張嵐，劉法昱，吳楠

（中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院·附屬口腔醫(yī)院，遼寧省口腔疾病重點實驗室 1.院內感染管理辦公室；2.口腔頜面外科，沈陽 110002）

PRDM家族蛋白廣泛存在于嚙齒動物、靈長類、鳥類和兩棲動物體內。其中一部分能夠影響表觀遺傳，其蛋白鋅指結構可以識別DNA、RNA和蛋白；另一部分PRDM家族成員可以影響原始生殖細胞特化、癌癥發(fā)生、造血、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等［1-2］。

據(jù)文獻［3］報道，PRDM在靈長類中包含17個成員，在嚙齒動物、鳥類、兩棲動物中有16個，而在真菌與植物中未被檢測到。同時，這些成員各不相同［4］。最近的研究［5-7］發(fā)現(xiàn)，沉默PRDM14基因可以抑制乳腺癌的發(fā)生和轉移；PRDM13可以通過某種機制發(fā)揮抑癌作用；PRDM16會影響癌癥的發(fā)生。PRDM15通過轉錄調控WNT和MAPK-ERK信號維護小鼠胚胎干細胞初始狀態(tài)。然而，PRDM15在腫瘤中的作用機制尚不明確，因此，本研究擬探討PRDM15在頭頸鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）中的表達及其對HNSCC患者臨床預后的影響，旨在為深入研究其在HNSCC發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移中的作用和尋找精確、高效的生物標志物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

100例標本均來自2014年至2015年于中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院進行手術并經(jīng)病理確診為HNSCC的患者。其中，男58例，女42例；年齡范圍32～70歲。病灶和正常組織均保存完整，癌旁組織為距癌灶3 cm外且無癌細胞浸潤的組織。將HNSCC組織設為C組，癌旁組織設為N組。

1.2 免疫組化染色

根據(jù)染色強度和所觀察到陽性細胞數(shù)量按照百分比計算分數(shù)。判別陽性細胞的標志為切片中細胞核染色深淺，從淡黃至棕褐色且以大多數(shù)細胞呈現(xiàn)的顏色為準計分。無顏色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計為0分、1分、2分和3分。某類細胞的5個視野內陽性細胞的平均數(shù)量即為陽性細胞百分比。0～5%、＞5%～25%、＞25%～50%、＞50%～75%、＞75%分別計為0分、1分、2分、3分和4分，每張切片隨機取5個400倍視野，每個視野均進行染色強度與陽性細胞百分比的乘積。評分為0分、1～4分、5～8分、9～12分依次計為陰性（-）、弱陽性（+）、中度陽性（++）和強陽性（+++）。

1.3 Western blotting檢測

用冷PBS清洗新鮮組織標本3次，去除血細胞。放入500 μL冷RIPA裂解液，用剪刀將組織剪碎，置于冰上研磨并靜置20 min后，4 ℃，12 000g離心20 min。吸上清，去除沉淀。取上清，利用考馬斯亮藍測定法測定蛋白質含量，取30 μg總蛋白在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上進行分離。將硝酸纖維素膜在轉移溶液中平衡10 min并用TTBS洗滌3次，每次持續(xù)5 min，轉膜，在含有5%脫脂牛奶中常溫封閉2 h，并在4 ℃下用anti-PRDM15或者anti-GAPDH孵育過夜，TBST清洗膜，室溫下二抗孵育1 h。ECL底物發(fā)光檢測蛋白表達。用Image J軟件對蛋白表達條帶光密度值進行測量分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。組間差異比較應用Two-tailed Student’st檢驗。組間比較采用配對t檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HNSCC組織中PRDM15蛋白的表達水平

采用Western blotting檢測20例HNSCC患者癌旁和癌組織中PRDM15蛋白的表達水平，結果顯示，有9例癌組織中PRDM15蛋白表達高于癌旁組織，采用Image J分析PRDM15和GAPDH蛋白條帶的灰度值，校正后進行統(tǒng)計分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖1。

2.2 HNSCC癌中PRDM15的表達與定位

圖1 PRDM15蛋白在HNSCC組織中的表達Fig.1 PRDM15 protein expression in HNSCC

應用免疫組化對100例HNSCC患者的癌旁及癌組織中PRDM15的表達及定位進行檢測。PRDM15在HNSCC患者的癌旁組織中表達為陰性，在癌組織中高表達，主要表達于細胞核，在細胞質中有少量表達，見圖2。graphpad統(tǒng)計分析結果表明，PRDM15在癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖3。

2.3 PRDM15在HNSCC中的表達水平與預后的關系

根據(jù)免疫組化半定量分析方法，將47例PRDM15弱陽性病例歸為低表達組，將53例PRDM15中度陽性和強陽性病例歸為PRDM15高表達組。生存曲線分析顯示，PRDM15高表達的HNSCC患者生存時間與PRDM15低表達的患者相比明顯縮短（P=0.017），提示PRDM15可能是患者預后生存的重要生物學標志物。見圖4。

圖2 免疫組化檢測HNSCC組織中PRDM15的表達和定位Fig.2 Immunohistochemical analysis of the expression and localization of PRDM15 in HNSCC

圖3 HNSCC組織中PRDM15的表達情況Fig.3 PRDM15 expression in HNSCC tissues

圖4 生存曲線分析Fig.4 Survival curve analysis

3 討論

HNSCC在頭頸部惡性腫瘤中最為常見，每年全世界病例在50萬～60萬以上，由此導致的死亡人數(shù)超過37萬［8］。HNSCC腫瘤細胞侵襲能力較強，臨床上常見復發(fā)與轉移。雖然相關的診斷及治療方法不斷進步，但35%～55%的HNSCC患者在確診后2年內會出現(xiàn)局部復發(fā)及遠處轉移，其5年生存率為34%～68%［9-11］。

有文獻［12-14］報道，PRDM家族是調控表觀遺傳的蛋白，其家族成員的功能不盡相同，其中PRDM13、PRDM14、PRDM16與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關。PRDM15作為MAPK-ERK和WNT通路的轉錄調控因子，調節(jié)其信號上游因子的轉錄，從而保護胚胎干細胞的多能性［7］。Western blotting檢測結果顯示，PRDM15在癌組織中表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義。說明PRDM15可能與HNSCC的惡性增殖或腫瘤的形成有關，參與調節(jié)腫瘤生物學行為及惡性轉化。生存曲線分析結果顯示，與PRDM15低表達的HNSCC患者相比，PRDM15表達增高的HNSCC患者生存時間明顯縮短。

本研究首次發(fā)現(xiàn)PRDM15在HNSCC中表達明顯增高，高表達PRDM15的HNSCC患者生存時間明顯短于低表達患者。為后續(xù)對PRDM15在HNSCC發(fā)生、發(fā)展及其在腫瘤增殖和侵襲轉移中作用機制的深入研究提供了理論依據(jù)，并為實現(xiàn)HNSCC的精準診療提供了新的治療靶點。

綜上，PRDM15可能是HNSCC患者組織細胞中的關鍵致病性癌基因，其表達水平與腫瘤的狀態(tài)息息相關，有可能成為HNSCC患者的一個新的預后和治療的生物標志物。