袁玲 李嘉欣 魯玉梅 南一，3

寧夏醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院藥理學(xué)與毒理學(xué)系，2中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)系（銀川750004）；3回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（銀川750004）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是臨床常見的慢性腎功能衰竭的主要原因，近半數(shù)DN 患者最終進(jìn)展為終末期腎?。?］。腎功能受損后，隨著尿白蛋白排泄增加，腎小球細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）堆積，腎小球硬化及腎小管纖維化逐步加重［2］。臨床上以控制血糖和血壓為主要治療手段，但治療效果并不理想［3］。近年來(lái)，中醫(yī)藥在DN 的防治中起到了很好的輔助及有效的治療作用［4-5］，利用現(xiàn)代藥理學(xué)的研究手段和方法可進(jìn)一步闡明中醫(yī)藥的藥理作用機(jī)制。而微小RNA（microRNA，miRNA）的發(fā)現(xiàn)為DN 的分子機(jī)制研究提供了新的切入點(diǎn)［6］。多項(xiàng)臨床研究通過(guò)分析白蛋白/肌酐比率、腎小球?yàn)V過(guò)率及微量白蛋白，證實(shí)miR-192 可以反映DN 的發(fā)病機(jī)制［7］，并在DN 進(jìn)展過(guò)程中可作為生物標(biāo)志物［8］。miR-192 可能是腎臟病理改變過(guò)程中TGF-β1/Smads 信號(hào)傳導(dǎo)通路的重要下游介質(zhì)［9］，通過(guò)其特異性靶點(diǎn)直接與DN 病變聯(lián)系［10］。有學(xué)者通過(guò)在體及離體實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)某些與補(bǔ)腎功效相關(guān)的中藥可通過(guò)TGF-β1/Smad/miR-192 信號(hào)通路抑制系膜細(xì)胞過(guò)度增殖，減少腎臟ECM 堆積，改善腎纖維化的病理變化［11-12］，也有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)控miR-192 可有效的治療糖尿病腎?。?3］。

回回甘松飲（Hui-hui Gan-song Yin，HGY，國(guó)家發(fā)明專利：ZL201310205739.1），以“香藥”為用藥特色，藥物組成方面選用甘松、木香、藿香等芳香化濁的香藥。前期研究已發(fā)現(xiàn)在HGY 干預(yù)后，DN 大鼠的血糖、血脂、腎功能及腎臟的病理等指標(biāo)較DN 模型組均有顯著改善［14-15］，HGY 含藥血清對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞的活力和細(xì)胞周期均有影響，可通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smads 信號(hào)通路干預(yù)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞［16］，通過(guò)調(diào)控LncRNAPVT1 信號(hào)通路干預(yù)腎足細(xì)胞［17］，并可通過(guò)調(diào)控miR-21 改善自發(fā)性2 型糖尿病ZDF 大鼠早中期腎纖維化的損傷程度［18］。故本研究利用互聯(lián)網(wǎng)miRNA 軟件（TargetScan、miRanda 和PICTar 等）在線服務(wù)站點(diǎn)，通過(guò)預(yù)測(cè)作用靶基因，并結(jié)合NCBI檢索、綜合分析，研究HGY 對(duì)早期DN 大鼠miR-192 及相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控作用，以為臨床防治DN 提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，8 ～10周齡，體質(zhì)量（200±20）g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，SD 大鼠動(dòng)物許可證編號(hào)為SCXK（京）2011-0012。本次實(shí)驗(yàn)所使用的SD 大鼠以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》（國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)）要求。實(shí)驗(yàn)期間，大鼠自由飲水?dāng)z食。動(dòng)物飼養(yǎng)區(qū)域溫度設(shè)置為22 ～23 ℃，室內(nèi)相對(duì)濕度為55%～60%，空氣流通。

1.2 藥品與主要試劑回回甘松飲的藥物組成是按照已授權(quán)的國(guó)家發(fā)明專利（批準(zhǔn)文號(hào)為ZL201310205739.1）的配方和比例，包括甘松、藿香、茴香、丁香、木香、紅花、大黃、枸杞、人參、肉蓯蓉、菟絲子、松蕈、蘆薈，比例為10∶15∶12∶9∶6∶3∶5∶10∶5∶8∶15∶10∶5，中藥飲片由寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室經(jīng)水煎、過(guò)濾、濃縮后分別制成生藥濃度為0.5 g/mL 及1 g/mL 濃縮藥液。格列喹酮片（30 mg/片，國(guó)藥準(zhǔn)字：H10940258，北京萬(wàn)輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，產(chǎn)品批號(hào)為1120536）溶于蒸餾水后，制成格列喹酮濃度為1 mg/mL 的混懸液。鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)S0130）；枸櫞酸（北京化學(xué)試劑公司）；枸櫞酸三鈉（北京化學(xué)試劑公司）；定量PCR 及miRNA引物（北京閱微基因技術(shù)有限公司）；KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix（2X）試劑盒（美國(guó)KAPA Biosystems 公司，貨號(hào)KK4601）；TIANScript RT 試劑盒（天根生物科技有限公司，貨號(hào)KR104-02）；TGF-β1 抗體（美國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab92486）；Smad3 抗體（美國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab28379）；Smad7 抗體（美國(guó)Epitomics 公司，貨號(hào)3894-1）；SIP1 抗體（美國(guó)Santa 公司，貨號(hào)sc-48789）；GAPDH 抗體（美國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab9485）；Rnase 抑制劑（美國(guó)Invitrogen 公司，貨號(hào)AM2694）。

1.3 主要儀器XP205 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；TS-2000A 多用脫色搖床（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Fresco17 低溫冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；NAS-99 微量分光光度計(jì)（美國(guó)ACTGene 公司）；MultiSkan3 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；7900HT Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）。

1.4 模型制備以普通大鼠維持飼料（碳水化合物60%、蛋白質(zhì)22%、脂肪4%）喂養(yǎng)，1 周后，選取50 只健康狀況良好的大鼠，作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。隨機(jī)將其中的10 只大鼠作為空白對(duì)照組（NC），用普通大鼠維持飼料繼續(xù)喂養(yǎng)，其余40 只大鼠給予含糖44.4%、脂類22.3%、蛋白質(zhì)18.6%的高糖高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，禁食12 h，將上述40只大鼠腹腔注射STZ（55 mg/kg），NC 組的10只大鼠腹腔注射等量枸椽酸鈉緩沖液。DM 造模成功標(biāo)志為：STZ注射72 h 后，連續(xù)兩次隨機(jī)血糖值≥16.7 mmol/L。DM 大鼠以高糖高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)6 周，當(dāng)隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上、尿量為DM 造模前150%以上、MAU ＞400 μg/24 h、腎臟出現(xiàn)MogensenⅢ期病理改變時(shí)，說(shuō)明早期DN 大鼠造模成功。

1.5 動(dòng)物分組將早期DN 造模成功的大鼠隨機(jī)分為4 組：DN 模型組（DN）、HGY 高劑量組（DN+HH，10 g/kg）、HGY 低劑量組（DN+HL，5 g/kg）及格列喹酮組（DN+Gli，10 mg/kg），每組10 只大鼠。各給藥組的給藥量按照大鼠與人體表面積系數(shù)進(jìn)行換算（相當(dāng)于人用藥劑量的6 ～10 倍），并以等體積（10 mL/kg）的蒸餾水分別灌胃給予NC 組和DN 組，每日1次，連續(xù)灌胃8周，均以普通飼料喂養(yǎng)大鼠。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 Western blot 法檢測(cè)大鼠TGF-β1、Smad3、Smad7及SIP1蛋白的表達(dá)將腎皮質(zhì)均質(zhì)化，研磨后加入蛋白裂解液，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min。吸收蛋白質(zhì)溶液，并使用考馬斯亮藍(lán)（1∶4）定量檢測(cè)組織中TGF-β1、Smad3、Smad7 和SIP1 蛋白含量。將含有30 μg 蛋白的樣品在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離并電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜后，37 ℃封閉2 h。與特異性抗體在4 ℃孵育過(guò)夜，與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗IgG（1∶1 000）進(jìn)行反應(yīng)，顯影后，定量分析該條帶。

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）檢測(cè)大鼠miR-192的表達(dá)及TGF-β1、Smad3、Smad7、Zeb2 mRNA 的表達(dá)使用Trizol試劑（Invitrogen，USA）分離來(lái)自腎臟的總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（Thermo Scientific，Lithuania）將RNA 用于第一鏈cDNA 合成。使用熱循環(huán)儀（ABI system，USA）通過(guò)以下步驟進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：在94 ℃變性2 min，然后在94 ℃變性30 s，退火30 s 并在72 ℃下保持1 min，延伸30 個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，在72 ℃再延伸10 min 后結(jié)束PCR，通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物序列設(shè)計(jì)見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)Tab.1 PCR-primer design

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0軟件比較分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的方法，進(jìn)行多組間數(shù)據(jù)比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad3、Smad7、SIP1蛋白表達(dá)采用Western blot 方法檢測(cè)各組大鼠腎組織發(fā)現(xiàn)：與NC 組相比，DN 組大鼠TGF-β1 和Smad3 蛋白表達(dá)明顯增加（P＜0.01），而Smad7 和SIP1 蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.01）；與DN 組相比，給予HGY 及格列喹酮干預(yù)后，大鼠TGF-β1 水平顯著下降（P＜0.01），Smad7 和SIP1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01 或0.05），HGY 與格列喹酮組結(jié)果趨勢(shì)相近，見圖1。

2.2 各組大鼠腎組織miR-192 及Zeb2、TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA 表達(dá)與NC 組相比，DN 組大鼠腎組織中miR-192、TGF-β1 mRNA 及Smad3 mRNA 的表達(dá)顯著增加（P＜0.01），而Zeb2 mRNA和Smad7 mRNA的表達(dá)顯著減少（P＜0.01）。與DN組相比，進(jìn)行HGY 和格列喹酮干預(yù)后，大鼠Zeb2和Smad7 mRNA 的表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01），miR-192 及TGF-β1、Smad3 mRNA 的表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05），HGY 與格列喹酮對(duì)照組作用趨勢(shì)相近，見圖2。

圖1 各組大鼠腎組織TGF-β1、Smad3、Smad7、SIP1 蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of TGF-1，Smad3，Smad7 and SIP1 proteins in renal tissues of rats in each group

圖2 各組大鼠腎組織miR-192、Zeb2mRNA、TGF-β1mRNA、Smad3mRNA、Smad7mRNA 表達(dá)Fig.2 Expressions of mir-192，Zeb2mRNA，TGF-1mRNA，Smad3mRNA and Smad7mRNA in renal tissues of rats in each group

3 討論

DN 的病因非常復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，本研究以高糖高脂高熱量飲食誘發(fā)大鼠胰島素抵抗，通過(guò)注射大劑量的STZ，一次性破壞胰島功能，復(fù)制DM 模型，再繼續(xù)喂以高糖高脂高熱量飲食，導(dǎo)致腎臟并發(fā)癥出現(xiàn)，其發(fā)病過(guò)程和特征與人類DN 相似。

在DN 發(fā)病過(guò)程中，腎組織中ECM 的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子TGF-β1 的含量會(huì)明顯增加［19］，它既可以刺激和增加ECM 蛋白的合成［20］，還可以減少ECM 的降解［21］。二聚體形式的TGF-β1 具有生物活性，且表現(xiàn)最為活躍［22］。Smads 蛋白在TGF-β受體下游，是其重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。在DN 發(fā)生過(guò)程中［23］：Smad2或Smad3磷酸化后發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用，Smad7在TGF-β1/Smads 信號(hào)通路中主要發(fā)揮著負(fù)性調(diào)控作用，Smad3 的磷酸化作用可以被Smad7 所抑制。Smad 相互作用蛋白1（Smad interacting Protein l，SIP1），其基因名稱為Zeb2，它可以和Smad1、Smad5、Smad3、Smad2 及Smad7 結(jié)合，并發(fā)生相互作用，它也是TGF-β家族成員的基因轉(zhuǎn)錄抑制因子［24］。

本研究發(fā)現(xiàn)在HGY干預(yù)后，DN大鼠腎臟TGFβ1的表達(dá)受到抑制，Smad3的表達(dá)降低，Smad7的表達(dá)升高。如前所述，調(diào)控TGF-β1/Smads 信號(hào)通路可有效的抑制或減少ECM 的堆積，這就不難解釋在早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中的結(jié)果［14］：HGY 可以一定程度上延緩和減輕DN 大鼠早期出現(xiàn)的腎小球肥大，腎小球基底膜增厚，腎小囊腔變窄，系膜區(qū)增寬，系膜基質(zhì)彌漫性增生等腎臟病理改變。我們?cè)谇捌陔x體實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)［25］：HGY 含藥血清可以干預(yù)調(diào)控高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞中纖維連接蛋白及Ⅰ型、Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)水平，這些蛋白是ECM 的主要成分，因而本研究結(jié)果與前期離體實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果是一致的。

miRNA 的發(fā)現(xiàn)為研究DN 的分子機(jī)制提供了新的切入點(diǎn)。KATO 等［26］人最早研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-192 在腎小球系膜細(xì)胞中表達(dá)，對(duì)腎小球系膜細(xì)胞起到至關(guān)重要的作用。miR-192 是在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中最早被發(fā)現(xiàn)且表達(dá)量最多的miRNA 之一。對(duì)靶序列綜合分析后發(fā)現(xiàn)：Zeb2 是miR-192 預(yù)測(cè)的靶基因［27］。更有趣的是，SIP1 又是Zeb2 在蛋白水平的表達(dá)形式，所以SIP1 是miR-192的一個(gè)靶標(biāo)，miR-192 負(fù)調(diào)節(jié)Zeb2，Zeb2 正調(diào)節(jié)SIP1。miR-192 可通過(guò)其特異性靶點(diǎn)直接與DN 病變聯(lián)系，顯示了雙重作用，即：可能通過(guò)“TGF-β1/Smad 信號(hào)通路”（ECM 堆積）和“TGF-β1/CTGF 信號(hào)通路”（E-cadherin 堆積）兩條信號(hào)通路來(lái)延緩2型DN 的進(jìn)展，保護(hù)腎功能［28］。

HGY 干預(yù)后，SIP1 表達(dá)增多，而SIP1 是作用于Smads 之間的蛋白，Smads 蛋白反向抑制TGF-β1 表達(dá)，這樣就形成了一個(gè)以SIP1 為核心因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究發(fā)現(xiàn)，HGY 干預(yù)后，miR-192 表達(dá)降低，Zeb2 表達(dá)升高，并對(duì)TGF-β1/Smads 信號(hào)通路發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，推測(cè)可能與miR-192 與靶基因Zeb2 結(jié)合相關(guān)，通過(guò)SIP1 蛋白有效介導(dǎo)TGFβ1/Smads 信號(hào)通路，發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用，HGY 的這種藥理機(jī)制與改善和治療DN 的一些藥物具有相似之處［29］。HGY 的藥物組成多為含有揮發(fā)油成分的香藥，這種治療方法曾在幾千年前的《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)》奇病論關(guān)于消渴（糖尿?。┑闹委熤刑岢鲞^(guò)，但在近代并不多見。所以本研究的發(fā)現(xiàn)，不僅可以為臨床改善和治療DN 提供合理有效的藥物，而且為深入研究中醫(yī)藥理論有關(guān)糖尿病的治法“治之以蘭，除陳氣也”開拓思路，提供研究基礎(chǔ)。

盡管本研究結(jié)果可以合理解釋HGY 前期的藥理作用，但本研究所采用的動(dòng)物模型屬于化學(xué)藥物損傷方法，相對(duì)于疾病本身存在著局限性。故在充分論證本研究結(jié)果基礎(chǔ)上，我們有理由在后續(xù)的研究中應(yīng)用自發(fā)性DM 模型，如：Zucker 大鼠、GK 大鼠等進(jìn)一步驗(yàn)證HGY 的藥效及藥理機(jī)制，并合理借鑒KATO 等［30］的研究方法，進(jìn)一步論證HGY的藥理作用。