陳貴蘭，徐坤，周遠明，王倩文

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)中心實驗室，山東青島 266109)

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，參與生物的新陳代謝和各種生理過程，是生命有機體的重要組成部分，是生命科學(xué)的重點研究內(nèi)容?；诹己玫臓I養(yǎng)功效和防病治病作用，氨基酸成為營養(yǎng)型化妝品、合成藥物、表面活性劑等工業(yè)產(chǎn)品的化工原料[1-2]，對蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)和整個生命科學(xué)研究以及產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量控制和生產(chǎn)管理等具有重要意義。近年來，氨基酸分析已成為食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等研究工作中最重要的技術(shù)之一[3-4]。

在深入研究氨基酸的過程中，建立實用、快速、靈敏的分析方法具有重要的學(xué)術(shù)意義和實際應(yīng)用價值。氨基酸自動化分析由Spackman等[5]人在1958年首先提出，采用陽離子交換色譜與柱后茚三酮衍生結(jié)合的方法分析蛋白質(zhì)中的氨基酸。之后，在此基礎(chǔ)上衍生的氨基酸分析方法不斷涌現(xiàn)，主要是基于色譜方法的檢測手段，包括氨基酸分析儀法、高效液相色譜法和毛細管電泳法等[6-7]。由于氨基酸不具有分光檢測所需的生色基團，因此上述色譜方法在對氨基酸進行檢測時必須進行柱前或柱后衍生。但衍生化操作步驟繁瑣，衍生試劑多為有毒藥品，且衍生化合物的穩(wěn)定性難以直觀評判，衍生效率無法有效保證?；谏鲜鲅芯勘尘埃合嗌V串聯(lián)質(zhì)譜法成為氨基酸分析領(lǐng)域新興的研究方法[8-9]，該方法無需衍生步驟、操作簡單、節(jié)約實驗成本，且樣品上機測試周期遠短于上述色譜方法，為高效快速的氨基酸分析提供了新思路。

枸杞為茄科枸杞屬多年生落葉或半落葉灌木，其果實的干制形式“枸杞”有滋補肝腎、益精明目的功效，是一種常用中藥[10-11]。隨著人民生活水平和保健觀念的日益提升，枸杞已成為一種重要的“藥食兩用”植物資源。相較于傳統(tǒng)紅枸杞，黑枸杞富含天然抗氧化劑原花青素和花青素，具有延緩衰老的作用，因而成為養(yǎng)生人士的“新寵”，深受消費者喜愛?；诖?，不同種類枸杞的營養(yǎng)學(xué)分析成為近年來研究熱點之一。本研究基于液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜方法，建立了氨基酸含量的分析方法，并用該方法測定了不同枸杞中的氨基酸含量，為枸杞的合理開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

1 試驗材料和方法

1.1 儀器、試劑與試驗材料

超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀(1290/6460，美國Agilent公司)，氨基酸分析儀(L8900，日本日立公司)，電子天平(BT125D，德國Sartorius集團)，高速粉碎機(FW100，天津泰斯特儀器有限公司)，真空泵(2xz-2，上海德英真空照明設(shè)備有限公司)，超聲波清洗器(Elmasonic P，德國Elma公司)，去離子水發(fā)生器(Milli-Q，美國Millipore公司)，干燥箱(BA0-80A，施都凱儀器設(shè)備有限公司)。

17種氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、結(jié)氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、天門冬氨酸、賴氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、絡(luò)氨酸、組氨酸)標準品、MCI緩沖液套裝購于日本日立，甲酸(質(zhì)譜純，美國Fisher公司)、乙腈(色譜純，德國Merck公司)、鹽酸、茚三酮(分析純，國藥集團)。

試驗所用黑枸杞果實采自青海的野生植株；紅枸杞果實為購于市場的人工栽培品種，原產(chǎn)地為寧夏。

1.2 樣品前處理方法

枸杞樣品低溫烘干至恒重，粉碎后過80目篩備用。稱取一定量的枸杞樣品于20 mL水解管中，加入16 mL 6 mol/L的鹽酸溶液，真空脫氣30 s后充氮氣封管。樣品在110 ℃下水解24 h，待冷卻后用去離子水無損轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶定容。準確量取1 mL水解液于小瓶中減壓抽干脫酸，之后加1 mL去離子水復(fù)溶后再次抽干，并重復(fù)操作1次。樣品上機前充分溶解于1 mL 1%甲酸溶液，經(jīng)0.22 μm的水相濾膜過濾備用。試驗中對樣品稱樣量和減壓抽干脫酸溫度進行了優(yōu)化。

1.3 氨基酸含量測定方法

分別采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀和氨基酸分析儀測定樣品中氨基酸的含量。

采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀時，色譜條件為：色譜柱為Waters HILIC柱(3 μm，2.1×100 mm)，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，流速為400 μL/min，梯度洗脫條件為0～10 min A相從5%梯度升至95%并保持4 min至14 min，柱溫30 ℃，進樣量為2 μL。另外，為防止不同樣品之間的交叉污染，進樣針每次取樣之后都用新鮮的甲醇溶液沖洗1次。質(zhì)譜條件為：ESI電噴霧離子源，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式，干燥氣流速8 L/min，干燥器溫度350 ℃，鞘氣流速10 L/min，鞘氣溫度350 ℃，錐孔電壓25 psi，毛細管電壓3 500 V。試驗中，以較優(yōu)的分離度為目標，對流動相洗脫梯度、離子掃描模式、碎裂電壓、碰撞池能量等進行了優(yōu)化。

氨基酸分析儀分析方法參考國標GB/T 5009.124—2003。比較了兩種方法測定結(jié)果的差異，相對誤差計算公式如下式所示：

式中，RE為相對誤差，Xa為本方法測得樣品中氨基酸含量，Xb為氨基酸分析儀方法測得樣品中氨基酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

液質(zhì)聯(lián)用方法測試數(shù)據(jù)由儀器自帶的Mass Hunter定性和定量軟件進行數(shù)據(jù)分析。氨基酸分析儀測試數(shù)據(jù)由儀器自帶的EZChrom Elite軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗條件優(yōu)化

首先考察了稱樣量對氨基酸測試結(jié)果的影響，每組稱樣量重復(fù)10次。結(jié)果如圖1所示，當稱樣量小于0.1 g時，隨著稱樣量增加，氨基酸含量測定結(jié)果的相對標準偏差逐漸減小，這可能是由于稱樣量過小時樣本的代表性太低，導(dǎo)致測試結(jié)果誤差較大。當稱樣量大于0.1 g以后，氨基酸含量的測試結(jié)果趨于穩(wěn)定，相對標準偏差變化不大，基本維持在±2%。然而，在稱樣量大于0.1 g后，氨基酸含量檢測結(jié)果有所降低。這可能是由于稱樣量過大時樣品水解不完全，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低。在試驗過程中，稱樣量大于0.1 g后，確實存在水解樣品溶液混濁的現(xiàn)象，證明了檢測結(jié)果偏低由樣品水解不完全導(dǎo)致。綜合比較之后確定0.1 g為枸杞樣品氨基酸測試的最佳稱樣量。

優(yōu)化了減壓抽干脫酸步驟中干燥箱的溫度。試驗發(fā)現(xiàn)干燥箱溫度高于48 ℃時，真空泵的壓力設(shè)置不易控制，樣品爆沸現(xiàn)象明顯，且溫度過高會導(dǎo)致氨基酸變性，從而造成目標物質(zhì)的損失。同時，樣品抽干速度受溫度影響，隨著溫度降低，抽干速度明顯變慢，導(dǎo)致試驗周期大大延長。綜合比較之后，選擇45 ℃下減壓抽干，可以保證目標物質(zhì)回收率和合適的試驗周期。

傳統(tǒng)氨基酸分析方法中，用低濃度的鹽酸或檸檬酸鈉緩沖液等對上機前的樣品進行復(fù)溶[12]。采用液質(zhì)聯(lián)用方法進行氨基酸含量的分析時，這些物質(zhì)會影響目標物質(zhì)在源區(qū)的離子化效率，因此不宜出現(xiàn)在檢測系統(tǒng)中。嘗試用具有揮發(fā)性的甲酸進行樣品復(fù)溶，得到了良好的回收率，因此上機檢測前用1 mL 1%甲酸溶液對樣品進行復(fù)溶。

優(yōu)化了液相色譜條件，采用甲醇-甲酸水溶液流動相體系進行梯度洗脫，對17種氨基酸獲得了理想的分離效果(圖2)，尤其是實現(xiàn)了同分異構(gòu)體亮氨酸和異亮氨酸的色譜分離，為后續(xù)相同核質(zhì)比下的質(zhì)譜分析提供了可能。優(yōu)化條件下，在14 min內(nèi)完成了17種氨基酸的分析檢測，相較于傳統(tǒng)氨基酸分析儀分析方法50 min的檢測周期大大縮短，極大提高了分析效率。

試驗還優(yōu)化了質(zhì)譜分析條件。分別研究了17種氨基酸在正、負離子掃描模式下的質(zhì)譜行為。氨基酸分子中既有易接受質(zhì)子的-NH2結(jié)構(gòu)，又有易失去質(zhì)子的-COOH結(jié)構(gòu)，因此理論上正負離子模式下都可以進行質(zhì)譜分析。試驗結(jié)果顯示，17種氨基酸在正離子模式下質(zhì)譜信號更強，因此方法采用正離子掃描模式。此外，還通過調(diào)整干燥氣流量和溫度、碎裂電壓、碰撞池能量等參數(shù)，選擇豐度最高、穩(wěn)定性最好的碎片離子用于后續(xù)定量分析。優(yōu)化后的各氨基酸質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1。經(jīng)過對比和優(yōu)化，得到最優(yōu)條件下17種氨基酸的質(zhì)譜信息，見圖3。

2.2 方法性能參數(shù)

將17種氨基酸標準溶液逐級稀釋，得到不同濃度的系列標準工作液，以氨基酸峰面積對濃度進行線性回歸，得到各氨基酸的標準工作曲線。17種氨基酸濃度和質(zhì)譜響應(yīng)強度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.998 2～0.999 9之間，絕大多數(shù)大于0.999。按3倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限，結(jié)果顯示，該方法對17種氨基酸均有極高的靈敏度，檢出限從0.001 ～0.013 μg/mL不等，明顯的優(yōu)于傳統(tǒng)氨基酸分析儀測試方法[13]。用加標試驗方法進行回收率試驗，經(jīng)過6次平行試驗計算平均回收率和精密度。17種氨基酸回收率在90.7%～102.5%之間，相對標準偏差在0.4%～5.3%之間。方法性能參數(shù)詳見表2。

表1 氨基酸的質(zhì)譜檢測參數(shù)

表2 方法性能參數(shù)

2.3 液質(zhì)聯(lián)用方法在測定枸杞中氨基酸含量的應(yīng)用

為驗證本方法的可靠性，在優(yōu)化條件下，分別選擇3種不同黑果枸杞和3種不同紅果枸杞進行17種氨基酸含量的分析，每種樣品進行5組平行試驗。測試結(jié)果與氨基酸分析儀方法測定結(jié)果進行比較，結(jié)果詳見表3。兩種方法的測試結(jié)果具有較好的一致性，17種氨基酸單一組分和總氨基酸含量測試結(jié)果的相對誤差均在10%內(nèi)，說明本方法在氨基酸分析方面穩(wěn)定可靠。

3組黑果枸杞中，17種氨基酸總量為10.09%～10.31%，其中含量較高的為天門冬氨酸、谷氨酸和精氨酸。3種黑果枸杞中17種氨基酸含量總體一致，平均含量排序由高至低分別為：天門冬氨酸>谷氨酸>精氨酸>丙氨酸>亮氨酸>絲氨酸>苯丙氨酸>蘇氨酸>甘氨酸>纈氨酸>賴氨酸>異亮氨酸>絡(luò)氨酸>脯氨酸>組氨酸>胱氨酸>蛋氨酸。相應(yīng)地，3組紅果枸杞中，17種氨基酸總量9.26%～9.52%，略低于黑果枸杞，其中含量較高的為天門冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸。17種氨基酸含量在紅果枸杞中也總體一致，平均含量排序由高至低分別為：天門冬氨酸>谷氨酸>脯氨酸>精氨酸>丙氨酸>絲氨酸>亮氨酸>蘇氨酸>纈氨酸>賴氨酸=甘氨酸>苯丙氨酸>異亮氨酸>組氨酸=絡(luò)氨酸>胱氨酸>蛋氨酸。

楊春霞等[14]以10個枸杞品種為樣本，研究了黑果枸杞與紅果枸杞氨基酸含量的差異，研究發(fā)現(xiàn)黑果枸杞中17種氨基酸總量為11.42%～12.10%，以天門冬氨酸、谷氨酸和精氨酸含量最高；紅果枸杞中氨基酸總量為7.416%～8.744%，以天門冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸含量最高。對比發(fā)現(xiàn)，就單一氨基酸含量排序而言，本文測定結(jié)果與其一致，但含量存在一定差異，這種差異可能是由枸杞品種、采摘時間、氣候條件和果實成熟度等因素造成的。

由表3可以看出，黑果中丙氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸略高于紅果，紅果僅有脯氨酸含量較黑果略有優(yōu)勢。綜合比較，單就營養(yǎng)成分中氨基酸指標來說，黑果枸杞略優(yōu)于紅果枸杞，但優(yōu)勢并不顯著。

3 結(jié)論

建立了液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定枸杞中氨基酸的方法，該方法測試結(jié)果準確可靠、靈敏度高，操作步驟簡單、無需衍生化處理，方法快速高效，通用性良好。將該方法用于枸杞中氨基酸含量的測試，測試結(jié)果與氨基酸分析儀方法進行比較，令人滿意。黑果枸杞和紅果枸杞中氨基酸含量無顯著性差異，為消費者理性購買提供了科學(xué)依據(jù)。