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        抗鯉皰疹Ⅱ型病毒卵黃抗體制備及其功能鑒定

        2021-02-01 02:51:38寇海燕郭培紅田丹陽張婷婷貢成良孫丙耀宋學宏
        淡水漁業(yè) 2021年1期
        關鍵詞:異育銀泳道效價

        寇海燕,郭培紅,田丹陽,何 穩(wěn),李 坤,張婷婷,貢成良,孫丙耀,宋學宏

        (1.蘇州大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學與生物科學學院,江蘇蘇州 215123; 2.昆山貝瑞康生物科技有限公司,江蘇昆山 215345)

        異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是我國廣泛養(yǎng)殖的優(yōu)質雜交鯽,具有抗逆性強、肉質肥美、繁殖速度快等優(yōu)點。但是,由于受鯉皰疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)感染的影響,養(yǎng)殖異育銀鯽爆發(fā)鰓出血病,病魚的鰓、體表多處出血,尾鰭末端發(fā)黑,脾臟、腎臟腫大等癥狀,造成大量死亡[1],給鯽魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經濟損失。為應對CyHV-2帶來的危害,研究者采取了多種方式來控制疾病的爆發(fā)。在飼料中添加免疫活性物質增強魚的體質[2]、改善養(yǎng)殖環(huán)境[3]、制備相關疫苗[5-6]并通過浸泡免疫方式提高異育銀鯽的免疫力,以及藥物防控[7]等措施降低發(fā)病率。但是,這些措施防治效果并不理想。

        卵黃抗體(IgY)被認為是IgG、IgE的祖先,由禽類、兩棲類動物通過血液循環(huán)將血清中抗體轉移到卵黃中產生[8]。IgY能夠抵抗-30 ℃低溫,65 ℃巴氏消毒30 min也不會失活,4 ℃下可以保存5年,室溫下可以存放6個月[9]。其耐受pH為4~10,當pH為4時,經過胃蛋白酶酶解后的Fab’片段能夠保持70% IgY活性[10]。IgY經過海藻糖[11]、殼聚糖、嬰兒奶粉[12,13]等物質微包膜處理后能夠提高其在胃液、腸道中作用時間。與其他抗體相比,它具有成本低、制備過程簡單且無創(chuàng)傷、特異性高、產量大、活性穩(wěn)定等優(yōu)點。近年來,IgY在水生動物疾病防治中的應用日益增多。雷勇等[14]發(fā)現,飼喂0.2%白斑綜合癥病毒(WSSV) IgY的鰲蝦免疫保護率達到70%,而對照組死亡率達到100%。Lee等[15]的研究顯示,IgY顯著降低虹鱒(Oncorhynchusmykiss)腸道和腎臟中魯氏耶爾森菌(Yersiniaruckeri)載量。另外,IgY還對遭受嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[16]、魯氏耶爾森菌[15]、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)[17]、鮰愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)[18]、WSSV[19]、錦鯉皰疹病毒3(CyHV-3)[20]危害的水生動物有保護作用,一定程度上可抑制病原生物的生長[21]。因此,開發(fā)安全有效的IgY以預防異育銀鯽感染CyHV-2具有重要的實踐意義。本研究通過原核表達CyHV-2的ORF72衣殼蛋白免疫蛋雞制備卵黃抗體,并初步加工為微包膜的全蛋粉及蛋黃粉;進行體外中和實驗及生產性治療試驗,驗證了其抗病毒特性,為下一步對鯽攻毒保護研究及用作養(yǎng)殖魚飼料添加劑奠定了基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        原核表達載體pET-28a(+)、大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株由本實驗室保存;鯉魚上皮瘤(epithelioma papulosum cyprinid,EPC)細胞由蘇州大學生化與分子生物實驗室饋贈;異育銀鯽鰓出血病的典型病料由江蘇省鹽城市大豐區(qū)水產技術推廣站提供;110~120日齡的健康蛋雞購自蘇州市吳江區(qū)汾湖鎮(zhèn)紅興禽蛋經營部。HRP-His Tag、HRP標記羊抗雞IgY抗體購自Sigma公司,鼠抗ORF72血清由實驗室前期制備保存[6]。

        1.2 方法

        1.2.1 CyHV-2-ORF72重組蛋白的制備與驗證

        根據NCBI中CyHV-2基因組(GenBank登錄號KT387800)中ORF72的序列設計1對引物,即5′-GCTGGATCCATGTACGGCTTAAACAACGCG-3′和5′-ACAGAATTCAGAGGCCGTTGAATGAATGTATG-3′,以CyHV-2基因組為模板進行PCR擴增。回收PCR產物,對其進行BamH I/EcoR I雙酶切,插入pET-28a(+)載體構建重組質粒。測序驗證后轉入大腸桿菌BL21(DE3),在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中振蕩過夜培養(yǎng),取培養(yǎng)物按1 ∶100的比例接種到2YT誘導培養(yǎng)基中,優(yōu)化IPTG誘導條件后,確定在37 ℃條件下,220 r/min振蕩培養(yǎng)2 h后,在培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度1 mmol/L,27 ℃,100 r/min培養(yǎng)8 h誘導表達。12 000 r/min離心10 min收集菌體,超聲破碎后用SDS-PAGE電泳鑒定誘導表達效果。將IPTG誘導后的總細菌裂解物進行SDS-PAGE電泳,然后轉移至NC膜上,37 ℃孵育Anti-His Tag (HRP)抗體(1 ∶5 000稀釋)2 h;PBST洗滌后加入ECL顯色液用多功能熒光化學發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemScope6300型,上海寰熙醫(yī)療器械有限公司)進行顯影檢測,驗證原核表達的CyHV-2-ORF72重組蛋白(rCyHV-2-ORF72)的正確性。

        1.2.2 免疫與免疫蛋的收集

        將驗證后的表達菌進行大量誘導,收集誘導出的含rCyHV-2-ORF72的菌體沉淀物,加入超聲破碎液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,pH 8.0)于高壓細胞破碎儀中破碎處理20 min,4 ℃條件下18 000 r/min離心20 min。將沉淀重懸于變性裂解液中(10 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris-HCl和8 mol/L尿素),室溫放置60 min后,于4 ℃條件下18 000 r/min離心15 min,收集上清。利用Ni-NTA鎳柱純化重組蛋白,收集蛋白于透析袋中,再先后放置預冷的含6、4、2、1、0.5、0 mol/L尿素復性液中分別透析5 h,再用PBS溶液(0.01 mol/L,pH 7.4)透析12 h,取出透析袋中蛋白,利用BCA蛋白濃度試劑盒測定蛋白濃度,并用SDS-PAGE電泳檢測純化效果。

        將鎳柱純化后的rCyHV-2-ORF72加上其體積4%的吐溫-80,并與含92%白油、6%司班-80、2%硬脂酸鋁的復合佐劑以1 ∶2的比例,7 000 r/min剪切乳化10 min以上,充分乳化后的重組蛋白終濃度為0.5 mg/mL。免疫劑量為每羽蛋雞0.5 mg,初次免疫10 d后同樣劑量進行二次免疫,二免7 d后收集雞蛋,用間接ELISA進行抽樣檢測,當效價達到1 ∶8 000時正式收集雞蛋。5 d抽檢一次,當效價低于1 ∶8 000時,以相同劑量加強免疫。

        1.2.3 卵黃抗體的冷凍干燥加工

        收集效價1 ∶8 000以上的免疫蛋,清洗消毒后分成全蛋組、蛋黃組,稱重待用。蛋液中加入質量百分比分別為1%、2%、3%的海藻酸鈉、β-環(huán)狀糊精、羧丙基甲基纖維素,均質乳化10 min。乳化后轉移至巴氏消毒罐,60 ℃消毒30 min。將消毒后的物料倒入冷凍托盤中,厚度0.5 cm,于-80 ℃凍成固體;再放入真空冷凍干燥機(Lyoquest-55plus,CHRIST公司)中,在真空度20 Pa條件下干燥48 h,獲含特異抗體的凍干全蛋粉及蛋黃粉。

        1.2.4 抗體特異性及效價檢測

        采用Western blot方法檢測抗體的特異性。將誘導后的BL21總細菌裂解物、pET-28a(+)細菌總裂解物、pET-28a(+)-CyHV-2-ORF72細菌總裂解物進行SDS-PAGE電泳分離。經去離子水沖洗后,置于轉膜裝置,冰水浴110 mA濕轉3 h,轉移至NC膜,于Marker條帶處剪開分為A、B二張膜,用PBST緩沖液洗滌3次,每次5 min;接著用2% Casein封閉過夜,棄去封閉液,PBS洗滌3次,每次5 min。洗滌后,分別將A膜、B膜轉移至蛋黃粉溶解液(1 ∶500)和預結合過量rCyHV-2-ORF72的蛋黃粉溶解液(1 ∶500)中,37 ℃孵育1.5 h,PBST洗滌后于HRP-His羊抗雞IgY(1∶500)中37 ℃孵育1 h,經3次PBST溶液洗滌后,加入ECL顯色液,用核酸/蛋白自動曝光儀進行顯影檢測。

        采用ELISA法檢測抗體的效價。將鎳柱純化的rCyHV-2-ORF72溶于PBS溶液至終濃度為10 μg/mL,包被96孔板,以PBS液包被作為空白對照。包被后37 ℃溫育1.5 h,4 ℃過夜;PBS洗滌3次,每次5 min;10%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h;如上洗滌3次。將卵黃抗體凍干粉溶于TBS中,12 000 r/min離心10 min。取上清作為一抗,按照1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000的比例梯度稀釋,每孔加入100 μL,37 ℃濕孵2 h,PBST洗滌3次,每次5 min,以免疫前蛋粉作為抗體的陰性對照,洗滌后每孔加入100 μL HRP標記羊抗雞IgY抗體(1 ∶2 000),37 ℃濕孵1.5 h。洗滌后每孔加入100 μL ELISA顯色劑(OPD顯色底物),避光反應3~5 min后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應,用酶標儀測定樣品OD490值,以P/N>2 ∶1的最高稀釋度作為抗體效價的評判依據,P/N=(待測抗體的OD值-空白對照OD值)/(陰性對照OD值-空白對照OD值)。

        1.2.5 抗體中和實驗

        將0.2 g感染CyHV-2發(fā)病的異育銀鯽體腎組織加入5 mL PBS緩沖液(0.01 mol/L,pH 7.4),冰浴研磨,4 ℃下8 000 r/min離心15 min,收集上清后經0.22 μm濾膜過濾除菌獲病毒粗提液,接種于單層EPC細胞上,待細胞出現病變現象后收集上清,再次感染單層EPC細胞獲實驗用病毒液。

        用M199培養(yǎng)基將鼠正常血清、鼠抗ORF72血清稀釋100倍,普通蛋粉、含ORF72卵黃抗體的蛋粉稀釋10倍渦旋混勻后用0.22 μm濾膜過濾除菌,獲抗體稀釋液。

        各取上述抗體稀釋液、CyHV-2病毒濾液200 μL于1.5 mL EP管中,M199培養(yǎng)基為空白對照,26 ℃孵育1 h,期間顛倒混勻4~6次。將混合液加入到六孔板內約80%匯合度的單層EPC細胞中,每組設置3個重復孔,26 ℃孵育4 h后吸出混合液,經M199培養(yǎng)基洗滌3次后,加入含2%~3% FBS的M199維持培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。4 d后收集細胞,提取細胞基因組DNA,以EPC細胞的β-actin作為內參基因(引物序列為5′-GGAGCCGTTATCAACGACCA-3′和5′-GCTTGGTTTCATCCCTGTGC-3′),進行實時定量PCR分析,以檢測CyHV-2 Hel基因(引物序列為5′-GGGTGAGGACTTGCGAAGAG-3′和5′-CGCTCGTCCGGGTTCTGCACG-3′)的相對表達水平,以此指示病毒量。PCR反應體系擴增條件為:95 ℃預變性3 min;隨后39個循環(huán):95 ℃ 10 s,60 ℃ 1 min。基因表達水平以2-ΔΔCT法[22]計算。

        1.2.6 卵黃抗體生產性應用試驗

        鹽城市大豐區(qū)某養(yǎng)殖戶的4個養(yǎng)殖池,1、2、3、4號池的面積分別為30 015、40 020、23 345、53 360 m2。3月下旬放養(yǎng)異育銀鯽3尾/m2,平均規(guī)格150 g/尾。5月8日發(fā)現各池均出現鯽魚死亡,病魚體重約250 g/尾,具明顯的鰓出血癥狀,從5月8-15日,各池魚的死亡量從數尾快速上升為數百尾。發(fā)病池的水質良好,溶氧在6.2~8.5 mg/L,pH值7.5~8.0,透明度達到35 cm左右。當地水產技術推廣部門進行PCR檢測分析證實鯽魚罹患鰓出血病。選擇1、2號池為對照池,采用口服維生素C,晚上9點開始增氧至第2天清晨;定期潑灑微生態(tài)制劑調節(jié)水質等常規(guī)處理方式提高病魚的抗應激能力,減少死亡率。3、4號池作為試驗池,在常規(guī)處理方式的基礎上全池潑灑和口服效價為1 ∶16 000的抗CyHV-2病毒的卵黃抗體。其中3號池在第1、2天每天全池潑灑,劑量為1 g/m3;第3天開始投喂卵黃抗體,按飼料重量0.15%的劑量拌入鯽魚商品飼料中制成功能性飼料,按1%魚體重的投喂量投喂。4號池將飼料中卵黃抗體添加量增加到0.30%,其他治療方法與3號池相同。在病情好轉后,飼料投喂量增加到2%,早晚各投喂一次。試驗從5月13日開始,7月中旬鯽吃食、生長完全正常,水溫穩(wěn)定在28 ℃后改投普通商品飼料。試驗過程中每天記錄死魚情況、魚的攝食狀態(tài)及用藥情況,9月底捕撈上市,統(tǒng)計成活率、規(guī)格與產量。

        1.3 統(tǒng)計方法

        使用SPSS統(tǒng)計軟件19.0進行數據統(tǒng)計分析,所有定量數據均表示為平均值±SEM;差異顯著為P<0.05,差異極顯著為P<0.01。以GraphPad Prism 5.0繪圖。

        2 結果

        2.1 CyHV-2-ORF72重組蛋白原核表達及純化

        CyHV-2-ORF72重組蛋白原核表達產物大小為43 kDa左右,與預測大小吻合,推測誘導出了rCyHV-2-ORF72蛋白。表達產物經破碎、離心、鎳柱純化后獲較純的rCyHV-2-ORF72(圖1)。圖1顯示,rCyHV-2-ORF72主要表達在包涵體中,少量為融合蛋白;超聲與高壓破碎、鎳柱純化后獲較純的重組蛋白。經鎳柱純化后的重組蛋白純度在80%以上。鎳柱純化的蛋白經復性、透析后測得蛋白濃度為1.2 mg/mL。用Anti-His Tag (HRP)抗體進行Western blot鑒定結果顯示,原核表達產物在43 kDa附近出現褐色條帶,空載體pET-28a(+)總細菌裂解物未出現條帶,進一步證明誘導出的重組蛋白特異性強(如圖2)。

        圖1 CyHV-2-ORF72重組蛋白誘導表達的SDS-PAGE鑒定Fig.1 SDS-PAGE analysis of recombinant CyHV-2-ORF72 capsid protein

        M,蛋白質分子量標準;泳道1,鎳柱純化后的CyHV-2-ORF72(剪頭所指);泳道2,高壓破碎后的離心沉淀;泳道3,誘導細菌超聲破碎后離心沉淀;泳道4,誘導細菌破碎后離心上清;泳道5,誘導后pET-28a(+)-CyHV-2-ORF72/BL21總細菌裂解物M,蛋白質分子量標準;泳道1,pET-28a(+)-CyHV-2-ORF72/BL21總細菌裂解物,剪頭所指為CyHV-2-ORF72;泳道2,pET-28a(+)/BL21空載總細菌裂解物。

        圖2 CyHV-2-ORF72重組蛋白的Western blot驗證Fig.2 Western blot detection of recombinant CyHV-2-ORF72 capsid protein

        2.2 凍干全蛋粉、蛋黃粉中ORF72抗體特異性及效價檢測

        全蛋粉、蛋黃粉中ORF72抗體特異性的結果如圖3。圖3A顯示,孵育CyHV-2-ORF72抗體后,在43 kDa大小附近出現一條褐色目標條帶,而陰性對照組未出現條帶,表明卵黃抗體中產生了CyHV-2-ORF72重組蛋白的特異性抗體;進一步用過量的rCyHV-2-ORF72預結合卵黃抗體(即封閉抗體后再進行Western blot檢測),在43 kDa處的褐色條帶消失(圖3B),證明了卵黃抗體的特異性。

        圖3 蛋粉中抗ORF72衣殼蛋白抗體的特異性檢測Fig.3 The specificity of anti-ORF72 capsid protein antibody in egg yolk and whole egg powder

        M,蛋白質分子量標準;泳道1,BL21空菌總細菌裂解物;泳道2,pET-28a(+)/BL21空載總細菌裂解物;泳道3,pET-28a(+)-CyHV-2-ORF72/BL21總細菌裂解物。剪頭所指為CyHV-2-ORF72。A,蛋粉稀釋液;B,以過量的CyHV-2-ORF72蛋白預結合后的蛋粉稀釋液利用間接ELISA檢測凍干全蛋粉與蛋黃粉中抗體的效價,根據P/N>2.1計算,結果顯示,全蛋粉中的CyHV-2-ORF72抗體效價為1 ∶8 000;蛋黃中的效價達到1 ∶16 000。全蛋粉中的抗體效價略低于蛋黃。

        2.3 卵黃抗體與CyHV-2的親和力

        對EPC細胞中CyHV-2病毒解螺旋酶(Hel)基因進行實時定量PCR分析,并以空白對照中Hel基因的Ct值為基線1,計算其它各組Hel基因的表達量,結果如圖4所示。rCyHV-2-ORF72免疫小鼠的抗血清、抗CyHV-2-ORF72卵黃抗體孵育CyHV-2病毒后,Hel基因表達水平分別下調28%倍和60%,與空白對照組和陰性對照組差異極顯著,說明鼠IgG、雞蛋IgY均降低了病毒量,且雞蛋IgY比鼠IgG對CyHV-2的親和力更強。而孵育普通卵黃抗體后,反而促進病毒的繁殖,病毒的相對表達量上升了0.25倍,與空白對照組差異顯著。結果表明制備的CyHV-2-ORF72卵黃抗體具有較好的病毒中和作用。

        2.4 抗CyHV-2卵黃抗體對患鰓出血病異育銀鯽的免疫保護作用

        于5月16日、17日對23 345 m2與53 360 m2試驗池連續(xù)兩次潑灑CyHV-2-ORF72卵黃抗體后,病魚死亡數量不再上升。兩試驗池分別連續(xù)投喂0.15%和0.30%的抗病毒功能性飼料7 d后,魚的死亡量下降至100尾以下。到7月中旬,水溫穩(wěn)定在28 ℃以上時,魚攝食、生長恢復正常。至9月底10月初,兩個試驗池魚的平均規(guī)格分別達420、470 g/尾。而兩個對照池魚死亡率仍快速上升,5月26日達到1.5尾/m2,成活率僅有31.5%和28.3%。試驗表明,卵黃抗體對患病異育銀鯽具有較好的免疫保護作用,投喂0.30%卵黃抗體的池塘中,魚的成活率高于投喂0.15%的池塘,具體見表1。

        表1 抗CyHV-2卵黃抗體對異育銀鯽鰓出血病的治療效果Tab.1 Therapeutic effect of anti-CyHV-2 yolk antibody in allogynogenetic crucian carp with haemorrhagic gill disease

        圖4 CyHV-2-ORF72抗體的病毒中和活性Fig.4 The virus-neutralizing activity of anti-CyHV-2-ORF72 antibody *、**和***分別表示與對照組差異顯著水平為 P<0.05、P<0.01和P<0.001。

        3 討論

        研究顯示,CyHV-2基因組DNA上存在150個保守的開放閱讀框,已證實可編碼74種蛋白,包括3種衣殼蛋白、18種膜蛋白和53種其它蛋白,其中包括衣殼蛋白ORF72在內的8種蛋白被發(fā)現存在免疫原性[23]。孔善云等[24]證實,CyHV-2的衣殼蛋白72具有較好的免疫原性,鼠抗重組ORF72抗體可以識別CyHV-2病毒粒子的衣殼蛋白72。此外,有研究也顯示,單克隆抗體可特異性識別ORF72蛋白[25]。因此,本研究選取編碼蛋白衣殼的基因ORF72,進行原核表達制備卵黃抗體,Western blot與ELISA檢測分析顯示,該抗體具有特異性強、效價高(1 ∶16 000)等特點。體外病毒中和實驗則表明,抗CyHV-2-ORF72的雞蛋IgY與CyHV-2病毒的親和力顯著強于鼠IgG。生產性臨床試驗結果表明,投喂0.15%至0.30%抗CyHV-2卵黃抗體的全蛋粉,對異育銀鯽具有顯著的免疫保護作用。充分顯示了抗CyHV-2-ORF72的IgY作為生物漁藥防控異育銀鯽鰓出血病的潛力。

        卵黃抗體與制備其他動物的血清抗體相比,具有成本低、無創(chuàng)傷、產量大等優(yōu)點,一只雞單月可產生相當于500 mL血清抗體的抗體,含有2%~10%特異性IgY[26],一年約產生40 g IgY抗體,而一只兔2~3周采一次血,一年約產生1.3 g抗體,使得大規(guī)模制備卵黃抗體成為可能。利用Western blot進行檢測發(fā)現,我們制備的卵黃抗體,稀釋500倍后能夠結合ORF72重組蛋白,而且將ORF72蛋白與卵黃抗體預先結合(封閉抗原表位)后作為一抗孵育,未能夠檢測到目的蛋白條帶,證明了卵黃抗體的特異性。這一結果也為生產應用抗CyHV-2預防和治療異育銀鯽鰓出血病提供了理論依據。

        IgY抗體通常對消化酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶非常穩(wěn)定,盡管在低pH值下胃蛋白酶會造成很高的活性損失[27]。研究表明,在pH值大于3時,IgY對胃蛋白酶具有相對抗性,并保持一定的抗原親和活性。然而,在pH 2下,由于消化,IgY的活性降低[28]。利用β-環(huán)糊精等包膜劑包膜IgY,已被證實在南美白對蝦的腸道中保持了IgY的活性[29]。因此,在制備抗CyHV-2的IgY時,我們采用海藻酸鈉、β-環(huán)狀糊精、羧丙基甲基纖維素等優(yōu)質包膜劑包膜,以保護IgY活性;同時,我們發(fā)現全蛋粉與蛋黃粉中卵黃抗體的效價差異不大,如作為飼料添加劑,蛋清還可補充營養(yǎng)元素。因此,采用簡單的加工方式生產全蛋粉,可實現卵黃抗體的規(guī)?;a。所制備的IgY可作為飼料添加劑口服、或采用浸泡等方式群體處理養(yǎng)殖動物,實現生產性規(guī)?;啦】共∧繕恕?/p>

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