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        抗寒桑樹種質1-脫氧野尻霉素含量測定與分析

        2021-02-03 06:45:32賈漫麗李娜李季生范偉王彬彬楊曉東
        林業(yè)與生態(tài)科學 2021年1期
        關鍵詞:桑樹桑葉種質

        賈漫麗,李娜,李季生,范偉,王彬彬,楊曉東

        (1 河北省高校特產蠶桑應用技術研發(fā)中心,河北 承德 067000;2 承德醫(yī)學院 蠶業(yè)研究所,河北 承德 067000)

        中醫(yī)藥書籍中記載桑葉味苦、甘,可以疏風清熱、清肝明目并治療消渴癥?,F(xiàn)代藥理學研究表明,桑樹含有的藥用成分很多,以1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)為代表的生物堿是其中最重要的一種[1]。DNJ在動物體內表現(xiàn)出穩(wěn)定的α-糖苷酶抑制劑的特性[2],能有效抑制餐后血糖水平的升高,對預防和治療Ⅱ型糖尿病[3]、高血壓、高血脂癥[4]等顯示出良好的生物活性[5-6]。DNJ以桑樹中含量最高(0.1%~0.6%),是桑樹區(qū)別其他藥用植物最具有特色和代表性的次生代謝產物,也是研制新型降糖類藥物的關鍵資源。

        近年來,國內外學者在桑樹DNJ的提取測定[7-8]、來源合成[9]、分布規(guī)律[10]、作用機理[11]等方面開展了大量的研究,為桑樹DNJ的研究奠定了基礎。李有貴等[12]報道了云南省來源不同的59份野生桑桑葉中的DNJ含量差異顯著,最高含量達到0.791 1%,最低僅為0.004 6%。劉凡等[13]測定了廣州國家桑樹種質資源圃的98份桑樹品種資源桑葉DNJ含量,結果顯示品種間差異明顯。張魏琬麒等[14]研究了桑葉中的DNJ含量隨季節(jié)產生的動態(tài)變化規(guī)律,得出結論DNJ在7-8月份氣溫較高時含量最高。金超等[15]對華東蠶區(qū)5個栽培桑品種不同葉位DNJ含量進行測定,結果呈現(xiàn)上位葉>中位葉>下位葉的變化趨勢。目前,對于河北地區(qū)保存豐富的桑樹品種資源尚缺乏系統(tǒng)的調查研究和檢測分析?;诖诉\用高效液相色潽法對承德地區(qū)保存的57份典型桑樹種質資源的新梢進行DNJ含量測定,并進行評價分析,以篩選出適合北方地區(qū)生長的DNJ高含量的桑樹品種(系),為藥用、食用桑樹品種的選育提供依據(jù),同時也為降血糖藥物的開發(fā)提供優(yōu)良的資源。

        1 材料與方法

        1.1 材料及主要試劑和儀器

        1.1.1 桑葉樣品 供試桑葉樣品于2018年6月底采自河北省承德市承德醫(yī)學院蠶業(yè)研究所種質資源圃,57份桑樹種質資源,每個桑樹品種均采摘其新梢。將新鮮桑葉樣品在-20 ℃冰箱預凍,再進行真空冷凍干燥,1段溫度-40 ℃凍4 h,2段開始抽真空,每小時上升5 ℃逐漸升至35 ℃恒溫。將干燥后的桑葉粉碎并過60目篩,裝入密封的樣品瓶-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.1.2 主要試劑 1-脫氧野尻霉素(DNJ)標準品(純度≥98%)、9-芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)、色譜純甲醇、色譜純乙腈等均購自上海阿拉丁試劑,其他化學試劑均為國產分析純。

        1.1.3 主要儀器 島津LC-2030高效液相色譜系統(tǒng),配有SPD-20AV紫外檢測器;OHAUS AR224CN分析天平(奧豪斯儀器有限公司),OHAUS鹵素水分測定儀,KS-300EⅡ型超聲波清洗機(寧波海曙科生超聲設備有限公司),VELOCITY 18R臺式冷凍高速離心機(Dynamica);Micro Pure UV/UF超純水系統(tǒng)(Thermo)。

        1.2 樣品中DNJ的提取及含量測定

        樣品提取:精確稱取待測樣品250 mg,加入0.05 mol/L的HCl 25 mL,漩渦混勻2 min,超聲波提取30 min,然后12 000 r/min離心30 min,收集上清液。沉淀物重復提取1次,合并上清液,用0.05 mol/L HCl定容至50 mL,即得到待測樣品提取液[16]。

        衍生化處理:取待測樣品提取液200 μL于1.5 mL離心管,加入0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液(pH8.5)338 μL,再加入濃度5 mmol/L的衍生化試劑FMOC-Cl(乙腈250 μL,超純水250 μL),充分混勻,20 ℃下水浴20 min。加入1 mol/L甘氨酸(Gly)200 μL中和剩余的FMOC-Cl以終止反應,加入1%(V/V)醋酸溶液132 μL,以生成穩(wěn)定的DNJ-FMOC?;靹蚝笥?.45 μm微孔濾膜過濾,收集濾液備用[16-17]。

        色譜條件:采用RP-HPLC紫外檢測法測定,色譜柱為Kromasail-C18分析柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)及ODS3預柱(5 μm,4.6 mm×10 mm),檢測波長254 nm。室溫25 ℃,柱溫25 ℃,流動相為乙腈-0.1%醋酸混合相(55∶45,V/V),流速為1.0 mL/min,進樣體積20 μL,停止時間60 min。分析軟件為Lab solutions色譜處理工作站,用外標法計算樣品提取液中DNJ的含量。每個待測樣本重復測定3次。桑葉中DNJ質量比(mg/g)=提取液DNJ濃度(μg/mL)×提取液體積(mL)/樣品質量(g)/1 000。

        1.3 標準曲線的制備和線性范圍考察

        配制濃度為1 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL的DNJ標準品溶液,各取200 μL按上述1.2的方法進行衍生化后,測定峰面積。以DNJ標準品溶液濃度X對色譜峰面積Y進行線性回歸。標準品溶液在1~60 μg/mL質量濃度范圍內,檢測結果與實際數(shù)據(jù)呈現(xiàn)良好的線性關系,回歸方程Y=11 283X-4 874.8,相關系數(shù)R2=0.999 9。

        2 結果與分析

        2.1 桑葉檢出DNJ的高效液相色譜圖譜

        DNJ的高效液相色譜圖見圖1。

        如圖1(A-C)所示,試劑中的水解副產物 FMOC-OH 和 Gly-FMOC 色譜峰與測定的 DNJ-FMOC色譜峰能良好分離,不干擾測定目標成分的準確性。高效液相色譜顯示DNJ標準品和樣品中 DNJ-FMOC的保留時間為 5.838 min,與其他組分之間呈現(xiàn)良好的基線分離。

        圖1 桑樹新梢樣品中DNJ的高效液相色譜圖Figure 1 HPLC of DNJ in Mulberry leaf tip samples

        2.2 57份桑樹種質資源新梢中DNJ含量比較

        57份桑樹種質資源DNJ含量檢測結果見表1。

        表1 57份桑樹品種資源的桑樹新梢中DNJ含量比較Table 1 Comparison of DNJ content in new shoot of 57 mulberry cultivars

        表1(續(xù))

        表1(續(xù))

        57份桑樹種質資源DNJ含量分布區(qū)間見圖2。

        圖2 57份桑樹種質資源新梢中DNJ含量分布Figure 2 The distribution of DNJ content in the new shoots of 57 mulberry germplasm resources

        57份桑樹種質資源的DNJ含量差異較大,質量比變幅為 1.288~5.183 mg/g。在供試品種中, DNJ含量最高的品種有2個,分別為遼寧的家桑(5.183 mg/g),其次是河北的條墩桑(5.020 mg/g);含量最低的是禾桑(1.288 mg/g),最高含量與最低含量相差 4.02 倍。由圖 2 可知,DNJ 含量的分布區(qū)間相對集中,質量比較高分布在 4.0~5.0 mg/g 之間有6 種,分別是山東牛筋,遼寧的寬甸 6號和鳳凰山 6號,其余3個黑皮、張家口 25號、遵化白椹均來自河北;質量比分布在 2.0~3.0 mg/g 之間有21 種,占桑樹品種資源總數(shù)的36.84%;質量比分布在 3.0~4.0 mg/g 之間有22 種,占桑樹品種資源總數(shù)的 38.60% ;質量比較低的分布在1.0~2.0 mg/g 之間的有6個品種,分別為烏克蘭 1號、魯桑 6號、宜秋、勺桑、節(jié)曲、禾桑。

        2.3 不同桑種及來源地區(qū)的種質資源DNJ含量比較

        不同桑種的桑樹種質資源DNJ含量比較見表2。

        表2 不同桑種樣品中DNJ含量比較Table 2 Comparison of DNJ content in different mulberry species

        不同來源地區(qū)的桑樹種質資源DNJ含量比較見圖 3。

        圖3 不同來源地區(qū)的桑樹品種桑樹新梢中DNJ含量比較Figure 3 comparison of DNJ content in mulberry leaf tips of mulberry species from different sources

        所檢測的57份桑樹品種資源中白桑和魯桑占比最多,白桑有23個品種,平均DNJ質量比為3.374 mg/g,占桑樹品種資源總數(shù)的40.35%,DNJ 質量比最高的 2個品種家桑、條墩桑均為白桑種。魯桑有29個品種,平均DNJ質量比為 2.877 mg/g,占桑樹資源總數(shù)的50.88%,說明白桑、魯桑種在承德地區(qū)的適應能力較強。華桑僅有1個品種為涿鹿6號,雞桑有2個品種分別為寬甸 6號和鳳凰神 6號,DNJ 質量比均較高,都在 4 mg/g 以上。蒙桑品種僅有2個為蒙果桑和石門臺蒙桑,DNJ 質量比分別為 2.276 mg/g ,3.303 mg/g。

        由圖3可知,57份桑樹種質資源來自全國 11個省、市及自治區(qū),以及朝鮮、日本和前蘇聯(lián)。其中河北的地方品種(系)或者栽培品種較多,數(shù)量達到 25個,平均DNJ質量比也較高,達到 3.212 mg/g。其次有6個品種引自山東,5個品種引自遼寧,分別有4個品種來自朝鮮和日本,極少數(shù)品種來自江浙及國內其他地區(qū)。研究結果表明,來源地區(qū)不同的桑樹品種其DNJ含量差異較大,原產地河北的大部分品種DNJ含量均處于較高水平,其他地區(qū)則較低,這可能與本土品種的生態(tài)適應性相關,南方品種耐寒性較差,引進后生長勢較弱,次生代謝產物積累的也相對較少有關。

        3 討論

        DNJ首先是從桑葉根皮中分離得到,除了桑科植物以外,其他植物中也存在著DNJ,但含量極低[18]。已有研究表明,桑樹品種、葉片部位、季節(jié)氣候、發(fā)育階段、處理方式[19-20]等均是影響DNJ含量的重要因素。其中,DNJ在桑葉中的分配量由大到小為春芽、嫩芽、嫩葉、成熟葉、老葉[10]。本研究運用高效液相色譜紫外檢測法對河北省保存的 57份桑樹種質資源進行DNJ定量分析。試驗設計采樣部位為桑樹新梢,之所以選擇新梢部位,是因為當有機物進入植物體內以后,向上傳輸?shù)秸谏L的枝葉頂端[21],因此存在頂端優(yōu)勢,桑枝新梢葉中營養(yǎng)物質充足,活性物質含量也相應較高。試驗結果顯示,不同桑樹品種新梢DNJ含量差異較大,原產河北、遼寧品種較多且DNJ含量較高。

        DNJ 或許和其他次生代謝產物一樣,在植物進化過程中發(fā)揮著重要的防御作用[22]。目前,針對不同地區(qū)不同品種桑樹DNJ含量的測定和比較已有大量研究。李有貴、陳松[12,23]分別對云南省不同地域的野生、栽培桑樹品種DNJ含量進行差異檢測,結果顯示,開遠的巖桑DNJ含量最高,質量分數(shù)達到 0.791 1%,是可見報道中DNJ含量最高的桑樹資源。丁俊男[24]研究發(fā)現(xiàn),北方 8個桑樹品種中黑龍江地方品種泰來桑上位葉中DNJ含量達到 4.20 mg/g,高于其他桑樹品種。葉晶晶[10]用反相高效液相色譜法測定山東省有代表性的18個桑品種的摘芯芽中 1-DNJ 含量,沙 2×倫教 109 和秋雨最高,質量分數(shù)均達 0.328 0%左右。劉凡[13]所測華南地區(qū)(廣州)的 98 份桑樹品種資源中,多數(shù)供試桑樹品種的桑葉DNJ含量分布在 0~1.00 mg/g 之間,其中育 7803 含量最高,質量比為1.54 mg/g。金超[15]報道華東蠶區(qū) 5個栽培桑品種育 711號、 7307 、湖桑 32號、金 10、新一之瀨葉片中DNJ的質量比在 1.89~3.06 mg/g之間。禚蘇[25]報道安康地區(qū) 24個桑樹品種中旬陽青皮荊桑中的 DNJ 含量最高,為 0.381 5%。

        與已有研究結果相比,本試驗測定品種桑葉中DNJ含量相對較高,質量比變幅在 1.288~5.183 mg/g之間,最高含量的品種只低于云南省開遠的野生品種巖桑。其中 2個品種達到 5.0 mg/g 以上, 6個品種在 4.0~5.0 mg/g 之間,75.0% 的品種 DNJ 質量比分布在 2.0~4.0 mg/g??赡芘c桑樹長期以來生長的環(huán)境因素相關,氣候溫度作為環(huán)境脅迫因子,其變化可能會影響桑葉中次生代謝產物的合成表達與積累[24]。承德地區(qū)冬季寒冷,春秋氣溫偏低且晝夜溫差較大,霜害嚴重,因此種質資源圃里的桑樹品種大部分為河北省地方品種(系),極少部分引種的南方品種經長期馴化也已經與環(huán)境產生一定的適應性[26]。有關DNJ在桑樹體內的合成代謝機制,本課題組正在進一步研究。本試驗結果顯示,家桑、條墩桑、山東牛筋、黑皮、遵化白椹等品種DNJ含量較高,為選育高DNJ含量的桑樹的藥用、茶用及食品開發(fā)等提供了新的種質資源信息。此外,除了對DNJ含量有所了解,還要依據(jù)不同用途,綜合考慮其他活性物質,如黃酮類、多酚類,以及品種葉片生長量和抗病性等方面,選擇最佳品種應用。

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