寇海燕，郭培紅，田丹陽，何 穩(wěn)，李 坤，張婷婷，貢成良，孫丙耀，宋學宏

(1.蘇州大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇蘇州 215123； 2.昆山貝瑞康生物科技有限公司，江蘇昆山 215345)

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是我國廣泛養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)雜交鯽，具有抗逆性強、肉質(zhì)肥美、繁殖速度快等優(yōu)點。但是，由于受鯉皰疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)感染的影響，養(yǎng)殖異育銀鯽爆發(fā)鰓出血病，病魚的鰓、體表多處出血，尾鰭末端發(fā)黑，脾臟、腎臟腫大等癥狀，造成大量死亡[1]，給鯽魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。為應對CyHV-2帶來的危害，研究者采取了多種方式來控制疾病的爆發(fā)。在飼料中添加免疫活性物質(zhì)增強魚的體質(zhì)[2]、改善養(yǎng)殖環(huán)境[3]、制備相關疫苗[5-6]并通過浸泡免疫方式提高異育銀鯽的免疫力，以及藥物防控[7]等措施降低發(fā)病率。但是，這些措施防治效果并不理想。

卵黃抗體(IgY)被認為是IgG、IgE的祖先，由禽類、兩棲類動物通過血液循環(huán)將血清中抗體轉(zhuǎn)移到卵黃中產(chǎn)生[8]。IgY能夠抵抗-30 ℃低溫，65 ℃巴氏消毒30 min也不會失活，4 ℃下可以保存5年，室溫下可以存放6個月[9]。其耐受pH為4～10，當pH為4時，經(jīng)過胃蛋白酶酶解后的Fab’片段能夠保持70% IgY活性[10]。IgY經(jīng)過海藻糖[11]、殼聚糖、嬰兒奶粉[12，13]等物質(zhì)微包膜處理后能夠提高其在胃液、腸道中作用時間。與其他抗體相比，它具有成本低、制備過程簡單且無創(chuàng)傷、特異性高、產(chǎn)量大、活性穩(wěn)定等優(yōu)點。近年來，IgY在水生動物疾病防治中的應用日益增多。雷勇等[14]發(fā)現(xiàn)，飼喂0.2%白斑綜合癥病毒(WSSV) IgY的鰲蝦免疫保護率達到70%，而對照組死亡率達到100%。Lee等[15]的研究顯示，IgY顯著降低虹鱒(Oncorhynchusmykiss)腸道和腎臟中魯氏耶爾森菌(Yersiniaruckeri)載量。另外，IgY還對遭受嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[16]、魯氏耶爾森菌[15]、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)[17]、鮰愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)[18]、WSSV[19]、錦鯉皰疹病毒3(CyHV-3)[20]危害的水生動物有保護作用，一定程度上可抑制病原生物的生長[21]。因此，開發(fā)安全有效的IgY以預防異育銀鯽感染CyHV-2具有重要的實踐意義。本研究通過原核表達CyHV-2的ORF72衣殼蛋白免疫蛋雞制備卵黃抗體，并初步加工為微包膜的全蛋粉及蛋黃粉；進行體外中和實驗及生產(chǎn)性治療試驗，驗證了其抗病毒特性，為下一步對鯽攻毒保護研究及用作養(yǎng)殖魚飼料添加劑奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達載體pET-28a(+)、大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株由本實驗室保存；鯉魚上皮瘤(epithelioma papulosum cyprinid，EPC)細胞由蘇州大學生化與分子生物實驗室饋贈；異育銀鯽鰓出血病的典型病料由江蘇省鹽城市大豐區(qū)水產(chǎn)技術推廣站提供；110～120日齡的健康蛋雞購自蘇州市吳江區(qū)汾湖鎮(zhèn)紅興禽蛋經(jīng)營部。HRP-His Tag、HRP標記羊抗雞IgY抗體購自Sigma公司，鼠抗ORF72血清由實驗室前期制備保存[6]。

1.2 方法

1.2.1 CyHV-2-ORF72重組蛋白的制備與驗證

根據(jù)NCBI中CyHV-2基因組(GenBank登錄號KT387800)中ORF72的序列設計1對引物，即5′-GCTGGATCCATGTACGGCTTAAACAACGCG-3′和5′-ACAGAATTCAGAGGCCGTTGAATGAATGTATG-3′，以CyHV-2基因組為模板進行PCR擴增。回收PCR產(chǎn)物，對其進行BamH I/EcoR I雙酶切，插入pET-28a(+)載體構建重組質(zhì)粒。測序驗證后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)物按1 ∶100的比例接種到2YT誘導培養(yǎng)基中，優(yōu)化IPTG誘導條件后，確定在37 ℃條件下，220 r/min振蕩培養(yǎng)2 h后，在培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度1 mmol/L，27 ℃，100 r/min培養(yǎng)8 h誘導表達。12 000 r/min離心10 min收集菌體，超聲破碎后用SDS-PAGE電泳鑒定誘導表達效果。將IPTG誘導后的總細菌裂解物進行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至NC膜上，37 ℃孵育Anti-His Tag (HRP)抗體(1 ∶5 000稀釋)2 h；PBST洗滌后加入ECL顯色液用多功能熒光化學發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemScope6300型，上海寰熙醫(yī)療器械有限公司)進行顯影檢測，驗證原核表達的CyHV-2-ORF72重組蛋白(rCyHV-2-ORF72)的正確性。

1.2.2 免疫與免疫蛋的收集

將驗證后的表達菌進行大量誘導，收集誘導出的含rCyHV-2-ORF72的菌體沉淀物，加入超聲破碎液(50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，pH 8.0)于高壓細胞破碎儀中破碎處理20 min，4 ℃條件下18 000 r/min離心20 min。將沉淀重懸于變性裂解液中(10 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris-HCl和8 mol/L尿素)，室溫放置60 min后，于4 ℃條件下18 000 r/min離心15 min，收集上清。利用Ni-NTA鎳柱純化重組蛋白，收集蛋白于透析袋中，再先后放置預冷的含6、4、2、1、0.5、0 mol/L尿素復性液中分別透析5 h，再用PBS溶液(0.01 mol/L，pH 7.4)透析12 h，取出透析袋中蛋白，利用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度，并用SDS-PAGE電泳檢測純化效果。

將鎳柱純化后的rCyHV-2-ORF72加上其體積4%的吐溫-80，并與含92%白油、6%司班-80、2%硬脂酸鋁的復合佐劑以1 ∶2的比例，7 000 r/min剪切乳化10 min以上，充分乳化后的重組蛋白終濃度為0.5 mg/mL。免疫劑量為每羽蛋雞0.5 mg，初次免疫10 d后同樣劑量進行二次免疫，二免7 d后收集雞蛋，用間接ELISA進行抽樣檢測，當效價達到1 ∶8 000時正式收集雞蛋。5 d抽檢一次，當效價低于1 ∶8 000時，以相同劑量加強免疫。

1.2.3 卵黃抗體的冷凍干燥加工

收集效價1 ∶8 000以上的免疫蛋，清洗消毒后分成全蛋組、蛋黃組，稱重待用。蛋液中加入質(zhì)量百分比分別為1%、2%、3%的海藻酸鈉、β-環(huán)狀糊精、羧丙基甲基纖維素，均質(zhì)乳化10 min。乳化后轉(zhuǎn)移至巴氏消毒罐，60 ℃消毒30 min。將消毒后的物料倒入冷凍托盤中，厚度0.5 cm，于-80 ℃凍成固體；再放入真空冷凍干燥機(Lyoquest-55plus，CHRIST公司)中，在真空度20 Pa條件下干燥48 h，獲含特異抗體的凍干全蛋粉及蛋黃粉。

1.2.4 抗體特異性及效價檢測

采用Western blot方法檢測抗體的特異性。將誘導后的BL21總細菌裂解物、pET-28a(+)細菌總裂解物、pET-28a(+)-CyHV-2-ORF72細菌總裂解物進行SDS-PAGE電泳分離。經(jīng)去離子水沖洗后，置于轉(zhuǎn)膜裝置，冰水浴110 mA濕轉(zhuǎn)3 h，轉(zhuǎn)移至NC膜，于Marker條帶處剪開分為A、B二張膜，用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min；接著用2% Casein封閉過夜，棄去封閉液，PBS洗滌3次，每次5 min。洗滌后，分別將A膜、B膜轉(zhuǎn)移至蛋黃粉溶解液(1 ∶500)和預結合過量rCyHV-2-ORF72的蛋黃粉溶解液(1 ∶500)中，37 ℃孵育1.5 h，PBST洗滌后于HRP-His羊抗雞IgY(1∶500)中37 ℃孵育1 h，經(jīng)3次PBST溶液洗滌后，加入ECL顯色液，用核酸/蛋白自動曝光儀進行顯影檢測。

采用ELISA法檢測抗體的效價。將鎳柱純化的rCyHV-2-ORF72溶于PBS溶液至終濃度為10 μg/mL，包被96孔板，以PBS液包被作為空白對照。包被后37 ℃溫育1.5 h，4 ℃過夜；PBS洗滌3次，每次5 min；10%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h；如上洗滌3次。將卵黃抗體凍干粉溶于TBS中，12 000 r/min離心10 min。取上清作為一抗，按照1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000的比例梯度稀釋，每孔加入100 μL，37 ℃濕孵2 h，PBST洗滌3次，每次5 min，以免疫前蛋粉作為抗體的陰性對照，洗滌后每孔加入100 μL HRP標記羊抗雞IgY抗體(1 ∶2 000)，37 ℃濕孵1.5 h。洗滌后每孔加入100 μL ELISA顯色劑(OPD顯色底物)，避光反應3～5 min后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，用酶標儀測定樣品OD490值，以P/N>2 ∶1的最高稀釋度作為抗體效價的評判依據(jù)，P/N=(待測抗體的OD值-空白對照OD值)/(陰性對照OD值-空白對照OD值)。

1.2.5 抗體中和實驗

將0.2 g感染CyHV-2發(fā)病的異育銀鯽體腎組織加入5 mL PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)，冰浴研磨，4 ℃下8 000 r/min離心15 min，收集上清后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌獲病毒粗提液，接種于單層EPC細胞上，待細胞出現(xiàn)病變現(xiàn)象后收集上清，再次感染單層EPC細胞獲實驗用病毒液。

用M199培養(yǎng)基將鼠正常血清、鼠抗ORF72血清稀釋100倍，普通蛋粉、含ORF72卵黃抗體的蛋粉稀釋10倍渦旋混勻后用0.22 μm濾膜過濾除菌，獲抗體稀釋液。

各取上述抗體稀釋液、CyHV-2病毒濾液200 μL于1.5 mL EP管中，M199培養(yǎng)基為空白對照，26 ℃孵育1 h，期間顛倒混勻4～6次。將混合液加入到六孔板內(nèi)約80%匯合度的單層EPC細胞中，每組設置3個重復孔，26 ℃孵育4 h后吸出混合液，經(jīng)M199培養(yǎng)基洗滌3次后，加入含2%～3% FBS的M199維持培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。4 d后收集細胞，提取細胞基因組DNA，以EPC細胞的β-actin作為內(nèi)參基因(引物序列為5′-GGAGCCGTTATCAACGACCA-3′和5′-GCTTGGTTTCATCCCTGTGC-3′)，進行實時定量PCR分析，以檢測CyHV-2 Hel基因(引物序列為5′-GGGTGAGGACTTGCGAAGAG-3′和5′-CGCTCGTCCGGGTTCTGCACG-3′)的相對表達水平，以此指示病毒量。PCR反應體系擴增條件為：95 ℃預變性3 min；隨后39個循環(huán)：95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min?；虮磉_水平以2-ΔΔCT法[22]計算。

1.2.6 卵黃抗體生產(chǎn)性應用試驗

鹽城市大豐區(qū)某養(yǎng)殖戶的4個養(yǎng)殖池，1、2、3、4號池的面積分別為30 015、40 020、23 345、53 360 m2。3月下旬放養(yǎng)異育銀鯽3尾/m2，平均規(guī)格150 g/尾。5月8日發(fā)現(xiàn)各池均出現(xiàn)鯽魚死亡，病魚體重約250 g/尾，具明顯的鰓出血癥狀，從5月8-15日，各池魚的死亡量從數(shù)尾快速上升為數(shù)百尾。發(fā)病池的水質(zhì)良好，溶氧在6.2～8.5 mg/L，pH值7.5～8.0，透明度達到35 cm左右。當?shù)厮a(chǎn)技術推廣部門進行PCR檢測分析證實鯽魚罹患鰓出血病。選擇1、2號池為對照池，采用口服維生素C，晚上9點開始增氧至第2天清晨；定期潑灑微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)水質(zhì)等常規(guī)處理方式提高病魚的抗應激能力，減少死亡率。3、4號池作為試驗池，在常規(guī)處理方式的基礎上全池潑灑和口服效價為1 ∶16 000的抗CyHV-2病毒的卵黃抗體。其中3號池在第1、2天每天全池潑灑，劑量為1 g/m3；第3天開始投喂卵黃抗體，按飼料重量0.15%的劑量拌入鯽魚商品飼料中制成功能性飼料，按1%魚體重的投喂量投喂。4號池將飼料中卵黃抗體添加量增加到0.30%，其他治療方法與3號池相同。在病情好轉(zhuǎn)后，飼料投喂量增加到2%，早晚各投喂一次。試驗從5月13日開始，7月中旬鯽吃食、生長完全正常，水溫穩(wěn)定在28 ℃后改投普通商品飼料。試驗過程中每天記錄死魚情況、魚的攝食狀態(tài)及用藥情況，9月底捕撈上市，統(tǒng)計成活率、規(guī)格與產(chǎn)量。

1.3 統(tǒng)計方法

使用SPSS統(tǒng)計軟件19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有定量數(shù)據(jù)均表示為平均值±SEM；差異顯著為P<0.05，差異極顯著為P<0.01。以GraphPad Prism 5.0繪圖。

2 結果

2.1 CyHV-2-ORF72重組蛋白原核表達及純化

CyHV-2-ORF72重組蛋白原核表達產(chǎn)物大小為43 kDa左右，與預測大小吻合，推測誘導出了rCyHV-2-ORF72蛋白。表達產(chǎn)物經(jīng)破碎、離心、鎳柱純化后獲較純的rCyHV-2-ORF72(圖1)。圖1顯示，rCyHV-2-ORF72主要表達在包涵體中，少量為融合蛋白；超聲與高壓破碎、鎳柱純化后獲較純的重組蛋白。經(jīng)鎳柱純化后的重組蛋白純度在80%以上。鎳柱純化的蛋白經(jīng)復性、透析后測得蛋白濃度為1.2 mg/mL。用Anti-His Tag (HRP)抗體進行Western blot鑒定結果顯示，原核表達產(chǎn)物在43 kDa附近出現(xiàn)褐色條帶，空載體pET-28a(+)總細菌裂解物未出現(xiàn)條帶，進一步證明誘導出的重組蛋白特異性強(如圖2)。

圖1 CyHV-2-ORF72重組蛋白誘導表達的SDS-PAGE鑒定Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant CyHV-2-ORF72 capsid protein

M，蛋白質(zhì)分子量標準；泳道1，鎳柱純化后的CyHV-2-ORF72(剪頭所指)；泳道2，高壓破碎后的離心沉淀；泳道3，誘導細菌超聲破碎后離心沉淀；泳道4，誘導細菌破碎后離心上清；泳道5，誘導后pET-28a(+)-CyHV-2-ORF72/BL21總細菌裂解物M，蛋白質(zhì)分子量標準；泳道1，pET-28a(+)-CyHV-2-ORF72/BL21總細菌裂解物，剪頭所指為CyHV-2-ORF72；泳道2，pET-28a(+)/BL21空載總細菌裂解物。

圖2 CyHV-2-ORF72重組蛋白的Western blot驗證Fig.2 Western blot detection of recombinant CyHV-2-ORF72 capsid protein

2.2 凍干全蛋粉、蛋黃粉中ORF72抗體特異性及效價檢測

全蛋粉、蛋黃粉中ORF72抗體特異性的結果如圖3。圖3A顯示，孵育CyHV-2-ORF72抗體后，在43 kDa大小附近出現(xiàn)一條褐色目標條帶，而陰性對照組未出現(xiàn)條帶，表明卵黃抗體中產(chǎn)生了CyHV-2-ORF72重組蛋白的特異性抗體；進一步用過量的rCyHV-2-ORF72預結合卵黃抗體(即封閉抗體后再進行Western blot檢測)，在43 kDa處的褐色條帶消失(圖3B)，證明了卵黃抗體的特異性。

圖3 蛋粉中抗ORF72衣殼蛋白抗體的特異性檢測Fig.3 The specificity of anti-ORF72 capsid protein antibody in egg yolk and whole egg powder

M，蛋白質(zhì)分子量標準；泳道1，BL21空菌總細菌裂解物；泳道2，pET-28a(+)/BL21空載總細菌裂解物；泳道3，pET-28a(+)-CyHV-2-ORF72/BL21總細菌裂解物。剪頭所指為CyHV-2-ORF72。A，蛋粉稀釋液；B，以過量的CyHV-2-ORF72蛋白預結合后的蛋粉稀釋液利用間接ELISA檢測凍干全蛋粉與蛋黃粉中抗體的效價，根據(jù)P/N>2.1計算，結果顯示，全蛋粉中的CyHV-2-ORF72抗體效價為1 ∶8 000；蛋黃中的效價達到1 ∶16 000。全蛋粉中的抗體效價略低于蛋黃。

2.3 卵黃抗體與CyHV-2的親和力

對EPC細胞中CyHV-2病毒解螺旋酶(Hel)基因進行實時定量PCR分析，并以空白對照中Hel基因的Ct值為基線1，計算其它各組Hel基因的表達量，結果如圖4所示。rCyHV-2-ORF72免疫小鼠的抗血清、抗CyHV-2-ORF72卵黃抗體孵育CyHV-2病毒后，Hel基因表達水平分別下調(diào)28%倍和60%，與空白對照組和陰性對照組差異極顯著，說明鼠IgG、雞蛋IgY均降低了病毒量，且雞蛋IgY比鼠IgG對CyHV-2的親和力更強。而孵育普通卵黃抗體后，反而促進病毒的繁殖，病毒的相對表達量上升了0.25倍，與空白對照組差異顯著。結果表明制備的CyHV-2-ORF72卵黃抗體具有較好的病毒中和作用。

2.4 抗CyHV-2卵黃抗體對患鰓出血病異育銀鯽的免疫保護作用

于5月16日、17日對23 345 m2與53 360 m2試驗池連續(xù)兩次潑灑CyHV-2-ORF72卵黃抗體后，病魚死亡數(shù)量不再上升。兩試驗池分別連續(xù)投喂0.15%和0.30%的抗病毒功能性飼料7 d后，魚的死亡量下降至100尾以下。到7月中旬，水溫穩(wěn)定在28 ℃以上時，魚攝食、生長恢復正常。至9月底10月初，兩個試驗池魚的平均規(guī)格分別達420、470 g/尾。而兩個對照池魚死亡率仍快速上升，5月26日達到1.5尾/m2，成活率僅有31.5%和28.3%。試驗表明，卵黃抗體對患病異育銀鯽具有較好的免疫保護作用，投喂0.30%卵黃抗體的池塘中，魚的成活率高于投喂0.15%的池塘，具體見表1。

表1 抗CyHV-2卵黃抗體對異育銀鯽鰓出血病的治療效果Tab.1 Therapeutic effect of anti-CyHV-2 yolk antibody in allogynogenetic crucian carp with haemorrhagic gill disease

圖4 CyHV-2-ORF72抗體的病毒中和活性Fig.4 The virus-neutralizing activity of anti-CyHV-2-ORF72 antibody *、**和***分別表示與對照組差異顯著水平為 P<0.05、P<0.01和P<0.001。

3 討論

研究顯示，CyHV-2基因組DNA上存在150個保守的開放閱讀框，已證實可編碼74種蛋白，包括3種衣殼蛋白、18種膜蛋白和53種其它蛋白，其中包括衣殼蛋白ORF72在內(nèi)的8種蛋白被發(fā)現(xiàn)存在免疫原性[23]?？咨圃频萚24]證實，CyHV-2的衣殼蛋白72具有較好的免疫原性，鼠抗重組ORF72抗體可以識別CyHV-2病毒粒子的衣殼蛋白72。此外，有研究也顯示，單克隆抗體可特異性識別ORF72蛋白[25]。因此，本研究選取編碼蛋白衣殼的基因ORF72，進行原核表達制備卵黃抗體，Western blot與ELISA檢測分析顯示，該抗體具有特異性強、效價高(1 ∶16 000)等特點。體外病毒中和實驗則表明，抗CyHV-2-ORF72的雞蛋IgY與CyHV-2病毒的親和力顯著強于鼠IgG。生產(chǎn)性臨床試驗結果表明，投喂0.15%至0.30%抗CyHV-2卵黃抗體的全蛋粉，對異育銀鯽具有顯著的免疫保護作用。充分顯示了抗CyHV-2-ORF72的IgY作為生物漁藥防控異育銀鯽鰓出血病的潛力。

卵黃抗體與制備其他動物的血清抗體相比，具有成本低、無創(chuàng)傷、產(chǎn)量大等優(yōu)點，一只雞單月可產(chǎn)生相當于500 mL血清抗體的抗體，含有2%～10%特異性IgY[26]，一年約產(chǎn)生40 g IgY抗體，而一只兔2～3周采一次血，一年約產(chǎn)生1.3 g抗體，使得大規(guī)模制備卵黃抗體成為可能。利用Western blot進行檢測發(fā)現(xiàn)，我們制備的卵黃抗體，稀釋500倍后能夠結合ORF72重組蛋白，而且將ORF72蛋白與卵黃抗體預先結合(封閉抗原表位)后作為一抗孵育，未能夠檢測到目的蛋白條帶，證明了卵黃抗體的特異性。這一結果也為生產(chǎn)應用抗CyHV-2預防和治療異育銀鯽鰓出血病提供了理論依據(jù)。

IgY抗體通常對消化酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶非常穩(wěn)定，盡管在低pH值下胃蛋白酶會造成很高的活性損失[27]。研究表明，在pH值大于3時，IgY對胃蛋白酶具有相對抗性，并保持一定的抗原親和活性。然而，在pH 2下，由于消化，IgY的活性降低[28]。利用β-環(huán)糊精等包膜劑包膜IgY，已被證實在南美白對蝦的腸道中保持了IgY的活性[29]。因此，在制備抗CyHV-2的IgY時，我們采用海藻酸鈉、β-環(huán)狀糊精、羧丙基甲基纖維素等優(yōu)質(zhì)包膜劑包膜，以保護IgY活性；同時，我們發(fā)現(xiàn)全蛋粉與蛋黃粉中卵黃抗體的效價差異不大，如作為飼料添加劑，蛋清還可補充營養(yǎng)元素。因此，采用簡單的加工方式生產(chǎn)全蛋粉，可實現(xiàn)卵黃抗體的規(guī)?；a(chǎn)。所制備的IgY可作為飼料添加劑口服、或采用浸泡等方式群體處理養(yǎng)殖動物，實現(xiàn)生產(chǎn)性規(guī)模化防病抗病目標。