蔡文臣 張?jiān)妳R 魏中秋 靳馥宇 李雅倩 李田 徐洪 楊方

華北理工大學(xué)1公共衛(wèi)生學(xué)院，2臨床醫(yī)學(xué)院，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（河北唐山063210）

塵肺病是我國(guó)最嚴(yán)重的職業(yè)病，對(duì)其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制與防治研究一直是職業(yè)病研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題［1-3］。課題組前期通過高通量測(cè)序技術(shù)，篩選到一些與矽肺發(fā)生發(fā)展有關(guān)的mRNA，并發(fā)現(xiàn)分泌性磷蛋白1（secretory phosphoprotein，SPP1）在矽肺模型組的差異表達(dá)具有代表性。研究表明，SPP1 的高表達(dá)與器官纖維化進(jìn)展關(guān)系密切，其可通過激活轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）信號(hào)促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化和Ⅰ型膠原（collagen type I，COL I）表達(dá)［4-6］，對(duì)SPP1 的阻斷可能是治療肺纖維化的潛在靶點(diǎn)［7-9］。課題組多年來一直研究N-乙?；?絲氨酰-天門冬酰-賴氨酰-脯氨酰（N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP）的抗器官纖維化作用機(jī)制［10-12］，因此本研究擬通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，觀察SPP1 在矽肺纖維化中的作用模式以及Ac-SDKP 能否通過調(diào)節(jié)SPP1/TGF-β1 信號(hào)拮抗矽肺纖維化。為獲得矽肺纖維化作用靶點(diǎn)提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑動(dòng)式染塵自動(dòng)控制系統(tǒng)（天津開發(fā)區(qū)合普工貿(mào)有限公司）；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）；二氧化硅（silicon dioxide，SiO2）（美國(guó)Sigama 公司），Ac-SDKP（瑞士Bachem AG 公司），SPP1 重組蛋白（10352-H08H，北京Sino Biological 公司），COLⅠ（ab34710，美國(guó)Abcam 公司），SPP1（AF0227，美國(guó)Affinity 公司），巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）（DF7577，美國(guó)Affinity 公司）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Ⅰ型受體（TGF-β receptor typeⅠ，TGFβRⅠ）（A16983，美國(guó)ABclonal公司）；TGFβR Ⅱ（ARG59501，上海Arigo 公司）；Smad2/3（5678，美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；磷酸化Smad2/3（phosphate Smad2/3，p-Smad2/3）（8828s，美國(guó)Cell Signaling Technology 公司）；α-微管蛋白（alpha tubulin antibody，α-Tubulin）（美國(guó)Affinity 公司）；PV6000 通用型兩步法免疫組化試劑（北京中杉公司）；山羊抗兔、抗鼠二抗（美國(guó)KPL公司）；ECL 顯色試劑盒（北京莊盟生物公司）；蘇木精染色液（珠海貝索公司）。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠［（180 ±10）g，3 周齡］于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心潔凈級(jí)動(dòng)物房［SYXK（冀）2015-0038］飼養(yǎng)。采用HOPE-MED8050 動(dòng)式染塵構(gòu)建矽肺大鼠模型，其中對(duì)照組吸入純凈氣，模型組吸入50 μg/m3SiO2，3 h/d，5 d/周［10-12］。實(shí)驗(yàn)分組為（n= 18）：（1）對(duì)照組：吸入純凈氣16 周后，腹腔內(nèi)埋入含有生理鹽水的微量緩釋膠囊；（2）染塵組：動(dòng)式染塵至16 周后，腹腔內(nèi)埋入含有生理鹽水的微量緩釋膠囊；（3）Ac-SDKP 治療組：動(dòng)式染塵至16 周后，在大鼠腹腔內(nèi)埋入含有Ac-SDKP［800 μg/（kg·d）］的微量緩釋膠囊，均于24 周處理動(dòng)物。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和處理小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7在37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中用Ham′s F-12K 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)分組為：（1）對(duì)照組：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；（2）SiO2誘導(dǎo)組：無血清培養(yǎng)條件下，給予200 μg/mL 的SiO2培養(yǎng)基誘導(dǎo)24 h；（3）Ac-SDKP處理組：無血清培養(yǎng)條件下，先給予10-8mol/L Ac-SDKP 誘導(dǎo)1 h，再加入SiO2（200 μg/mL）/SPP1 重組蛋白（1 μg/mL）誘導(dǎo)24 h。（4）SPP1 重組蛋白誘導(dǎo)組：無血清培養(yǎng)條件下，給予1 μg/mL 的SPP1 重組蛋白誘導(dǎo)24 h；（5）LY364947 抑制劑組：無血清培養(yǎng)條件下，先給予LY364947 抑制劑（59 nmol/L）培養(yǎng)1 h，再加入1 μg/mL的SPP1重組蛋白誘導(dǎo)24 h。

1.4 免疫組織化學(xué)染色石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，常規(guī)制備細(xì)胞爬片。切片經(jīng)高壓修復(fù)，3%的H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶室溫孵育15 min。滴加兔抗SPP1（1∶100），4 ℃過夜；滴加羊抗兔/小鼠免疫球蛋白G（1∶500）37 ℃孵育30 min，免疫組織化學(xué)顯色試劑盒顯色，鏡下控制，常規(guī)復(fù)染，脫水透明，中性樹脂封片，顯微鏡掃描。

1.5 免疫印跡法提取肺組織和RAW264.7 細(xì)胞蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取10 ～20 μg蛋白進(jìn)行常規(guī)電泳和電轉(zhuǎn)，一抗COL I（1∶800），MCP-1（1∶1 000），TGFβR I（1∶1 000），TGFβRII（1∶1 000），p-Smad2/3（1∶500），Smad2/3（1∶500）和SPP1（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜，山羊抗兔或抗小鼠二抗（1：5 000）孵育30 min。使用ECL發(fā)光試劑于ECLTM蛋白檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)，使用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)量平均光密度。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白α-Tubulin 的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ac-SDKP 抑制矽肺大鼠中SPP1 的表達(dá)如圖1 所示，IHC 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，矽肺模型組中有較大的矽結(jié)節(jié)形成，結(jié)節(jié)中可見SPP1 陽性表達(dá)細(xì)胞的分布。與矽肺模型組比較，Ac-SDKP處理組的病變程度明顯減輕，SPP1 陽性表達(dá)減少。

圖1 SPP1 在Ac-SDKP 處理的染塵大鼠肺組織中的分布與表達(dá)（×200）Fig.1 The distribution and expression of SPP1 in Ac-SDKP treated silicosis rats lung tissues（×200）

Western blot 結(jié)果顯示（圖2），與對(duì)照組比較，矽肺模型組中COL I、MCP-1、TGF-β1 和SPP1 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。與矽肺模型組比較，Ac-SDKP 處理組中COLⅠ、MCP-1、TGF-β1 和SPP1 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

2.2 Ac-SDKP 抑制SPP1 在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)IHC 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，SiO2誘導(dǎo)組中可見SPP1 陽性表達(dá)，與SiO2誘導(dǎo)組比較，Ac-SDKP 處理組中SPP1 陽性表達(dá)減少。

Western blot 結(jié)果顯示（圖4、5），與對(duì)照組比較，SiO2誘導(dǎo)組中COL I、MCP-1、TGF-β1 和SPP1的蛋白表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與SiO2誘導(dǎo)組比較，Ac-SDKP 處理組中COL I、MCP-1、TGF-β1 和SPP1表達(dá)降低（P＜0.05）。

2.3 Ac-SDKP抑制SPP1/TGF-β1信號(hào)通路如圖6 所示，與對(duì)照組比較，SPP1 誘導(dǎo)組中TGFβRII、TGFβRI、p-Smad2/3 和SPP1 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），與SPP1誘導(dǎo)組比較，Ac-SDKP處理組和LY364947 處理組中TGFβRII、TGFβRI、p-Smad2/3和SPP1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

3 討論

圖2 COL I、MCP-1、TGF-β1 和SPP1 蛋白在Ac-SDKP 處理的染塵大鼠肺組織中的表達(dá)（n=3）Fig.2 The expression of COL I，MCP-1，TGF-β1 and SPP1 in Ac-SDKP treated silicosis rats lung tissues（n=3）

圖3 SPP1 在Ac-SDKP 處理的RAW264.7 細(xì)胞中的表達(dá)（×200）Fig.3 The expression of SPP1 in Ac-SDKP treated RAW264.7 cells（×200）

圖4 COL I、MCP-1、TGF-β1 和SPP1 蛋白在Ac-SDKP 處理的RAW264.7 細(xì)胞中的表達(dá)（n=3）Fig.4 The expression of COL I，MCP-1，TGF-β1 and SPP1 in Ac-SDKP treated RAW264.7 cells（n=3）

圖5 TGF-β1 和SPP1 蛋白在Ac-SDKP 處理的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中的表達(dá)（n=3）Fig.5 The expression of TGF-β1 and SPP1 in Ac-SDKP treated RAW264.7 cells medium（n=3）

圖6 TGFβRII、TGFβRI、p-Smad2/3 和SPP1 在Ac-SDKP、LY364947 處理的給予SPP1 重組蛋白的巨噬細(xì)胞中的表達(dá)（n=3）Fig.6 The expression of TGFβRII，TGFβRI，p-Smad2/3，SPP1 in Ac-SDKP and LY364947 treated RAW264.7 cells with SPP1 recombinant protein（n=3）

課題組前期利用動(dòng)式染塵大鼠模型進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)了一些與矽肺纖維化進(jìn)展有關(guān)的mRNA 與非編碼RNA［12］，綜合差異變化倍數(shù)和豐度，發(fā)現(xiàn)SPP1 基因表達(dá)差異在實(shí)驗(yàn)性矽肺模型中具有代表性。SPP1 與心血管疾病、腫瘤、糖尿病、腎病關(guān)系密切，具有多種生物學(xué)功能，主要參與調(diào)控炎癥，介導(dǎo)骨代謝和損傷修復(fù)，在調(diào)控巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞、破骨細(xì)胞功能等方面發(fā)揮了重要作用［13］。近年來發(fā)現(xiàn)，SPP1 在博來霉素介導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化模型［7-8］、石棉肺小鼠模型［14］、輻照所致的肺間質(zhì)纖維化模型［15］中表達(dá)均上調(diào)，提示SPP1在肺纖維化進(jìn)展中可能起到了一定的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，在動(dòng)式染塵矽肺大鼠模型以及體外SiO2誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中，SPP1 均顯著上調(diào)，IHC 結(jié)果也顯示，SPP1 主要表達(dá)于矽肺結(jié)節(jié)內(nèi)，且SiO2誘導(dǎo)后RAW264.7 細(xì)胞中SPP1 陽性染色明顯增強(qiáng)，提示SPP1 可能參與了矽肺纖維化的進(jìn)展。

在體外培養(yǎng)的來源于肝、皮膚和肺的成纖維細(xì)胞中，均發(fā)現(xiàn)SPP1能夠激活TGF-β1信號(hào)，從而促進(jìn)了肌成纖維細(xì)胞分化，加速了纖維化進(jìn)程；SPP1 能夠通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases 9，MMP9）的表達(dá)，進(jìn)而激活TGF-β1，從而促小鼠成纖維細(xì)胞的膠原沉積［4-6，17-19］。本研究也發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)性矽肺模型中，SPP1/TGF-β1 信號(hào)的激活伴隨著膠原沉積和巨噬細(xì)胞活化。已有研究顯示，采用單細(xì)胞RNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn)，特發(fā)性肺纖維化中巨噬細(xì)胞亞群高表達(dá)SPP1［19］，且在纖維化過程中隨著炎癥和纖維化程度的加深，SPP1 的表達(dá)逐漸升高［7］，說明SPP1 可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化并產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子［9，20］。在本研究中，予以SiO2誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中均檢測(cè)到SPP1/TGF-β1 表達(dá)的增高；進(jìn)一步采用SPP1重組蛋白誘導(dǎo)，可發(fā)現(xiàn)TGF-β1 信號(hào)的活化，予以TGF-β1 信號(hào)通路抑制劑則引起相反變化，提示SiO2能夠刺激巨噬細(xì)胞分泌SPP1，進(jìn)而活化TGFβ1 信號(hào)，參與了肺纖維化進(jìn)展。

課題組對(duì)Ac-SDKP 的抗矽肺纖維化作用進(jìn)行了系列研究［21-23］，發(fā)現(xiàn)其能夠通過抑制巨噬細(xì)胞活化和肌成纖維細(xì)胞分化，保護(hù)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞從而拮抗矽肺纖維化進(jìn)展。本研究中，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均提示，予以Ac-SDKP 能夠抑制矽肺大鼠和體外RAW264.7 細(xì)胞中SPP1 表達(dá)水平的上調(diào)，并具有類似TGF-β1 信號(hào)通路抑制劑的作用，能夠阻斷SPP 對(duì)TGF-β1 信號(hào)的激活作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Ac-SDKP 通過對(duì)SPP1/TGF-β1 信號(hào)的阻斷，抑制了巨噬細(xì)胞的活化，然而其具體作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究探討。