汪洋 張輝 馬東波 伍冬冬 鄧翔 李芳 郭勝存 吳秋歌

鄭州大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科（鄭州450052）

?？刹《荆╡chovirus，ECHO）是一種小分子RNA 病毒，屬于腸道病毒B 型，腸道病毒屬，小核糖核酸病毒科，是全世界病毒性肺炎和無菌性腦膜炎最常見的病原體之一［1］。ECHO 分為34 型，各型致病力和致病類型也不同，其中6、9、19 型致病力較強。?？刹《? 型（echovirus 9，ECHO9）是引起嬰幼兒上、下呼吸道感染的常見病原體，病死率較高，在呼吸道疾病中的地位不容忽視［2］。臨床表現(xiàn)復雜、多樣化，癥狀輕重不等，從隱性的無癥狀感染、上呼吸道輕度不適到嚴重中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、心力衰竭均可發(fā)生［2-3］。盡管目前已有中藥成份的治療?？刹《靖腥镜难芯繄蟮溃?-5］，但其機制研究較少，且至今仍然沒有特異針對性的治療措施或疫苗。目前臨床上治療埃可病毒感染主要應用更昔洛韋和干擾素，可結合中藥輔助治療，或給予對癥支持治療［6］。對于危重癥患者，可靜脈注射高效價免疫球蛋白，有利于減少危重癥及死亡病例的發(fā)生。目前的治療雖可減輕臨床癥狀，縮短病程，但療效尚不穩(wěn)定，副作用多，治療周期長，患者花費高。目前還沒有開發(fā)出安全有效的預防疫苗。因此，開發(fā)高效、安全、副作用少的防治?？刹《靖腥镜男滤?，尤其是天然活性成分的化合物具有重大意義。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）為茶多酚中主要的活性成份，約占總茶多酚含量的55%～65%［7］。研究表明，EGCG 具有抗氧化、抗腫瘤、抗細菌、抗炎、抗病毒、抗血栓形成及抑制血小板聚集的作用［8-10］。其抗病毒治療的作用靶點及具體機制尚不明確。本研究旨在探討EGCG體外抗ECHO9型的作用及機制，評價其作為天然藥物治療靶點的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料ECHO9：為鄭州大學第一附屬醫(yī)院臨床分離株，來源于一名患者的腦脊液。該患者為32 歲男性，受涼1 d 后出現(xiàn)上呼吸道感染、高熱，伴頭痛、惡心、嘔吐，自服解熱鎮(zhèn)痛藥物3 d 后呼吸道癥狀、發(fā)熱較前緩解，但頭痛、嘔吐較前加重。查體腦膜刺激征陽性，腦脊液檢查未見白細胞增高及蛋白、糖和氯化物的改變，考慮病毒性腦膜炎。Vero 和Hep-2 細胞為本科室保存。EGCG 由Sigma公司提供，母液濃度為20 mg/mL，過濾除菌分裝，4 ℃避光保存。Anti-Respiratory Syncytial Virus兔多克隆抗體（ab12253）和山羊抗兔IgG H&L（HRP）（ab6721）二抗購自美國Abcam 公司，抗GAPDH 兔多克隆抗體購自杭州賢至生物科技有限公司；小干擾RNA（siRNAs）（siControl，cat. no. sc-37007，序列為5′-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3′；siHsp70，cat. no. sc-29352，序列為5′-CGGUGGUGCAGUCGGACAUGA-3′）和Hsp70 的RT-PCR 引物（h）-PR：sc-29352-PR購自Santa Cruz Biotechnology，Inc.。

1.2 方法

1.2.1 病毒的擴繁提前一天將Vero 細胞傳代，使一瓶細胞擴繁為三瓶。次日細胞長至80%左右匯合度的細胞單層時，接入?？刹《痉N子毒，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細胞病變。待大部分細胞出現(xiàn)病變時，即由梭形變?yōu)閳A形時，表明細胞已受病毒侵襲，部分凋亡壞死，收取細胞培養(yǎng)上清，以3 000 r/min 離心去除細胞碎片，將上清進行1 mL/管進行分裝，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 病毒滴度測定在接毒前將生長狀態(tài)良好的正常Vero 細胞鋪96 孔細胞培養(yǎng)板。次日待細胞匯合度長至約80%時，棄去培養(yǎng)上清。將?？刹《居眉毎S持液從10-1至10-8做10 倍系列稀釋，每個稀釋度設6 個重復孔，將各稀釋度的病毒液取100 μL接種于單層Vero細胞中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細胞病變程度并記錄。采用Reed-Muench 法計算病毒培養(yǎng)上清和不同藥物濃度處理細胞上清中的?？刹《镜味?。

1.2.3 EGCG的藥物毒性測定將EGCG分別用細胞維持液稀釋為400、200、100、50、25、12、6、3 μmol/L 8 個濃度，然后分別加入Vero 細胞已長成單層的96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每一濃度設置3 個復孔，同時設立正常細胞對照組，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察48 h。每孔加入CCK8 10 μL，避光培養(yǎng)1 ～4 h。酶標儀（波長450 nm）測定各孔光吸收值。各實驗批次間重復6 次。

1.2.4 EGCG 的抗病毒效果檢測已長成單層的

Vero 細胞以含不同濃度藥物的維持液（各濃度均不超過半數(shù)致死量CC50）處理2 h 后，按照MOI（multiplicity of infection，MOI）=0.01 進行接毒，隨后置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱孵育2 h。棄去含病毒維持液，以無血清培養(yǎng)基洗1 遍，再更換含不同濃度藥物的維持液，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后，收集上清。測定病毒滴度，方法同1.2.2 所述。

1.2.5 Western blot 檢測RSV 病毒蛋白的表達情況Vero 細胞鋪于六孔細胞培養(yǎng)板，藥物和溶劑DMSO 分別預處理細胞2 h，再以MOI 值0.01 接入?？刹《?，培養(yǎng)24 h 后，不同處理細胞樣品進行電泳并轉膜。NC 膜分別加入1∶1 000 稀釋的抗GAPDH 兔多克隆抗體或抗埃可病毒F 蛋白抗體，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG 二抗于37 ℃條件下?lián)u床孵育1 h，化學發(fā)光系統(tǒng)成像拍照分析。

1.2.6 qPCR 檢測病毒基因的抑制情況將?？刹《镜奶堑鞍譍 基因和猴GAPDH、Hsp70 基因分別錄入在線qPCR 引物設計網(wǎng)站，設計qPCR 引物并進行合成，具體引物如下：G-F：5′-AAGCCAACCATCAACACCAC-3′，G-R：5′-TGGGCTTAGATAGCCTTCGG-3′；GAPDH-F：5′-TCGTGGAAGGACTCATGACC-3′，GAPDH-R：5′-CCATCCACAGTCTTCTGGGT-3′。將不同處理方法處理的六孔板細胞以MOI 0.01 接入?？刹《?，培養(yǎng)24 h 后，棄去上清，以PBS 洗細胞1 次，每孔加入1 mL Trizol 裂解，抽提細胞總RNA，并反轉錄為cDNA。PCR 運行程序為：95預變性10 min，隨后進行40個循環(huán)：95 ℃10 s，56 ℃1 min 以及72 ℃10 s。采用SYBR Green 法進行擴增。

1.2.7 Hsp70的RNA干擾Hep-2細胞分別以Hsp70和對照的siRNA 進行轉染，轉染12 h 后，以MOI=0.01 接?？刹《具M行培養(yǎng)，分別在感染24、36、48 h收集培養(yǎng)上清，測病毒滴度。測定Hsp70 轉錄本的表達情況。具體參考產(chǎn)品說明書和方法1.2.2、1.2.6 進行。

1.2.8 統(tǒng)計學方法用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析，不同處理組的樣品轉錄本、病毒滴度等采用t檢驗進行組間兩兩比較，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 病毒滴度測定結果取100 μL 病毒母液，接入長成單層細胞的T-25 細胞瓶中，每天觀察細胞病變情況。當Vero 細胞中大部分出現(xiàn)病變時收毒（圖1），測定病毒培養(yǎng)液中病毒滴度，記錄每個稀釋度不同孔的病變情況，經(jīng)Reed-Muench 法算得每0.1 mL 母液中病毒滴度TCID50（半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）為10-4.5，可以滿足后續(xù)實驗的需求。

圖1 ECHO 9 病毒在Vero 細胞上產(chǎn)生的病變（50×）Fig.1 ECHO 9 infected Vero cells

2.2 EGCG 的藥物毒性測定結果不同濃度的EGCG 處理細胞48 h 后，測定細胞活力。EGCG 的細胞毒性具有明顯的濃度梯度依賴反應，其中25 μmol/L 對細胞毒性與其以下濃度差異無統(tǒng)計學意義，因此，EGCG 對Vero 細胞的最大無毒濃度在25 μmol/L 以下（表1）。

2.3 EGCG 對ECHO9 病毒增殖的抑制效果為了更加直觀清晰的評價EGCG 的抗RSV 效果，本研究采用測定上清病毒滴度TCID50的辦法對藥物進行藥效學檢測。EGCG 對細胞上清中釋放病毒滴度的抑制結果如表2 所示，EGCG 分別在25 μmol/L和20 μmol/L 及以上濃度時，可抑制60%以上的病毒增殖；同時，在不同的EGCG 濃度作用下，培養(yǎng)上清中子代病毒釋放量隨著EGCG 濃度的增加而下降。結果顯示EGCG 對ECHO9 具有體外抗病毒效果。

表1 不同EGCG 藥物濃度下細胞活力Tab.1 Cell activity at different EGCG concentrations ±s

表1 不同EGCG 藥物濃度下細胞活力Tab.1 Cell activity at different EGCG concentrations ±s

EGCG 藥物濃度（μmol/L）361 2 25 50 100 200 400 800細胞活力（%對照）100±2.56 97±4.76 94.7±3.41 90.2±4.33 66.4±3.78 57.8±4.24 49.7±3.12 27.5±2.27 13.5±1.54

表2 不同濃度EGCG 對病毒增殖的抑制作用Tab.2 Inhibition effect of EGCG at different concentrations on virus

2.4 Western blot 檢測ECHO 9 病毒蛋白表達受EGCG 抑制的情況將不同處理方法（正常細胞、溶劑DMSO 和EGCG 12 μmol/L）處理的細胞樣品的檢測結果如圖2 所示，在膜上顯現(xiàn)出相對分子質量48 kD的條帶，這與ECHO 9病毒G蛋白分子量大小一致。在EGCG 處理的樣品中，在細胞內(nèi)參蛋白GAPDH 含量相同的情況下，病毒蛋白表達量顯著低于對照組和溶劑處理組的細胞樣品（Western blot結果分析相對表達量分別為0.98、0.96、0.12），表明EGCG 使病毒在細胞中的增殖受到明顯抑制。

2.5 qPCR 檢測EGCG 處理細胞中病毒基因的轉錄抑制情況由圖3A 可知，本研究所設計引物具有單一的溶解曲線峰，說明擴增效果良好。由于病毒mRNA 合成在病毒感染后進行，比較了藥物處理和未處理的細胞在感染24 h 后病毒G 蛋白mRNA 的轉錄水平。EGCG（12 μmol/L）、DMSO 溶劑和ECHO 9 病毒感染等不同處理的細胞中病毒G 基因的轉錄水平以GAPDH 進行歸一化處理，并按照ΔΔCt 方法進行計算。實驗結果（圖3B）顯示，EGCG 的處理使ECHO9 病毒糖蛋白G 基因組轉錄下降了約85.3%，與溶劑組和正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖2 Western blot 檢測ECHO 9 病毒蛋白表達Fig.2 ECHO 9 protein expression by Western blot

圖3 不同處理對ECHO9 G 蛋白基因轉錄水平的影響Fig.3 Effect of different treatments on ECHO9 G mRNA expression

2.6 EGCG處理對Hsp70的轉錄和表達的影響為了進一步探討EGCG 抑制ECHO9 病毒的作用機制，對EGCG 處理的細胞中Hsp70 和糖蛋白G 基因的轉錄本進行實時熒光定量PCR 檢測。EGCG 的處理能夠使Hsp70 的轉錄本水平下調(diào)約60%，在病毒感染細胞能夠達到相同的效果；而病毒ECHO 9的感染沒有使Hsp70 轉錄水平發(fā)生明顯的變化（P＞0.05，圖4A）。同時，在蛋白水平上，EGCG的處理使得ECHO 9 感染前后的細胞中的HSP70 的表達水平受到明顯抑制（P＜0.01，圖4B），其蛋白相對表達量分別為1.36、0.71、1.42 和0.63。

圖4 EGCG 的處理前后ECHO 9 感染前后細胞中的Hsp70的表達水平Fig.4 Hsp70 expression level of ECHO 9 infected cells before and after EGCG treatment

2.7 RNAi 證實Hsp70 為ECHO 9 的治療靶標鑒于EGCG具有多種生理活性，但其抑制ECHO 9的增殖是否是通過抑制其特異性底物Hsp70 來實現(xiàn)有待研究。本實驗采用RNA 干擾的手段進行了初步探索。RNA 干擾敲低了細胞中HSP70 的表達水平。經(jīng)Western blot驗證siHsp70干擾效率為89.7%，干擾效果良好。不同處理組Hep-2 細胞培養(yǎng)上清中病毒的一步生長曲線顯示，細胞培養(yǎng)上清液中病毒滴度siHsp70 組（102.03TCID50/0.1 mL）顯著低于實驗對照組（104.98TCID50/0.1 mL）（P＜0.01，圖5）。

3 討論

圖5 不同處理Hep-2 細胞培養(yǎng)上清中病毒的一步生長曲線Fig.5 One step growth curve of virus in supernatants with different treatments of Hep-2 cells

ECHO 是全世界病毒性肺炎和無菌性腦膜炎最常見的病原體之一，多發(fā)于夏、秋季，絕大多數(shù)是隱性感染。?？刹《局饕?jīng)糞-口途徑傳播，也可通過咽喉分泌物排出病毒經(jīng)呼吸道傳播。隨著各國衛(wèi)生條件的改善和醫(yī)療水平的提高，呼吸道傳播逐漸成為首要途徑。病毒從上呼吸道或口腔進入體內(nèi)，在咽喉部或腸壁淋巴組織中停留并增殖，從原發(fā)部位向局部淋巴組織或血液轉移并經(jīng)血型播散帶到其他器官如心臟、肝臟、腦、腎臟、骨骼肌、甚至皮膚黏膜，幾乎所有細胞均能受累［11-12］。?？刹《? 型（Echovirus 9）是從無菌性腦炎患者檢測到的最常見類型，散發(fā)或流行均可出現(xiàn)［12-13］。其感染的臨床表現(xiàn)類似于風疹，對新生兒尤其具有破壞性，可誘發(fā)重癥肺炎、肝功能衰竭、腦膜炎及腦炎，膿毒血癥，最終導致多臟器衰竭甚至死亡［2，13］。

茶多酚是從茶葉中提取的多羥基酚類混合物，其中以兒茶素占茶多酚總量的60%～80%，包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表兒茶素（EC）［14-15］。EGCG 是茶葉中特有的兒茶素，含量最高，約占茶多酚制品的50%左右［7］。研究表明EGCG 具有抗氧化、抗感染、抑制腫瘤生長、提高免疫力，且對痢疾、傷寒、金黃色葡萄球菌等微生物具有明顯的抑制作用［21］。體外實驗已證明EGCG 可通過抑制HIV-1 逆轉錄酶的活性發(fā)揮抗HIV 作用［22］。EGCG 還可通過抑制細胞內(nèi)內(nèi)涵體或溶酶體的酸化來降低流感病毒的感染率［23］。目前尚無EGCG 抑制?？刹《镜南嚓P文獻。

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs），是從細菌到哺乳動物中廣泛存在的類熱應急蛋白質。當有機體暴露于高溫環(huán)境會激發(fā)合成此種蛋白，以保護機體，許多熱休克蛋白具有分子伴侶活性。按照蛋白大小，熱休克蛋白共分為五類，分別為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60 以及小分子熱休克蛋白［19］。其中Hsp70 通過活化天然免疫細胞的方式參與天然免疫，通過調(diào)節(jié)抗原呈遞細胞對抗原的加工與呈遞，增強免疫應答，參與免疫球蛋白組裝，發(fā)揮對適應性免疫的影響，進而參與感染與免疫［20］。GAIE 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，隨著感染的發(fā)生Hsp70 會被轉運至病毒誘導包涵體中，與病毒N 蛋白和脂筏共定位。前期的研究［22］發(fā)現(xiàn)，Hsp70 在?？刹《靖腥局邪l(fā)揮一定的功能，可能是抑制?？刹《镜闹委煱悬c。

本研究中，研究了EGCG 的體外抑制ECHO 9的作用，證實其作為抗病毒藥物的治療潛力。EGCG 能使Hsp70 的轉錄本水平下調(diào)，在病毒感染細胞中亦能達到相同的效果；而病毒ECHO 9 的感染沒有使Hsp70 轉錄水平發(fā)生明顯的變化，這與之前的研究結果一致［22］。同時，在蛋白水平上，EGCG 的處理使得ECHO 9 感染前后的細胞中的Hsp70 的表達水平受到明顯抑制。因此，本研究推測，EGCG 具有良好抗ECHO 9 效果是通過抑制Hsp70 的蛋白表達，進而影響病毒感染中誘導的內(nèi)涵體和脂筏的形成，從而使病毒子代的產(chǎn)生受到影響。因此，本研究進一步通過qPCR、Western blot 和商業(yè)化RNA 干擾序列的轉染成功驗證了設想，即EGCG 可能是通過作用于Hsp70 實現(xiàn)抑制ECHO 9 病毒的增殖的。本研究中采用了直接測定藥物處理后細胞上清中病毒滴度的辦法測定藥物抗病毒效果。同時，結合細胞中病毒蛋白表達情況和基因轉錄情況，確認了EGCG 的抗ECHO 9效果及其初步的作用機制。

綜上所述，EGCG 在體外能有效抑制ECHO 9病毒，其作用機制可能是通過下調(diào)Hsp70 實現(xiàn)的。作為一種有效的天然茶多酚成分，有望用于?？刹《靖腥疽鸬暮粑兰膊〉念A防與治療。