段 麗，祝清燦，汪 娥，孫宜春(國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司，貴州 550026)

中藥補(bǔ)骨脂為豆科(Leguminosaesp.)植物補(bǔ)骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的干燥成熟果實(shí)，味苦、氣辛、性溫，歸腎、脾經(jīng)，具有溫腎助陽、納氣平喘和溫脾止瀉的功效[1]。在中醫(yī)臨床上主治腎虛泄瀉、遺精、陽萎、尿頻數(shù)、腰膝冷痛和虛寒喘咳等癥?，F(xiàn)代研究表明，補(bǔ)骨脂中含香豆素類、單萜酚類、黃酮類以及苯并呋喃類等多種化學(xué)成分，且藥理作用廣泛，具有抗腫瘤、抗菌、抗骨質(zhì)疏松和抗雌激素樣作用等多種藥理活性[2-8]?！吨袊?guó)藥典》2015年版中含補(bǔ)骨脂的成方制劑達(dá)41種，但僅以補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量為補(bǔ)骨脂的質(zhì)量控制指標(biāo)[1]。中藥成分復(fù)雜，多成分多靶點(diǎn)共同起到防病治病的作用，僅通過檢測(cè)其中的個(gè)別成分以評(píng)價(jià)其質(zhì)量略顯不足。多指標(biāo)同時(shí)測(cè)定，需要多個(gè)對(duì)照品[9-13]。一測(cè)多評(píng)法(QAMS)[14]只需1個(gè)對(duì)照品，即可同時(shí)測(cè)定其他成分的含量，可解決某些對(duì)照品難以獲得或價(jià)格高的問題，具有簡(jiǎn)便、高效的特點(diǎn)。本文建立能測(cè)定補(bǔ)骨脂藥材中補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和補(bǔ)骨脂酚含量的QAMS法，為補(bǔ)骨脂的質(zhì)量、安全性評(píng)價(jià)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Vanqish型超高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；Agilent 1290型超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；Direct-Pure Genie型超純水系統(tǒng)(上海樂楓生物科技有限公司)。

1.2試藥 補(bǔ)骨脂素(批號(hào)110739-201617)、異補(bǔ)骨脂素(批號(hào)110738-201617)、新補(bǔ)骨脂異黃酮(批號(hào)520052-201401)和補(bǔ)骨脂二氫黃酮對(duì)照品(批號(hào)520053-201401)，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均>99%；補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品(批號(hào)BCY-000053)，購(gòu)于江西佰草源生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；乙腈和甲醇(色譜純)，購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；水為超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。實(shí)驗(yàn)用15批補(bǔ)骨脂樣品來源見表1，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)李偉教授鑒定為豆科植物補(bǔ)骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實(shí)。

表1 15批補(bǔ)骨脂的樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用Zorbar RRHD SB-C18(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Shim-pack XR-ODSⅢ C18(150 mm×2.0 mm，2.2 μm)色譜柱。流動(dòng)相：乙腈(A)-2 mL·L-1冰醋酸(B)；流速0.4 mL·min-1。梯度洗脫(0～0.5 min，23%A～26%A；0.5～1.2 min，26%A；1.2～1.9 min，26%A～35%A；1.9～5.0 min，35%A～40%A；5.0～8.0 min，40%A～55%A；8.0～10.0 min，55%A；10.0～13.0 min，55%A～75%A；13.0～13.5 min，75%A；13.5～15.8 min，75%A～95%A；15.8～16.5 min，95%A；16.5～18 min，95%A～23%A；18～20 min，23%A)。檢測(cè)波長(zhǎng)：246 nm；柱溫：45 ℃[15-16]。

2.2溶液的配制

2.2.1混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮和補(bǔ)骨脂二氫黃酮對(duì)照品13.00，12.50，12.7，10.60 mg，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得4種成分質(zhì)量濃度分別為1.30，1.25，1.27，1.06 mg·mL-1的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液；取補(bǔ)骨脂酚對(duì)照品適量，置于量瓶中，再分別精密量取上述單一對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇稀釋配制成5種成分質(zhì)量濃度分別為65.00，62.50，44.45，53.00，0.64 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液 精密稱取補(bǔ)骨脂樣品粉末(過3號(hào)篩)0.5 g，置于索氏提取器中，加甲醇90 mL，水浴回流提取2 h，放冷，移至100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用 0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液 取甲醇適量，用 0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別取2.2項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各2 μL，注入液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，見圖1。由圖1可知，各主成分分離度較好，陰性樣品在相應(yīng)位置上無吸收峰，表明陰性對(duì)照無干擾。

根據(jù)航運(yùn)公司公布的運(yùn)輸費(fèi)用、時(shí)間及對(duì)服務(wù)水平的定性描述，得到各路徑的運(yùn)輸費(fèi)用、時(shí)間、各路徑對(duì)應(yīng)的服務(wù)水平等級(jí)等相關(guān)數(shù)據(jù)，具體如表2所示.

圖1 HPLC圖

2.4線性范圍 將2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液加甲醇稀釋成系列質(zhì)量濃度的溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積積分值為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸。計(jì)算得5種成分的線性方程分別為y1=0.727 7x1+1.186(r1=0.999 9)，y2=0.715 5x2+1.178(r2=0.999 9)，y3=0.448 5x3+0.213(r3=1.000 0)，y4=0.197 5x4+0.214(r4=1.000 0)，y5=0.186 9x5+0.449(r5=0.999 9)。結(jié)果表明，5種成分的質(zhì)量濃度分別在3.20～320.23，2.70～312.91，2.20～219.45，2.72～271.76,1.60～320.68 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰峰面積并計(jì)算RSD值，測(cè)得5種成分日內(nèi)精密度RSD值分別為0.23%，0.18%，2.02%，2.20%，0.30%；連續(xù)進(jìn)樣3 d，每日進(jìn)樣6次，測(cè)得日間精密度RSD值分別為1.38%，1.42%，1.81%，2.02%，0.30%，表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批補(bǔ)骨脂藥材(批號(hào)20161001)，按照 2.2.2項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各色譜峰峰面積并計(jì)算RSD值，結(jié)果5種成分的峰面積RSD值分別為 0.93%，0.94%，0.92%，1.12%，0.57%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下制備的供試品溶液，分別于0，1，2，6，8，12，16，24 h按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各色譜峰峰面積并計(jì)算RSD值，測(cè)得5種成分的峰面積RSD值分別為0.34%，0.19%，0.45%，2.35%，0.39%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.8回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的同批號(hào)(批號(hào)20161001)補(bǔ)骨脂藥材0.25 g，9份，分別置于索氏提取器中，分別精密加入2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液0.8，1.0，1.2 mL，各3份，使待測(cè)目標(biāo)成分對(duì)照品的加入量相當(dāng)于樣品含有量的80%，100%，120%，加入90 mL甲醇，水浴回流3 h，取出，移至100 mL量瓶中，加甲醇定容，0.22 μm濾膜過濾，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。記錄各色譜峰峰面積并計(jì)算平均回收率和RSD值，結(jié)果見表2。

2.9相對(duì)校正因子(RCFs)的計(jì)算 RCFs值的計(jì)算公式為[13]：fis=fi÷fs=(Ai÷Ci) ÷(As÷Cs)，式中As為內(nèi)參物的峰面積，Cs為內(nèi)參物質(zhì)量濃度，Ai為待測(cè)成分峰面積，Ci為待測(cè)成分質(zhì)量濃度。

取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1，2，5，10，15，20 μL，記錄各成分色譜峰峰面積，分別以補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、新補(bǔ)骨脂異黃酮、補(bǔ)骨脂二氫黃酮和補(bǔ)骨脂酚為內(nèi)參物，計(jì)算其他4種成分的RCFs，取其平均值作為各自的RCFs，對(duì)應(yīng)的RSD值分別為0.79%，0.94%，0.98%，0.86%，2.26%。結(jié)果顯示，以補(bǔ)骨脂素為內(nèi)參物，其余待測(cè)成分RCFs所對(duì)應(yīng)的RSD值最小，且補(bǔ)骨脂素符合內(nèi)參物的篩選原則，故選擇補(bǔ)骨脂素作為內(nèi)參物。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.10.1RCFs的重復(fù)性 取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液6份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以補(bǔ)骨脂素為內(nèi)參物，分別計(jì)算其余4種成分的RCFs值所對(duì)應(yīng)的RSD值。結(jié)果4種成分的RSD值均在0.15%～0.81%范圍內(nèi)，表明RCFs的重復(fù)性良好。

2.10.2不同儀器和色譜柱對(duì)RCFs的影響 取2.2.1項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，分別考察Thermo Vanquich UPLC(A)和 Agilengt 1290 UPLC (B)2種色譜儀以及Zorbar RRHD SB-C18(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)(C)和Shim-pack XR-ODS Ⅲ C18(150 mm×2.0 mm，2.2 μm)(D)2種不同色譜柱對(duì)RCFs值的影響。結(jié)果顯示，各待測(cè)成分RCFs值所對(duì)應(yīng)的RSD值均小于2.86%，表明不同色譜系統(tǒng)及不同色譜柱對(duì)RCFs無明顯影響。結(jié)果見表3。

表3 不同儀器和色譜柱對(duì)RCFs的影響 (n=6)

2.11待測(cè)組分色譜峰的定位 取2.2.1項(xiàng)下制備

的混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，分別考察2種色譜儀和2種不同色譜柱(同2.10.2項(xiàng)下)對(duì)相對(duì)保留值(RRT)的影響。測(cè)定并計(jì)算4種待測(cè)成分與內(nèi)參物補(bǔ)骨脂素的RRT，結(jié)果見表4。由表4可知，各成分RRT所對(duì)應(yīng)的RSD值均小于2.65%，表明利用RRT進(jìn)行不同成分色譜峰的定位是可行的。

表4 不同儀器和色譜柱對(duì)RRT的影響 (n=6)

2.12QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較 將15批補(bǔ)骨脂藥材按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各2份，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。分別采用外標(biāo)法和QAMS法計(jì)算 15 批補(bǔ)骨脂藥材中 5 種成分的含量，結(jié)果見表5。由表5可知，5種成分含量分別在0.26%～0.72%，0.25%～0.63%，0.25%～0.42%，0.14%～0.34%，3.43%～5.92%范圍內(nèi)，經(jīng)t檢驗(yàn)及配對(duì)設(shè)計(jì)的Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)證明2 種方法所測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；外標(biāo)法實(shí)測(cè)值與QAMS法計(jì)算值的相對(duì)誤差<5%，說明QAMS法可作為補(bǔ)骨脂多指標(biāo)成分質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法。

表5 補(bǔ)骨脂中5種成分的含量 (n=2)

3 討論

3.1耐用性考察 參考文獻(xiàn)[15-20]進(jìn)行不同色譜柱、柱溫、流速及液相色譜儀的考察，色譜圖均得到良好重現(xiàn)，分離度、對(duì)稱因子等均達(dá)到相關(guān)要求。不同柱溫及流速下各待測(cè)成分RCFs所對(duì)應(yīng)的RSD值均小于0.76%，柱溫流速等對(duì)RCFs影響較小。

3.2供試品溶液的制備方法考察 考察了超聲、回流及索氏提取3種方法對(duì)提取效果的影響，結(jié)果表明，索氏提取法節(jié)約溶劑且各成分含量均較高，故選擇該方法制備供試品溶液。

3.3評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[2-8]及測(cè)定15批補(bǔ)骨脂藥材中5種成分的含量，結(jié)果各批藥材中5種成分的含量均大于0.1%，依據(jù)文獻(xiàn)選擇含量大于0.1%的5種成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)[14]，最終確定補(bǔ)骨脂中4種成分對(duì)補(bǔ)骨脂素的RCFs分別為:

f異補(bǔ)骨脂素/補(bǔ)骨脂素=1.01，f新補(bǔ)骨脂異黃酮/補(bǔ)骨脂素=0.61，

f補(bǔ)骨脂二氫黃酮/補(bǔ)骨脂素=0.29，f補(bǔ)骨脂酚/補(bǔ)骨脂素=0.28；

RRT值：

r異補(bǔ)骨脂素/補(bǔ)骨脂素=1.06，r新補(bǔ)骨脂異黃酮/補(bǔ)骨脂素=1.68，

r補(bǔ)骨脂二氫黃酮/補(bǔ)骨脂素=1.75，r補(bǔ)骨脂酚/補(bǔ)骨脂素=2.72。

本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定補(bǔ)骨脂中5種成分含量的比較時(shí)，首先對(duì)補(bǔ)骨脂中5種成分間的RCFs和RRT值進(jìn)行了驗(yàn)證，分別采用2種方法對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行色譜峰定位和含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所確定的RCFs和RRT結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于計(jì)算補(bǔ)骨脂中其他4種成分的含量。