陳果，曲衍杰，任桓質(zhì)，于柏，張玉剛，祝軍，侯鴻敏

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/青島市園藝植物遺傳改良與育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266109；2.萊陽(yáng)市照旺莊鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，山東煙臺(tái) 265200)

葡萄(Vitisvinifera)是我國(guó)最重要的經(jīng)濟(jì)果樹之一，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在自然條件下，植物體無(wú)法隨意的移動(dòng)，其生存環(huán)境是相對(duì)固定的，因此，高鹽條件成為了干擾植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素之一[1]。現(xiàn)如今，土地鹽堿化的不斷加重，嚴(yán)重影響葡萄的產(chǎn)量和以葡萄為原料的加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)研究表明，全球鹽堿地總面積已超過9.5億hm2，其中我國(guó)的鹽堿地面積總計(jì)約為9 900萬(wàn)hm2[2]。所以，植物體為了維持自身在逆境條件下的正常生長(zhǎng)與發(fā)育，通過建立不同的脅迫響應(yīng)機(jī)制來抵抗各種逆境條件[3]。近年來，已有相關(guān)研究表明，當(dāng)植物體受到不同的逆境脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，在抗逆應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮作用[4]。

Squamosa啟動(dòng)子結(jié)合蛋白(Squamosa promoter Binding Protein, SBP)最初是從金魚草(Antirrhinummajus)中分離出來的一類轉(zhuǎn)錄因子。因?yàn)镾BP基因都擁有一個(gè)SBP保守結(jié)構(gòu)域，所以被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄因子[5]。SBP保守結(jié)構(gòu)域是一個(gè)高度保守的DNA結(jié)合域[6-7]，大約由79個(gè)氨基酸殘基組成，包括兩個(gè)相互作用且缺一不可的鋅指結(jié)構(gòu)，N端為Cys-Cys-His-Cys，C端為Cys-Cys-Cys-His或Cys-Cys-Cys-Cys[8],并且能與順式作用元件TNCGTACAA結(jié)合，其核心序列為GTAC[9]。該基因已陸續(xù)從擬南芥[10]、白樺樹[11]、衣藻[12]、苔蘚[13]、番茄[14]、水稻[15]中分離出來。前期大量的研究表明SBP基因在調(diào)控植物開花時(shí)間[16-19]、葉片發(fā)育[20-22]、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[23-24]、果實(shí)著色和成熟[25-26]等諸多方面起著重要作用。

近年來，也有一些關(guān)于該轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫[27-29]方面的功能逐漸被關(guān)注。2014年，Cui等[30]發(fā)現(xiàn)，SPL9基因被miR156下調(diào)后，參與了擬南芥響應(yīng)鹽和干旱脅迫的反應(yīng)；2015年Tan等[31]發(fā)現(xiàn)SBP基因在白菜中可以響應(yīng)各種激素處理及非生物脅迫；類似的，2016年Song等[32]的研究也證明了該基因在菊花中同樣具有響應(yīng)激素處理及非生物脅迫的功能；2017年Arshad等[33]發(fā)現(xiàn)MicroRNA156通過降低SBP基因的表達(dá)量改善了轉(zhuǎn)基因苜蓿干旱、鹽脅迫耐性；2018年Hou等[34]通過擬南芥的異源表達(dá)證明了某些葡萄SPL基因的耐鹽功能；2019年Wang等[35]通過整合miRNA-Seq和RNA-Seq數(shù)據(jù)研究了miR156/SPL模塊在耐鹽性中的作用；2020年Zhang等[27]的研究發(fā)現(xiàn)CaSBP12基因的過表達(dá)提高了辣椒對(duì)鹽脅迫的敏感性。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將葡萄VpSBP3轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中異源表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，并通過非生物脅迫及生理指標(biāo)的測(cè)定初步明晰VpSBP3轉(zhuǎn)錄因子在葡萄抗逆性方面的功能。該研究在擴(kuò)大葡萄栽培面積、增加葡萄產(chǎn)量、提高葡萄品質(zhì)方面有著一定的意義，為以后SBP家族基因在葡萄抗逆性方面的研究奠定了前期理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試材選用‘白河35-1’(Vitispseudoreticulata‘Baihe-35-1’)葡萄株系, 擬南芥(Arabidopsisthaliana)哥倫比亞CO、克隆載體pGEM-T、pCAMBIA2300質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1VpSBP3基因的克隆

本試驗(yàn)參照原平皓植物RNA快速提取試劑盒說明書，采用液氮研磨法提取‘白河35-1’葉片RNA，用DNaseⅠ處理總RNA，參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成，具體試驗(yàn)步驟參照沙婷[36]的實(shí)驗(yàn)方法。根據(jù)歐洲葡萄SBP基因的同源序列設(shè)計(jì)特異引物，設(shè)計(jì)帶有XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)的引物，上游引物為F：5′-GGCTCTAGAATGGGCTATAATCTGAAGAC-3′XbaⅠ，下游引物為R：5′-GGTACCCTACTCCCAAGAGAACGAGA-3′KpnⅠ。以‘白河35-1’葉片cDNA為模板擴(kuò)增獲得VpSBP3目的片段，送TaKaRa公司測(cè)序。

1.2.2VpSBP3基因組DNA序列的擴(kuò)增

本試驗(yàn)參照林延翔[37]的實(shí)驗(yàn)步驟，利用天根公司的DNA提取試劑盒，通過液氮研磨法提取‘白河35-1’葉片總DNA。然后，參照侯鴻敏[38]的擴(kuò)增反應(yīng)體系，以‘白河35-1’葉片總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的獲得

利用雙酶切法將VpSBP3基因連接到載體pCAMBIA2300-35，測(cè)序后將陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pCAMBIA2300-35S-VpSBP3。將其和pCAMBIA2300-35S空載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花絮浸潤(rùn)法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得T0代種子。在含40 mg·L-1卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上對(duì)T0代種子進(jìn)行篩選，正常生長(zhǎng)的苗子確定為轉(zhuǎn)化陽(yáng)性苗。

將對(duì)照和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子置于4 ℃冰箱中春化3～4 d后，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒處理，然后用移液槍點(diǎn)播在MS+150 mmol·L-1氯化鈉(NaCl)培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)16 h、黑暗培養(yǎng)8 h。最終選取在培養(yǎng)基中與對(duì)照表型有差異的轉(zhuǎn)基因株系作為試驗(yàn)材料。

1.2.4 鹽脅迫處理下轉(zhuǎn)基因株系萌發(fā)率及根長(zhǎng)測(cè)定

將T3代轉(zhuǎn)基因株系、空載體pCAMBIA2300對(duì)照和野生對(duì)照的種子置于4 ℃冰箱中春化3～4 d后，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行消毒處理，然后分別用移液槍點(diǎn)播在MS和MS+150 mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)基上，置于光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)16 h、黑暗培養(yǎng)8 h。每2 d觀察并統(tǒng)計(jì)一次對(duì)照與轉(zhuǎn)基因株系的萌發(fā)率，直到萌發(fā)率趨于穩(wěn)定。同時(shí)把MS和MS+150 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基豎放在培養(yǎng)皿架上，生長(zhǎng)15 d后，觀察并記錄根長(zhǎng)。該試驗(yàn)分別進(jìn)行3次生物學(xué)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.5 失水率及電解質(zhì)滲漏測(cè)定

用150 mmol·L-1NaCl分別對(duì)正常生長(zhǎng)的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系進(jìn)行脅迫處理。7 d后分別取0.1 g表型一致的對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系葉片進(jìn)行電導(dǎo)率的測(cè)定。 首先將所取樣品分別置入含有50 mL蒸餾水的試管中，靜置3～5 h后，用電導(dǎo)儀測(cè)其電導(dǎo)值R1，測(cè)定結(jié)束后將該樣品繼續(xù)放入90 ℃水浴鍋中30 min，冷卻到室溫，測(cè)其電導(dǎo)值R2，利用公式R1/R2分別計(jì)算其相對(duì)電導(dǎo)值[39]。該試驗(yàn)分別進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.6 丙二醛含量的測(cè)定

用200 mmol·L-1NaCl處理轉(zhuǎn)基因和對(duì)照株系的盆栽苗，一周后取0.2 g葉片，參照 Dhindsa等[40]的實(shí)驗(yàn)方法，利用分光光度計(jì)測(cè)定丙二醛的含量。該試驗(yàn)分別進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 VpSBP3基因的克隆及序列分析

以‘白河35-1’葉片DNA和總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為模板，用VpSBP3的特異引物擴(kuò)增，分別獲得約1 200 bp 和3 200 bp大小的條帶(圖1)。將VpSBP3基因連接到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行測(cè)序，在http://www.ncbi.nlm.nih. gov/ Structure/cdd/wrpsb.cgi上進(jìn)行cDNA序列分析。分析表明，VpSBP3基因含有一個(gè)大小為1 170 bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)含有390個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。通過InterProScan蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)來鑒定該基因的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明VpSBP3基因含有一段高度保守的雙向核定位序列和一個(gè)完整的SBP-domain結(jié)構(gòu)域(PF03110)(圖2)。DNA序列分析發(fā)現(xiàn)VpSBP3基因的DNA序列長(zhǎng)度為3 200 bp，其中3個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為408、138、624 bp；2個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為1 884、146 bp，其排列的相對(duì)位置見圖2。

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的獲得

通過花絮浸潤(rùn)法，將含有pCAMBIA2300-35S-VpSBP3質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，獲得T0代種子。將消毒后的T0代種子鋪在含40 mg·L-1卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的篩選。結(jié)果表明非轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在選擇培養(yǎng)基上逐漸白化死亡，而轉(zhuǎn)基因植株可以正常生長(zhǎng)(圖3A)。將野生對(duì)照WT和不同轉(zhuǎn)基因株系擬南芥T3代種子用移液槍點(diǎn)播在提前配制并滅菌MS+150 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上，春化后在光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)正常培養(yǎng)5 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的轉(zhuǎn)基因株系均對(duì)鹽脅迫敏感。最終選取在培養(yǎng)基中與對(duì)照表型差異最明顯的轉(zhuǎn)基因株系VpSBP3-26和VpSBP3-42作為后續(xù)研究材料 (圖3B)。

2.3 VpSBP3轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況

將野生對(duì)照、空載pCAMBIA2300對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系同時(shí)播種在MS、MS+150 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上，每隔2 d統(tǒng)計(jì)一次發(fā)芽率并拍照觀察，用prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析作圖。發(fā)現(xiàn)在MS培養(yǎng)基上野生對(duì)照、空載pCAMBIA2300對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系在2 d時(shí)開始萌發(fā)，8 d后的萌發(fā)率均達(dá)到100%(圖4A)。而在MS+150 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上，只有野生對(duì)照和空載pCAMBIA2300對(duì)照8 d時(shí)萌芽率達(dá)到100%，而轉(zhuǎn)基因株系12 d時(shí)萌發(fā)率才達(dá)到最高值80%， 可以明顯看到MS+150mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上，野生對(duì)照和空載pCAMBIA2300對(duì)照的萌發(fā)率高于轉(zhuǎn)基因株系(圖4B)。從圖5可以看出，MS培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因株系和兩個(gè)對(duì)照的生長(zhǎng)情況基本一致，長(zhǎng)勢(shì)良好(圖5A)，而脅迫培養(yǎng)基上的兩個(gè)對(duì)照要比轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)的好(圖5B)。以上結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因株系對(duì)鹽脅迫環(huán)境更加敏感，VpSBP3轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)過程中具有負(fù)向調(diào)控作用。

2.4 VpSBP3轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽脅迫培養(yǎng)基上的根長(zhǎng)情況

將2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和2個(gè)對(duì)照分別種植于培養(yǎng)皿中，并豎放在培養(yǎng)皿架上。本研究用prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析作圖。觀察發(fā)現(xiàn)，MS培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照株系的根長(zhǎng)基本一致(圖6A,6C)，150 mmol·L-1NaCl脅迫處理20 d后轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照株系的根部生長(zhǎng)均受到了抑制，但是轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)顯著低于對(duì)照株系(圖6B,6C)。結(jié)果表明，VpSBP3基因降低了轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。

2.5 模擬鹽脅迫處理下VpSBP3轉(zhuǎn)基因擬南芥的失水率及相對(duì)電解質(zhì)滲透率

取150 mmol·L-1NaCl處理和正常培養(yǎng)20 d后的轉(zhuǎn)基因及野生型擬南芥株系進(jìn)行電解質(zhì)滲漏處理，分別計(jì)算相對(duì)電導(dǎo)率。本研究用prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析作圖。從圖7看出，WT、pCAMBIA2300、VpSBP3-

26、VpSBP3-

42在MS培養(yǎng)基上的相對(duì)電解質(zhì)滲透率分別為27.81%、37.60%、36.05%、39.50%，在MS+150 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基上的相對(duì)電解質(zhì)滲透率分別為34.05%、41.23%、66.41%、86.61%。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系相對(duì)電解質(zhì)滲透率比野生對(duì)照的低，轉(zhuǎn)基因株系對(duì)鹽脅迫更敏感，該基因具有負(fù)向調(diào)控作用。

2.6 鹽脅迫處理下VpSBP3轉(zhuǎn)基因擬南芥丙二醛含量的測(cè)定

用200 mmol·L-1NaCl處理生長(zhǎng)健壯的野生型和轉(zhuǎn)基因株系的擬南芥，每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽澆50 mL，每隔2 d處理一次，處理7 d后，摘取葉片測(cè)其MDA含量。本研究用prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析作圖。從圖8中可以看出，在正常條件下培養(yǎng)的野生型和轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量基本一致，但在150 mmol·L-1NaCl脅迫處理下，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的MDA含量均顯著高于2個(gè)對(duì)照株系，表明轉(zhuǎn)VpSBP3基因的擬南芥抗逆性顯著低于野生型。

3 討論

隨著全球環(huán)境條件的不斷惡化，導(dǎo)致土地干旱和土地鹽堿化越來越嚴(yán)重，使得環(huán)境脅迫成為影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一。為了防止這種脅迫的潛在有害影響，植物進(jìn)化出復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制來識(shí)別外部信號(hào)，并通過不同的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行傳導(dǎo)，導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生一系列的脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響了相關(guān)基因表達(dá)。而基因的表達(dá)受植物體內(nèi)各種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子在植物生命活動(dòng)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，與DNA結(jié)合域共價(jià)結(jié)合，從而達(dá)到抑制或增強(qiáng)基因表達(dá)的作用，常見的參與植物抗逆調(diào)控過程有WRKY[41]、MYB[42]、bZip[43]等轉(zhuǎn)錄因子。

SBP-box基因是一類新的編碼DNA結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)錄因子，他們只存在于綠色植物中。研究表明，這些基因均含有一個(gè)SBP保守結(jié)構(gòu)域，其中含有一個(gè)C端的雙向核定位信號(hào)和兩個(gè)結(jié)合DNA的鋅指結(jié)構(gòu)。本研究中，對(duì)VpSBP3序列分析，發(fā)現(xiàn)該基因符合SBP基因的所有結(jié)構(gòu)特征，屬于SBP家族成員(圖2)。相關(guān)研究表明SBP轉(zhuǎn)錄因子作為miRNA156的靶基因，參與了植物對(duì)非生物脅迫響應(yīng)過程[44]，但不同的SBP基因在非生物脅迫響應(yīng)中表現(xiàn)出了不同甚至相反的功能。在擬南芥中，過表達(dá)AtSPL1和AtSPL12能夠提高其耐熱性[45]；干旱、低溫和鹽脅迫等非生物脅迫可以誘導(dǎo)蘋果MdSBP20基因的表達(dá)[46]；短期鹽脅迫處理下，MdSPL13的過量表達(dá)可以提高蘋果的耐鹽性[47]。與以上研究結(jié)果相悖，也有研究表明SBP基因在植物非生物脅迫響應(yīng)中具有負(fù)向調(diào)控功能。在擬南芥中miR156可通過下調(diào)靶基因AtSPL9提高轉(zhuǎn)基因株系抗鹽和抗旱能力[48]；辣椒中CaSBP12基因也可負(fù)向調(diào)控植株對(duì)鹽脅迫的耐受性[27]；本研究將VpSBP3基因在擬南芥中過量表達(dá)后發(fā)現(xiàn)相較于兩個(gè)對(duì)照，鹽脅迫處理下轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)率更低、根長(zhǎng)更短、相對(duì)電導(dǎo)率更高和MDA的含量更高。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)VpSBP3基因的過量表達(dá)可能增強(qiáng)了植株對(duì)鹽脅迫的敏感性。該研究為進(jìn)一步解析miR156/SBP在植物逆境脅迫中的作用機(jī)理提供了一定的理論基礎(chǔ)，對(duì)植物的抗逆性研究和應(yīng)用有一定的指導(dǎo)意義。