陳則強(qiáng)，李昊

（廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔修復(fù)科，廣西 南寧 530021）

慢性牙周炎是口腔疾病中最常見的慢性感染性疾病之一，可造成牙齦退縮、牙齒松動(dòng)甚至移位等不良后果，影響口腔功能及美觀。慢性牙周炎由多種因素引起，其中牙菌斑生物膜是引起牙周炎的始動(dòng)因子，也是最主要的致病因素。牙菌斑的細(xì)菌中，革蘭陰性細(xì)菌是其中最重要的致病菌之一。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性細(xì)菌所獨(dú)有的一種高度活性的致病物質(zhì)，對(duì)牙周組織具有強(qiáng)烈毒性，其在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。研究表明，LPS可誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞炎性反應(yīng)繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[1]。

芒果苷（Mangiferin）是一種從百合科植物知母中提取的天然多酚類化合物，既往研究證明其具有良好的抗炎活性和抗凋亡作用[2-3]。但目前尚無研究探討芒果苷對(duì)LPS 引起的牙周細(xì)胞凋亡是否同樣有效，因此，本研究將小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1 細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用脂多糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，并加入芒果苷進(jìn)行培養(yǎng)，探索芒果苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響及可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1 細(xì)胞購(gòu)于上海拜力生物科技有限公司；α-MEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、PBS緩沖液、牙齦卟啉單胞菌LPS、芒果苷粉末購(gòu)于美國(guó)Sigma-Al-drich 公司；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購(gòu)于成都嘉葉生物科技有限公司；TRIzol 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量擴(kuò)增試劑盒購(gòu)于日本Takara公司；酶標(biāo)儀、熒光定量PCR儀購(gòu)于Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 成骨細(xì)胞分組 將小鼠成骨細(xì)胞以1×104/孔、每孔100 μL 細(xì)胞懸液接種于96孔板，均使用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。此后將細(xì)胞隨機(jī)分成3組：對(duì)照組（只含成骨細(xì)胞）、LPS組（成骨細(xì)胞中加入LPS，并調(diào)節(jié)LPS 終濃度為1 μg/mL）、LPS+芒果苷組（在LPS 組基礎(chǔ)上加入芒果苷，并調(diào)節(jié)芒果苷終濃度為40 μmol/L）。每組細(xì)胞均設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)孵育72 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞存活率 于各組每孔加入10 μL培養(yǎng)液并加入10 μL 0.5%MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h 后終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，搖床充分震蕩使藍(lán)紫色結(jié)晶物溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm 處各孔吸光度值，用于定量反映細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率為實(shí)驗(yàn)組吸光度與對(duì)照組吸光度的比值×100%。

1.2.3 qRT-PCR 檢測(cè) TNF-α、Bax、Bcl-2 和 Caspase-3 基因的mRNA 表達(dá) 采用胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，按Trizol一步法提取總RNA，并進(jìn)行濃度及純度檢驗(yàn)；取1 μL 各組樣本的RNA 分別加入Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒，按照試劑盒說明書操作的反應(yīng)體系合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)條件為42 ℃、2 min，37 ℃、15 min，85 ℃、5 s終止反應(yīng)，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆?；各基因的引物序列?β-actin mRNA 正向：5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3’，反向：5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’；TNF-αmRNA 正向 ：5’-TAGCCAGGAGGGAGAACAGA-3’，反向 ：5’-TTTTCTGGAGGGAGATGTGG-3’；Bcl-2 mRNA 正向：5’-GGACTTGAAGTGCCATTGGT-3’，反向：5’-AGCCCCTCTGTGACAGCTTA-3’；Bax mRNA正向：5’-CTGCAGAGGATGATTGCTGA-3’，反向：5’-GATCAGCTCGGGCACTTTAG-3’；Caspase-3 mRNA 正向：5’-ATGGGAGCAAGTCAGTGGAC-3’，反向：5’-CGTACCAGAGCGAGATGACA-3’。每個(gè)PCR 反應(yīng)體系：2×Taq Plus PCR Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水19 μL；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃最終延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束擴(kuò)增后，記錄每個(gè)樣本每個(gè)基因熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)（CT值），以β-actin為參照，計(jì)算各樣本起始模板數(shù)的相對(duì)數(shù)量關(guān)系。每個(gè)樣品中的基因相對(duì)mRNA表達(dá)采用相對(duì)定量公式2-ΔΔCT計(jì)算處理，其中ΔCT=目的基因CT 值-β-actin CT值，ΔΔCT=ΔCT（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCT（對(duì)照組）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組MC3T3-E1 細(xì)胞存活率比較 與對(duì)照組相比，LPS組細(xì)胞存活率顯著降低，與LPS 組相比，LPS+芒果苷組細(xì)胞存活率顯著提高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 3組成骨細(xì)胞的細(xì)胞存活率比較Figure 1 Comparison of cell survival rates among the three groups

2.2 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較 與對(duì)照組相比，LPS組成骨細(xì)胞TNF-α、Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá)均明顯升高，而Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著下降；與LPS 組相比，LPS+芒果苷組成骨細(xì)胞TNF-α、Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá)明顯下降，同時(shí)Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著升高。各項(xiàng)指標(biāo)3 組間任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 小鼠成骨細(xì)胞各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）Table 1 Relative expression of genes of mouse osteoblasts(±s)

表1 小鼠成骨細(xì)胞各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）Table 1 Relative expression of genes of mouse osteoblasts(±s)

組別對(duì)照組LPS組LPS+芒果苷組mRNA相對(duì)表達(dá)量TNF-α 1.00±0.05 5.83±0.62 4.16±0.57 Bcl-2 1.00±0.03 0.73±0.06 0.88±0.07 Bax 1.00±0.06 3.21±0.42 2.37±0.28 Caspase-3 1.00±0.08 4.07±0.54 2.95±0.36

3 討論

作為口腔主要疾病之一，牙周炎不分地域、年齡，具有發(fā)病率高、病情反復(fù)等特點(diǎn)，是導(dǎo)致人體牙齒缺失的重要原因之一。慢性牙周炎是一種感染性疾病，其相關(guān)微生物主要是革蘭陰性細(xì)菌。慢性牙周炎的主要特點(diǎn)是牙周支持組織的破壞，其中牙槽骨喪失是重要特征之一。成骨細(xì)胞是骨組織中的重要成分，其增殖與凋亡是影響牙周骨組織破壞程度的重要因素，而研究表明，革蘭陰性細(xì)菌感染會(huì)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡并抑制成骨細(xì)胞增殖[4]。LPS為一種脂質(zhì)和多糖組成的復(fù)合物，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中特有的一種化學(xué)成分，也是介導(dǎo)感染性炎癥損傷最主要的病原分子之一。當(dāng)細(xì)菌死亡或菌體崩解時(shí)，LPS 得以釋放，其也可通過活細(xì)菌以胞壁發(fā)泡的形式釋放。LPS可導(dǎo)致骨吸收，亦可加重骨吸收的程度。研究表明，牙齦卟啉單胞菌的LPS可抑制成骨細(xì)胞活力并促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡[5]。本研究結(jié)果也證明LPS可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，與既往研究結(jié)果一致。

細(xì)胞凋亡也稱程序性細(xì)胞死亡，是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的一種自主、有序的死亡過程。此過程涉及一系列基因的激活、表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)多種蛋白及細(xì)胞外凋亡因子的調(diào)控。TNF-α 是一種重要的細(xì)胞炎癥因子，實(shí)驗(yàn)證明TNF-α可促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡[6-7]。此外，Bcl-2家族是當(dāng)前細(xì)胞凋亡研究的熱點(diǎn)。Bcl-2 基因家族包括兩類功能拮抗的基因，一類是抑制細(xì)胞凋亡的基因，如Bcl-2、Bcl-W、Bcl-XL、BF1-1 等；另一類是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，如Bax、Bak、Bcl-XS、Bok 等。其中Bcl-2、Bax 是兩類基因中最重要的調(diào)控基因。Bcl-2可通過影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的釋放維持線粒體的跨膜電位，抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C 并抑制Caspase-9等的活化，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)增多[8]。與之相反，Bax 基因是Bcl-2 基因家族中的一個(gè)凋亡促進(jìn)基因，Bax可與Bcl-2形成異源二聚體，兩者相互之間具有拮抗作用，Bax 通過抑制Bcl-2 的活性發(fā)揮凋亡促進(jìn)作用，研究表明其能促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。Caspase 家族是目前最受關(guān)注的細(xì)胞凋亡調(diào)控因子，是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵元件，其他通路引起的細(xì)胞凋亡最終匯集到中心環(huán)節(jié)Caspase蛋白。其中Caspase-3被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，是細(xì)胞凋亡最終執(zhí)行者，若Caspase-3 在細(xì)胞內(nèi)受到激活，細(xì)胞便會(huì)進(jìn)入凋亡過程[10]。

芒果苷又稱芒果甙、知母寧，是漆樹科植物芒果葉的主要活性成分。近年來大量藥理和臨床研究證明，芒果苷具有多種藥理效應(yīng)，如抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗氧化、抗過敏、抗癌等作用[11-13]。目前有關(guān)于芒果苷抑制成骨細(xì)胞凋亡的報(bào)道顯示，芒果苷預(yù)處理后可顯著降低地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并使凋亡相關(guān)因子Bcl-2 和Bax 等向抑制凋亡的方向轉(zhuǎn)變[14]。Li Y 等[15]學(xué)者對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的研究也表明，芒果苷可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)。葉菁等[16]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷可明顯下調(diào)實(shí)驗(yàn)性腦癱大鼠皮質(zhì)區(qū)Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)，而同時(shí)上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，從而抑制腦癱模型大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

本研究結(jié)果顯示，LPS組MC3T3-E1細(xì)胞存活率較對(duì)照組明顯降低，qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示TNF-α、Bax、Caspase-3 mRNA 基因表達(dá)明顯升高，Bcl-2 mRNA 基因表達(dá)明顯下降，表明LPS 可誘導(dǎo)小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞的凋亡；而與LPS 組相比，LPS+芒果苷組MC3T3-E1細(xì)胞存活率明顯提高，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示TNF-α、Bax、Caspase-3 mRNA 基因表達(dá)顯著下降，Bcl-2 mRNA 基因表達(dá)顯著升高，表明芒果苷可能通過抑制LPS 誘導(dǎo)的TNF-α 形成及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生Bax、Bcl-2、Caspase-3 而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用，提示芒果苷有望作為治療慢性牙周炎的輔助藥物。

綜上所述，芒果苷可改善LPS 導(dǎo)致的成骨細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與芒果苷抑制LPS 誘導(dǎo)的TNF-α 形成及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、Caspase-3產(chǎn)生有關(guān)，但細(xì)胞凋亡機(jī)制十分復(fù)雜，其信號(hào)通路也錯(cuò)綜復(fù)雜，具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。