬組織切割能力和止血?dú)⒕饔?，已被廣泛運(yùn)用到口腔治療中［21］。本研究首次通過不同劑量激光調(diào)控TROP2作用于口腔鱗癌細(xì)胞以探討抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的合適激光劑量及可能的作用機(jī)制，為口腔鱗癌的輔助治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)通過研究口腔鱗癌細(xì)胞在不同劑量Nd：YAG 激光照射下的增殖、遷移和侵襲情況，尋找對(duì)抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的有效劑量。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相同照射時(shí)間下的低劑量組、中劑量組相對(duì)于對(duì)照組促進(jìn)HN6 細(xì)胞增殖，高劑量組相對(duì)于對(duì)照組抑制HN6 細(xì)胞增殖。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同照射時(shí)間下，低劑量組和中劑量組劃痕寬度小于對(duì)照組，高劑量組劃痕寬度大于對(duì)照組，且隨照射時(shí)間間隔的增加，劃痕寬度差異增大。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鏡下觀察低劑量和中劑量激光照射后細(xì)胞穿膜數(shù)量增多，侵襲能力提高，高劑量激光照射后穿膜數(shù)量減少，侵襲能力受到抑制。結(jié)果說明，不同劑量的Nd：YAG 激光對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞HN6 的生物學(xué)行為影響不一，選擇合適劑量的Nd：YAG 激光能對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲產(chǎn)生抑制作用，有助于作為無創(chuàng)傷性的治療手段輔助治療口腔鱗癌。

TROP2在實(shí)體腫瘤細(xì)胞中普遍高表達(dá)，可以促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖，還參與了多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，并與預(yù)后有關(guān)［22-23］。本研究發(fā)現(xiàn)低劑量組和中劑量組的激光照射能夠促進(jìn)細(xì)胞中的TROP2 表達(dá)，高劑量激光照射可抑制細(xì)胞的TROP2 表達(dá)。干擾TROP2表達(dá)后，低劑量組和中劑量組激光照射對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲的促進(jìn)作用消失。上述研究結(jié)果表明，Nd：YAG 激光可以通過調(diào)控TROP2的表達(dá)影響口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移。

目前研究發(fā)現(xiàn)，Nd：YAG 激光有效穿透深度約4 mm，對(duì)于＜4 mm 的口腔鱗癌組織可起到治療作用，但尚不能對(duì)＞4 mm 深度的口腔鱗癌組織進(jìn)行有效的治療，但是可考慮作為術(shù)前輔助治療，從腫瘤周圍正常組織0.5 ～1.0 cm 先照射，逐漸移向中心［24-25］，使后期手術(shù)適當(dāng)縮小腫瘤直徑，保留一些合適的組織，盡可能的減少患者的面容破壞，提高患者的生存質(zhì)量。

綜上所述，不同劑量的Nd：YAG 激光對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞HN6 進(jìn)行照射時(shí)，較小劑量的Nd：YAG激光在一定劑量范圍內(nèi)促進(jìn)HN6 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲；較高劑量的Nd：YAG 激光在一定劑量范圍內(nèi)有抑制鱗癌細(xì)胞HN6 增殖、遷移和侵襲，Nd：YAG 激光通過調(diào)節(jié)TROP2 干預(yù)口腔鱗癌細(xì)胞HN6 的增殖與侵襲。后期將增加口腔鱗癌細(xì)胞的種類并加入TROP2 干預(yù)進(jìn)一步研究適宜的激光劑量，在不改變細(xì)胞形態(tài)的基礎(chǔ)上，以期能對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和分子機(jī)制方面提供更加科學(xué)的理論依據(jù)，并應(yīng)用于指導(dǎo)臨床上Nd：YAG 激光治療和免疫治療的安全操作。