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        芒果苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

        2021-02-02 05:20:10陳則強(qiáng)李昊
        當(dāng)代醫(yī)學(xué) 2021年4期
        關(guān)鍵詞:芒果成骨細(xì)胞牙周炎

        陳則強(qiáng),李昊

        (廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔修復(fù)科,廣西 南寧 530021)

        慢性牙周炎是口腔疾病中最常見(jiàn)的慢性感染性疾病之一,可造成牙齦退縮、牙齒松動(dòng)甚至移位等不良后果,影響口腔功能及美觀。慢性牙周炎由多種因素引起,其中牙菌斑生物膜是引起牙周炎的始動(dòng)因子,也是最主要的致病因素。牙菌斑的細(xì)菌中,革蘭陰性細(xì)菌是其中最重要的致病菌之一。

        脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性細(xì)菌所獨(dú)有的一種高度活性的致病物質(zhì),對(duì)牙周組織具有強(qiáng)烈毒性,其在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。研究表明,LPS可誘導(dǎo)小鼠成骨細(xì)胞炎性反應(yīng)繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[1]。

        芒果苷(Mangiferin)是一種從百合科植物知母中提取的天然多酚類(lèi)化合物,既往研究證明其具有良好的抗炎活性和抗凋亡作用[2-3]。但目前尚無(wú)研究探討芒果苷對(duì)LPS 引起的牙周細(xì)胞凋亡是否同樣有效,因此,本研究將小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1 細(xì)胞作為研究對(duì)象,采用脂多糖誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡,并加入芒果苷進(jìn)行培養(yǎng),探索芒果苷對(duì)LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響及可能的作用機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1 細(xì)胞購(gòu)于上海拜力生物科技有限公司;α-MEM培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、PBS緩沖液、牙齦卟啉單胞菌LPS、芒果苷粉末購(gòu)于美國(guó)Sigma-Al-drich 公司;四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購(gòu)于成都嘉葉生物科技有限公司;TRIzol 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量擴(kuò)增試劑盒購(gòu)于日本Takara公司;酶標(biāo)儀、熒光定量PCR儀購(gòu)于Thermo Fisher公司。

        1.2 方法

        1.2.1 成骨細(xì)胞分組 將小鼠成骨細(xì)胞以1×104/孔、每孔100 μL 細(xì)胞懸液接種于96孔板,均使用α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。此后將細(xì)胞隨機(jī)分成3組:對(duì)照組(只含成骨細(xì)胞)、LPS組(成骨細(xì)胞中加入LPS,并調(diào)節(jié)LPS 終濃度為1 μg/mL)、LPS+芒果苷組(在LPS 組基礎(chǔ)上加入芒果苷,并調(diào)節(jié)芒果苷終濃度為40 μmol/L)。每組細(xì)胞均設(shè)6 個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)孵育72 h,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.2.2 MTT 檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞存活率 于各組每孔加入10 μL培養(yǎng)液并加入10 μL 0.5%MTT 溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h 后終止培養(yǎng),吸去孔內(nèi)液體,每孔加入150 μL DMSO,搖床充分震蕩使藍(lán)紫色結(jié)晶物溶解,用酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm 處各孔吸光度值,用于定量反映細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率為實(shí)驗(yàn)組吸光度與對(duì)照組吸光度的比值×100%。

        1.2.3 qRT-PCR 檢測(cè) TNF-α、Bax、Bcl-2 和 Caspase-3 基因的mRNA 表達(dá) 采用胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞,按Trizol一步法提取總RNA,并進(jìn)行濃度及純度檢驗(yàn);取1 μL 各組樣本的RNA 分別加入Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作的反應(yīng)體系合成cDNA,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系10 μL,反應(yīng)條件為42 ℃、2 min,37 ℃、15 min,85 ℃、5 s終止反應(yīng),將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆茫桓骰虻囊镄蛄袨?β-actin mRNA 正向:5’-TGTTACCAACTGGGACGACA-3’,反向:5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’;TNF-αmRNA 正向 :5’-TAGCCAGGAGGGAGAACAGA-3’,反向 :5’-TTTTCTGGAGGGAGATGTGG-3’;Bcl-2 mRNA 正向:5’-GGACTTGAAGTGCCATTGGT-3’,反向:5’-AGCCCCTCTGTGACAGCTTA-3’;Bax mRNA正向:5’-CTGCAGAGGATGATTGCTGA-3’,反向:5’-GATCAGCTCGGGCACTTTAG-3’;Caspase-3 mRNA 正向:5’-ATGGGAGCAAGTCAGTGGAC-3’,反向:5’-CGTACCAGAGCGAGATGACA-3’。每個(gè)PCR 反應(yīng)體系:2×Taq Plus PCR Master Mix 25 μL,上下游引物各2 μL,cDNA 2 μL,雙蒸水19 μL;PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán),72 ℃最終延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束擴(kuò)增后,記錄每個(gè)樣本每個(gè)基因熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)(CT值),以β-actin為參照,計(jì)算各樣本起始模板數(shù)的相對(duì)數(shù)量關(guān)系。每個(gè)樣品中的基因相對(duì)mRNA表達(dá)采用相對(duì)定量公式2-ΔΔCT計(jì)算處理,其中ΔCT=目的基因CT 值-β-actin CT值,ΔΔCT=ΔCT(實(shí)驗(yàn)組)-ΔCT(對(duì)照組)。

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以“±s”表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組MC3T3-E1 細(xì)胞存活率比較 與對(duì)照組相比,LPS組細(xì)胞存活率顯著降低,與LPS 組相比,LPS+芒果苷組細(xì)胞存活率顯著提高,組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1。

        圖1 3組成骨細(xì)胞的細(xì)胞存活率比較Figure 1 Comparison of cell survival rates among the three groups

        2.2 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較 與對(duì)照組相比,LPS組成骨細(xì)胞TNF-α、Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá)均明顯升高,而B(niǎo)cl-2 mRNA 表達(dá)顯著下降;與LPS 組相比,LPS+芒果苷組成骨細(xì)胞TNF-α、Bax、Caspase-3 mRNA 表達(dá)明顯下降,同時(shí)Bcl-2 mRNA 表達(dá)顯著升高。各項(xiàng)指標(biāo)3 組間任意兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

        表1 小鼠成骨細(xì)胞各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量(±s)Table 1 Relative expression of genes of mouse osteoblasts(±s)

        表1 小鼠成骨細(xì)胞各基因mRNA相對(duì)表達(dá)量(±s)Table 1 Relative expression of genes of mouse osteoblasts(±s)

        組別對(duì)照組LPS組LPS+芒果苷組mRNA相對(duì)表達(dá)量TNF-α 1.00±0.05 5.83±0.62 4.16±0.57 Bcl-2 1.00±0.03 0.73±0.06 0.88±0.07 Bax 1.00±0.06 3.21±0.42 2.37±0.28 Caspase-3 1.00±0.08 4.07±0.54 2.95±0.36

        3 討論

        作為口腔主要疾病之一,牙周炎不分地域、年齡,具有發(fā)病率高、病情反復(fù)等特點(diǎn),是導(dǎo)致人體牙齒缺失的重要原因之一。慢性牙周炎是一種感染性疾病,其相關(guān)微生物主要是革蘭陰性細(xì)菌。慢性牙周炎的主要特點(diǎn)是牙周支持組織的破壞,其中牙槽骨喪失是重要特征之一。成骨細(xì)胞是骨組織中的重要成分,其增殖與凋亡是影響牙周骨組織破壞程度的重要因素,而研究表明,革蘭陰性細(xì)菌感染會(huì)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡并抑制成骨細(xì)胞增殖[4]。LPS為一種脂質(zhì)和多糖組成的復(fù)合物,是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜中特有的一種化學(xué)成分,也是介導(dǎo)感染性炎癥損傷最主要的病原分子之一。當(dāng)細(xì)菌死亡或菌體崩解時(shí),LPS 得以釋放,其也可通過(guò)活細(xì)菌以胞壁發(fā)泡的形式釋放。LPS可導(dǎo)致骨吸收,亦可加重骨吸收的程度。研究表明,牙齦卟啉單胞菌的LPS可抑制成骨細(xì)胞活力并促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡[5]。本研究結(jié)果也證明LPS可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡,與既往研究結(jié)果一致。

        細(xì)胞凋亡也稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡,是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的一種自主、有序的死亡過(guò)程。此過(guò)程涉及一系列基因的激活、表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)多種蛋白及細(xì)胞外凋亡因子的調(diào)控。TNF-α 是一種重要的細(xì)胞炎癥因子,實(shí)驗(yàn)證明TNF-α可促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡[6-7]。此外,Bcl-2家族是當(dāng)前細(xì)胞凋亡研究的熱點(diǎn)。Bcl-2 基因家族包括兩類(lèi)功能拮抗的基因,一類(lèi)是抑制細(xì)胞凋亡的基因,如Bcl-2、Bcl-W、Bcl-XL、BF1-1 等;另一類(lèi)是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因,如Bax、Bak、Bcl-XS、Bok 等。其中Bcl-2、Bax 是兩類(lèi)基因中最重要的調(diào)控基因。Bcl-2可通過(guò)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的釋放維持線粒體的跨膜電位,抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C 并抑制Caspase-9等的活化,從而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用,導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)增多[8]。與之相反,Bax 基因是Bcl-2 基因家族中的一個(gè)凋亡促進(jìn)基因,Bax可與Bcl-2形成異源二聚體,兩者相互之間具有拮抗作用,Bax 通過(guò)抑制Bcl-2 的活性發(fā)揮凋亡促進(jìn)作用,研究表明其能促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。Caspase 家族是目前最受關(guān)注的細(xì)胞凋亡調(diào)控因子,是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵元件,其他通路引起的細(xì)胞凋亡最終匯集到中心環(huán)節(jié)Caspase蛋白。其中Caspase-3被稱(chēng)為“死亡執(zhí)行蛋白酶”,是細(xì)胞凋亡最終執(zhí)行者,若Caspase-3 在細(xì)胞內(nèi)受到激活,細(xì)胞便會(huì)進(jìn)入凋亡過(guò)程[10]。

        芒果苷又稱(chēng)芒果甙、知母寧,是漆樹(shù)科植物芒果葉的主要活性成分。近年來(lái)大量藥理和臨床研究證明,芒果苷具有多種藥理效應(yīng),如抗病毒、抗炎、抗糖尿病、抗氧化、抗過(guò)敏、抗癌等作用[11-13]。目前有關(guān)于芒果苷抑制成骨細(xì)胞凋亡的報(bào)道顯示,芒果苷預(yù)處理后可顯著降低地塞米松誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,并使凋亡相關(guān)因子Bcl-2 和Bax 等向抑制凋亡的方向轉(zhuǎn)變[14]。Li Y 等[15]學(xué)者對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的研究也表明,芒果苷可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)。葉菁等[16]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),芒果苷可明顯下調(diào)實(shí)驗(yàn)性腦癱大鼠皮質(zhì)區(qū)Bax、caspase-3 蛋白表達(dá),而同時(shí)上調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá),從而抑制腦癱模型大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

        本研究結(jié)果顯示,LPS組MC3T3-E1細(xì)胞存活率較對(duì)照組明顯降低,qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示TNF-α、Bax、Caspase-3 mRNA 基因表達(dá)明顯升高,Bcl-2 mRNA 基因表達(dá)明顯下降,表明LPS 可誘導(dǎo)小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞的凋亡;而與LPS 組相比,LPS+芒果苷組MC3T3-E1細(xì)胞存活率明顯提高,qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示TNF-α、Bax、Caspase-3 mRNA 基因表達(dá)顯著下降,Bcl-2 mRNA 基因表達(dá)顯著升高,表明芒果苷可能通過(guò)抑制LPS 誘導(dǎo)的TNF-α 形成及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生Bax、Bcl-2、Caspase-3 而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用,提示芒果苷有望作為治療慢性牙周炎的輔助藥物。

        綜上所述,芒果苷可改善LPS 導(dǎo)致的成骨細(xì)胞凋亡,其作用機(jī)制可能與芒果苷抑制LPS 誘導(dǎo)的TNF-α 形成及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2、Caspase-3產(chǎn)生有關(guān),但細(xì)胞凋亡機(jī)制十分復(fù)雜,其信號(hào)通路也錯(cuò)綜復(fù)雜,具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

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