魏忠平，谷雷嚴(yán)，羅 慶，王 輝，馬冬菁，武文昊

（1.遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院，沈陽(yáng)110032；2.沈陽(yáng)大學(xué) 區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110044；3.遼寧省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃監(jiān)測(cè)院，沈陽(yáng)110122）

當(dāng)前，我國(guó)重金屬污染物排放總量仍處于高位水平，重金屬污染依然較為嚴(yán)重，鎘（Cd）、鉛（Pb）作為重要的金屬資源在工業(yè)生活中被廣泛使用，在造福人類(lèi)的同時(shí)也造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染[1]。 土壤中的重金屬能夠通過(guò)影響植物根系吸收營(yíng)養(yǎng)元素、 引起植物細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變以及影響植物光合作用和呼吸作用等嚴(yán)重影響植物發(fā)育和作物的產(chǎn)量并通過(guò)食物鏈放大最終危害人體健康[2]。 已有研究表明，土壤中Cd、Pb 可能對(duì)玉米籽粒中的蛋白質(zhì)含量造成影響[3]，Pb 污染會(huì)抑制辣椒的萌發(fā)[4]。 目前，土壤重金屬污染修復(fù)技術(shù)主要包括稀釋法、固定/穩(wěn)定化技術(shù)[5]、化學(xué)還原法[6]、土壤淋洗[7]、電動(dòng)修復(fù)法[8-9]和生物修復(fù)法[10]等。 同其他修復(fù)技術(shù)相比，生物修復(fù)法因具有成本低、易操作、生態(tài)友好等優(yōu)點(diǎn)[11]而具有廣闊的應(yīng)用前景。生物修復(fù)還可以進(jìn)一步細(xì)化為植物修復(fù)、微生物修復(fù)和植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)[12]。 雖然在實(shí)驗(yàn)室的理想化條件下微生物修復(fù)技術(shù)的表現(xiàn)良好[13]，但是具體到實(shí)際環(huán)境時(shí)，由于干擾因素較多，如溫度、pH 值等，會(huì)使該技術(shù)受到限制而無(wú)法發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)。 相比之下，植物修復(fù)技術(shù)對(duì)環(huán)境條件有更強(qiáng)的適應(yīng)性，其抗性強(qiáng)、耐受重金屬濃度高的特點(diǎn)已成為研究熱點(diǎn)[14]。

植物修復(fù)技術(shù)當(dāng)前主要存在著修復(fù)效率較低、修復(fù)周期長(zhǎng)的問(wèn)題。 添加有機(jī)酸能夠增加土壤中Cd、Pb 的有效態(tài)含量，提高其生物有效性，進(jìn)而促進(jìn)植物對(duì)Cd、Pb 的轉(zhuǎn)運(yùn)和富集。 研究表明，有機(jī)螯合劑（檸檬酸，乙酸，蘋(píng)果酸，草酸等）的應(yīng)用顯著提高了各種植物物種對(duì)金屬的吸收[15]。 例如，向土壤中添加乙二胺四乙酸（EDTA）后，其以自由形式進(jìn)入植物根系，在根系與金屬結(jié)合并增強(qiáng)金屬在植物體內(nèi)的流動(dòng)性[16]，有效態(tài)Pb 含量顯著提高[17-18]，顯著促進(jìn)了植物地上部對(duì)Pb 的吸收[19]。添加外源檸檬酸對(duì)Cd 從根部遷移至地上部具有積極作用[20-21]。外源蘋(píng)果酸和乙酸可減少Cd 的植物毒性并增強(qiáng)Cd 在向日葵植物根系中的積累[22]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，東南景天在受到Cd、Pb 脅迫時(shí)，根際草酸分泌量較未受脅迫時(shí)有顯著增加[23]。 因此，本研究以超富集植物東南景天為研究對(duì)象，探討草酸添加對(duì)東南景天富集土壤中Cd、Pb 的促進(jìn)作用，并考察添加草酸對(duì)土壤pH 值、有機(jī)碳、營(yíng)養(yǎng)元素等理化性質(zhì)的影響，以期為提高重金屬污染土壤的植物修復(fù)效率提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 盆栽試驗(yàn)

供試土壤采自遼寧省沈陽(yáng)市沈北新區(qū)一塊重金屬污染農(nóng)田，采樣深度為0～20cm。土樣經(jīng)自然風(fēng)干后，剔除其中的石塊和動(dòng)植物殘?bào)w，部分大顆粒經(jīng)碾碎過(guò)孔徑為2mm 的標(biāo)準(zhǔn)篩貯存?zhèn)溆?。該土壤樣品的理化性質(zhì)為：土壤有機(jī)質(zhì)含量為5.44%，陽(yáng)離子交換量為13.09cmol·kg-1，pH 值7.17，土壤容重1220kg·m-3，粘粒、粉粒和砂粒含量分別為26.11%、72.82%、1.07%，重金屬Cd、Pb 的平均含量分別為0.61mg·kg-1和135.4mg·kg-1。

供試植物富集生態(tài)型東南景天（Sedum alfredii）采集自浙江省衢州市一個(gè)古老的鉛鋅礦區(qū)，地理坐標(biāo)為：東經(jīng)118°56"，北緯29°17"。

準(zhǔn)確稱(chēng)取3kg 土壤樣品裝入深40cm 的花盆中，加入分析純KH2PO4300mg·kg-1、NH4NO3400mg·kg-1作為基肥，混勻，并加水保持持水量為50%～60%，穩(wěn)定5d 后備用。試驗(yàn)共設(shè)置6 個(gè)處理，重復(fù)3 次（表1）。東南景天移栽1 個(gè)月后（此時(shí)東南景天已長(zhǎng)出較旺盛根系）施用草酸淋洗劑，東南景天移栽4 個(gè)月后收獲。 分別收集東南景天的地上部和根部， 分別收集0～20cm 和20～40cm兩個(gè)土層的東南景天根際土。

1.2 土壤及植物樣品中重金屬的測(cè)定

將收獲的東南景天于105 ℃烘箱中殺青30min，然后在60℃條件下烘干至恒重，測(cè)定干物質(zhì)量。 用研缽將植物研碎磨細(xì)，過(guò)0.9mm 篩，使用HNO3/HCl 雙酸法進(jìn)行電熱板消解，火焰原子吸收分光光度法測(cè)定Cd、Pb 濃度[24]。

表1 草酸強(qiáng)化植物修復(fù)試驗(yàn)處理Table 1 Treatments of oxalic acid reinforced phytoremediation

土壤樣品使用HNO3/HCl 雙酸法進(jìn)行電熱板消解，火焰原子吸收分光光度法測(cè)定Cd、Pb 濃度[24]。

1.3 土壤理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤pH 值測(cè)定采用酸度pH 計(jì)法[25]；土壤陽(yáng)離子交換量測(cè)定采用乙酸銨交換法[26]；土壤有機(jī)碳測(cè)定采用重鉻酸鉀外加熱法[27]；全氮測(cè)定采用半微量開(kāi)氏法[28]；全磷測(cè)定采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法[29]；全鉀測(cè)定采用氫氧化鈉熔融-火焰光度法[30]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Origin 9.0(Origin Lab Corporation,Northampton,MA)作圖，采用SPSS 24.0 進(jìn)行單因素方差分析[最小顯著差數(shù)法（LSD），不同字母表示不同處理間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 草酸添加對(duì)土壤中Cd、Pb 含量的影響

圖1 是東南景天移栽前和收獲后表層（0～20cm）和底層（20～40cm）土壤中Cd 的含量以及表層和底層土壤中Cd 的消減率和增加率。 由圖1 可知，對(duì)照的表層土壤中Cd 含量有一定的減少，這可能是澆水形成的淋濾作用，導(dǎo)致表層土壤中的Cd 進(jìn)入到底層土壤，但這種由水產(chǎn)生的淋濾作用非常細(xì)微。 種植東南景天后，表層土壤中Cd 含量有一個(gè)顯著的下降，下降率為21.4%；而底層土壤中Cd 含量卻有一定的增加，增加率為1.6%。 這表明東南景天僅能吸收富集其根際土壤中的Cd，底層土壤遠(yuǎn)離其根部，底層土壤中的Cd 未被東南景天吸收富集。底層土壤中Cd 含量的增加，原因與對(duì)照相似，可能是由澆水形成的淋濾作用導(dǎo)致。

當(dāng)施用草酸淋洗液后，表層土壤中的Cd 含量進(jìn)一步下降，下降率隨著草酸淋洗液濃度的增加而顯著增加，當(dāng)草酸濃度為50mmol·kg-1土?xí)r，下降率達(dá)到63.5%。而底層土壤中Cd 含量一直增加，當(dāng)草酸濃度為50mmol·kg-1土?xí)r，底層土壤中Cd 增加量為0.06mg·kg-1，增加率到達(dá)10.5%，與20mmol·kg-1土的草酸淋洗液相比，增加率有一個(gè)明顯的提高。 這表明草酸的添加能顯著提升東南景天的修復(fù)效率，但當(dāng)草酸添加濃度過(guò)大時(shí)，草酸活化的Cd 過(guò)量，而東南景天吸收富集Cd 的速率一定，多余的Cd 就會(huì)通過(guò)淋濾作用進(jìn)入到下層土壤，對(duì)下層土壤造成污染。 因此，應(yīng)選擇既能夠促進(jìn)東南景天的修復(fù)效率、又能夠不形成淋濾作用對(duì)下層土壤造成污染的合適的草酸添加濃度。 本試驗(yàn)表明，草酸的添加量為20mmol·kg-1土?xí)r，可滿(mǎn)足該要求。

圖1 表層和底層土壤Cd 含量Figure 1 The content of Cd in top and bottom soil

圖2 是東南景天移栽前和收獲后表層和底層土壤中Pb 的含量以及表層和底層土壤中Pb 的削減率和增加率。 由圖2 可知，土壤中Pb 的變化趨勢(shì)與Cd 的變化趨勢(shì)相似。 種植東南景天能顯著降低表層土壤中Pb 的含量，草酸能顯著促進(jìn)東南景天對(duì)Pb 的修復(fù)效率。 草酸添加的濃度越高，表層土壤中Pb 含量降低的越多。 由于淋濾作用，底層土壤中的Pb 含量一直呈增加趨勢(shì)，當(dāng)草酸濃度增加到50mmol·kg-1土?xí)r，底層土壤中Pb 增加量為20mg·kg-1，增加率達(dá)到14.8%，與20mmol·kg-1土?xí)r的3.6%相比，增加率有一個(gè)明顯的提高。 這也表明草酸的添加能顯著增加?xùn)|南景天的修復(fù)效率，但當(dāng)草酸添加濃度過(guò)大時(shí)，草酸活化的Pb 過(guò)量，而東南景天吸收富集Pb 的速率一定，多余的Pb 就會(huì)通過(guò)淋濾作用進(jìn)入到下層土壤，對(duì)下層土壤造成污染。 因此，本研究選擇草酸的添加量為20mmol·kg-1土。

圖2 表層和底層土壤Pb 含量Figure 2 The content of Pb in top and bottom soil

2.2 草酸添加對(duì)東南景天中Cd、Pb 含量的影響

由圖3 可知，施用草酸淋洗液后，東南景天地上部和根中Cd、Pb 含量均增加，并且隨著草酸淋洗液濃度的增加而顯著增加， 這表明草酸能夠促進(jìn)東南景天對(duì)重金屬Cd、Pb 的吸收富集。 但是， 當(dāng)草酸淋洗液濃度從20mmol·kg-1土增加到50mmol·kg-1土?xí)r，東南景天地上部和根中Cd、Pb 含量差異不顯著，這表明東南景天對(duì)Cd、Pb 的吸收富集趨于飽和。

不同深度土壤中Cd、Pb 含量的變化情況和東南景天中Cd、Pb 含量的變化情況均表明，草酸能夠促進(jìn)東南景天對(duì)土壤中Cd、Pb 的吸收富集，但過(guò)量的草酸會(huì)導(dǎo)致表層土壤中的Cd、Pb 向下層土壤遷移，污染下層土壤。因此， 選擇20mmol·kg-1土的草酸添加濃度較為合適， 既可最大限度促進(jìn)東南景天對(duì)土壤中Cd、Pb 的吸收富集，又能確保表層土壤中的Cd、Pb 不向下層遷移。

圖3 東南景天Cd、Pb 含量Figure 3 The content of Pb and Cd in S.alfredii

2.3 草酸添加對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

為評(píng)估草酸添加對(duì)土壤理化性質(zhì)、土壤質(zhì)量的影響，本研究分析了6 個(gè)處理?xiàng)l件下土壤pH 值、土壤有機(jī)碳含量以及土壤營(yíng)養(yǎng)元素全氮、全磷和全鉀的含量。 由圖4 可知，當(dāng)草酸添加量較少時(shí)，土壤pH 值的變化較小，可忽略。 當(dāng)草酸添加量增加到50mmol·kg-1土?xí)r，土壤pH 值從7.17 降至7.02，對(duì)土壤表現(xiàn)出一定的酸化作用。 種植東南景天后，土壤的有機(jī)碳含量有一定程度的增加，增加量約為0.2%，這可能是東南景天根系分泌物以及根系在土壤中的殘留，使得土壤有機(jī)碳含量增加。 添加草酸與未添加草酸種植東南景天相比，土壤有機(jī)碳含量變化較小，表明草酸的添加對(duì)土壤有機(jī)碳含量沒(méi)有影響。 與對(duì)照相比，種植東南景天降低了土壤營(yíng)養(yǎng)元素全氮、全磷和全鉀的含量，降低量分別為0.16，0.11 和0.26g·kg-1，這可能是東南景天在生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的攝取，使得土壤中營(yíng)養(yǎng)元素氮磷鉀的減少。添加草酸與未添加草酸種植東南景天相比，土壤中全氮、全磷和全鉀的含量變化較小，這表明草酸的添加對(duì)土壤中營(yíng)養(yǎng)元素全氮、全磷和全鉀的含量沒(méi)有影響。

圖4 表層土壤的pH 值，有機(jī)碳和全氮、全磷、全鉀含量Figure 4 The pH, the content of organic carbon and N, P and K in topsoil

3 討論與結(jié)論

植物對(duì)金屬的吸收富集包括金屬在土壤中的解吸、可溶性重金屬通過(guò)擴(kuò)散或質(zhì)量流遷移至根系表面、根對(duì)金屬的吸收和向地上部轉(zhuǎn)移等一系列過(guò)程。 東南景天主要通過(guò)共質(zhì)體運(yùn)輸完成對(duì)土壤中Cd 的根部吸收、木質(zhì)部裝載、轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部[31]。 外源小分子有機(jī)酸的添加會(huì)導(dǎo)致東南景天根際的pH 值降低，與金屬離子絡(luò)合，從而影響土壤對(duì)金屬離子的吸附和植株對(duì)金屬離子的吸收[32]。 已有研究表明，草酸施加量與土壤中可交換態(tài)Cd 呈顯著正相關(guān)，添加草酸后，重金屬離子被活化,可交換態(tài)重金屬含量增加，同時(shí)提高了重金屬在土壤溶液中移動(dòng)性,使根系能有更多的機(jī)會(huì)與重金屬接觸，加速了其向木質(zhì)部的轉(zhuǎn)運(yùn)，相較于對(duì)照組可以看到表層土壤內(nèi)的Cd和Pb 濃度有一個(gè)顯著的下降，說(shuō)明草酸對(duì)東南景天吸收富集Pb 和Cd 有顯著的促進(jìn)作用[33]。 LI 等[34]在試驗(yàn)中觀(guān)察到在1.5mmol·L-1檸檬酸和3mmol·L-1草酸處理下，苧麻根部對(duì)Cd 的吸附分別提高1.3 倍和1.2 倍，地上部Cd 均增加2 倍。 這與本研究結(jié)果基本一致。

Cd 和Pb 在東南景天地上部和地下部的分布存在差異，表現(xiàn)在植物地上部Cd 濃度遠(yuǎn)高于地下部，Pb 濃度地下部高于地上部，這與之前的研究一致[35-37]，即植物各部對(duì)Cd 的富集能力：葉＞莖＞根；對(duì)Pb 的富集能力：根＞莖＞葉。 有研究表明，東南景天根部Pb、Cd 都主要分布于根尖分生組織和中柱里[38]，隨著與根面距離的增加,土壤有效態(tài)Cd、Pb 的含量表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)[39]。植物葉片中部Cd 在維管組織和上皮層含量較高，Pb 主要積累在葉脈中，其次則是表皮；在植物莖部90%以上的Pb 積累于維管束中[20]。 LI 等[34]推測(cè)了Cd 在植物體內(nèi)的分布過(guò)程：pH 值的增加以及有機(jī)酸中強(qiáng)有機(jī)配體的釋放進(jìn)入植物-溶液界面，增加了Cd 的溶解度和有效性，促進(jìn)了Cd 被苧麻根系吸收并轉(zhuǎn)移到莖部；質(zhì)膜中的ATP 酶被激活，導(dǎo)致負(fù)責(zé)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)的離子發(fā)生改變所以轉(zhuǎn)移因子增加；有機(jī)酸螯合重金屬有效參與植物木質(zhì)部金屬離子遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)運(yùn)，避免了游離金屬離子毒性；螯合-金屬?gòu)?fù)合體可能通過(guò)破壞根內(nèi)皮層和卡氏帶進(jìn)入植物組織，隨后在蒸騰作用的協(xié)助下向上遷移到地上部。

韓洋等[43]的研究表明，添加少量草酸并不會(huì)對(duì)土壤pH 值產(chǎn)生影響，這與本研究結(jié)果一致。通過(guò)比較空白樣本可以看出，種植東南景天后土壤氮磷鉀含量有少許下降，氮、磷、鉀被視為植物合成自身所需蛋白質(zhì)、葉綠素和酶以及影響自身代謝的重要物質(zhì)，對(duì)植物完成自身生理活動(dòng)起關(guān)鍵作用。 植物對(duì)Cd 的吸收是一個(gè)能量依賴(lài)的活性過(guò)程，因此可能存在添加草酸之后東南景天加速吸收重金屬導(dǎo)致植物自身能量消耗速度加快，從而導(dǎo)致土壤中氮、磷、鉀含量的下降，但是目前來(lái)看這種影響十分微小[31]。雖然有研究表明，乙酸、檸檬酸等有機(jī)酸對(duì)土壤的淋洗可通過(guò)溶解土壤中原有氧化物、碳酸鹽和有機(jī)質(zhì)等造成土壤物理化學(xué)性質(zhì)的改變[40-42]，但是本研究的結(jié)果表明，草酸的添加對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響微小，通過(guò)顯著性差異分析可以看出添加草酸前后土壤理化性質(zhì)并無(wú)顯著變化。 其原因可能是土壤淋洗是短時(shí)間、瞬時(shí)的，沒(méi)有考慮土壤本身具有強(qiáng)大的緩沖能力和自?xún)裟芰Α?/p>

總的來(lái)看，添加草酸能夠顯著提高東南景天對(duì)Cd 和Pb 污染土壤的修復(fù)效率，草酸添加量為20mmol·kg-1土?xí)r最為合適，在這一條件下既能顯著促進(jìn)東南景天吸收富集表層土壤中的Cd 和Pb，又不會(huì)因過(guò)量活化Cd、Pb 使其通過(guò)淋濾作用向下遷移污染底層土壤。 本研究結(jié)果還表明，添加草酸不會(huì)對(duì)土壤Ph 值、有機(jī)碳和氮磷鉀含量造成明顯的影響。