陳 罡，卜鵬圖，于世河，陸愛君，王騫春，王敬賢，馮 健

（遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院， 沈陽110032）

蒙古櫟(Quercus mongolica Fisch)為殼斗科櫟屬，是在我國分布最北的櫟屬物種，在中國的分布區(qū)域總體呈東北-西南走向, 連續(xù)性分布和非連續(xù)性分布共存[1]。 蒙古櫟是我國東北和華北地區(qū)針闊葉混交林的主要建群種，是落葉櫟類植物中抗逆性較強的林木，具有很好的涵水和保土作用；蒙古櫟也是我國重要的工業(yè)和生態(tài)經(jīng)濟樹種，其材質(zhì)堅硬耐腐，紋理優(yōu)美，可用于制作地板；樹皮中單寧、鞣質(zhì)含量豐富，可用作多種工業(yè)原料；同時，其種子富含淀粉，可食用，葉子可養(yǎng)蠶以及飼養(yǎng)動物[2]。因此，蒙古櫟具有很高的經(jīng)濟和生態(tài)價值。蒙古櫟在遼寧分布面積較大，是遼寧東部山區(qū)面積最大的森林植被類型。近年來，原生蒙古櫟天然林受人為影響，有些地區(qū)的群體處于漸危或瀕危狀態(tài)，種質(zhì)資源和遺傳多樣性受到破壞，因此，急需對蒙古櫟現(xiàn)存的種質(zhì)資源進行多樣性研究，摸清其分布區(qū)內(nèi)遺傳多樣性水平及遺傳分化的程度，進而為蒙古櫟種質(zhì)資源的保存、育種和培育提供必要的分子水平的遺傳背景[3]。 現(xiàn)有研究表明，不同分布區(qū)的蒙古櫟群體遺傳學(xué)特征和遺傳背景尚不完全清楚，不同研究方法的結(jié)果和結(jié)論差異明顯，這嚴(yán)重影響了蒙古櫟的科學(xué)保護和合理利用。

目前，利用分子標(biāo)記技術(shù)對蒙古櫟遺傳變異水平的研究主要為等位酶、RAPD、ISSR、AFLP 等[4]，所用的標(biāo)記不同，揭示的蒙古櫟遺傳水平也不盡相同。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，共顯性、高多態(tài)性、穩(wěn)定性好、基因組廣泛分布的微衛(wèi)星分子標(biāo)記(microsatellite，SSR)技術(shù)逐步發(fā)展并被引入到櫟屬物種的群體遺傳學(xué)研究中[5-7]。 已有相關(guān)研究表明，櫟屬物種的SSR 遺傳多樣性是比較高的，研究結(jié)果也顯示其群體間存在較高的基因流[8]，但對于櫟屬物種，很多研究所用到的SSR 標(biāo)記都是利用其在近緣物種間的保守性和通用性[9]，迄今為止可用的蒙古櫟SSR 標(biāo)記數(shù)量還比較少[10-12]，除轉(zhuǎn)移自近緣物種的SSR 標(biāo)記，針對蒙古櫟基因組和遺傳背景開發(fā)的高特異性的SSR 標(biāo)記極為有限。 因此，開發(fā)蒙古櫟SSR 標(biāo)記特異引物用于蒙古櫟遺傳多樣性研究十分必要。 基于此，本研究在前期工作中利用新一代測序技術(shù)（NGS）全新開發(fā)了一批多態(tài)性好、試驗重復(fù)性好的蒙古櫟SSR 標(biāo)記。在本研究中，應(yīng)用這些新的蒙古櫟專有SSR 標(biāo)記，對采集自遼寧省的8 個蒙古櫟天然群體的遺傳變異進行研究，旨在為蒙古櫟種質(zhì)資源的遺傳改良、多樣性保護及育種造林提供遺傳學(xué)基礎(chǔ)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

2018 年6 月下旬，課題組在遼寧省蒙古櫟分布區(qū)采集了8 個天然群體的蒙古櫟葉片，硅膠干燥保存?zhèn)溆谩＿@8 個群體基本覆蓋了蒙古櫟在遼寧省的分布范圍，分別是：撫順大孤家（DA），撫順哈達(dá)（HA），丹東寬甸（KUAN），朝陽凌源（LING），本溪清河城（QING），鳳城土城子（TU），撫順灣甸子（WAN），鐵嶺西豐（XIFENG）。每個群體選擇15～20 株的樹木(個體)，每個個體之間至少相隔50 m，采樣點基本情況見表1。

1.2 DNA 提取方法

基因組總DNA 抽提采用CTAB 法提取硅膠干燥的新鮮葉片[13]，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 大小和完整性。 用NanoDrop ND-2000 分光光度計(Thermo Fish Scientific)測基因組總DNA 質(zhì)量，用1×TE 緩沖液稀釋總DNA（終濃度為20ng·μL-1），儲存于-20℃冰箱內(nèi)，用于SSR 試驗。

1.3 SSR 分析

在GeneAmp 9700 PCR 儀上完成擴增（Applied Biosystems），反應(yīng)體系（10μL）：10×Buffer I 1.0μL；2.5mM dNTP 0.8μL；帶有M13 序列的熒光引物TP-M13(5μmol·L-1)0.5μL（HEX 或FAM 熒光）；特異SSR 引物(5μmol·L-1)0.6μL；TAKARA HS Taq(大連TaKaRa 生物)0.1μL；DNA 模板1.2μL；ddH2O 5.8μL。PCR 擴增：95℃在PCR 儀上進行預(yù)熱5min；94℃模板變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，程序重復(fù)30 次循環(huán)；隨后94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸擴增30s，重復(fù)10 個循環(huán)；最后60℃持續(xù)30min。 向96 孔板中每孔加入分子量內(nèi)標(biāo)GS500 LIZ(Applied Biosystems)和甲酰胺混合液(0.5:8.5)9μL，PCR 產(chǎn)物1.0μL，95℃變性3 min。 帶有不同熒光的PCR 擴增產(chǎn)物在ABI 3730XL 測序儀（Applied Biosystems）進行檢測。 將檢測得到的原始數(shù)據(jù)“.fsa”文件導(dǎo)入到分析軟件GeneMapper 3.2(Applied Biosystems)中進行自動分析，手工校正。 北京閱微基因技術(shù)有限公司完成多色熒光引物合成、檢測和SSR 分析。

表1 群體樣本采樣點信息Table 1 Population locations of Q.mongolica in the present study

1.4 統(tǒng)計與分析方法

共完成10 對SSR 引物的擴增（表2）。用Popgene32軟件[14]計算各個引物的等位基因數(shù)(A)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀察雜合度(HO)、Shannon 多樣性指數(shù)、期望雜合度(HE)、多態(tài)性信息含量(PIC)、基因流(Nm)、基因分化系數(shù)（FST）、群體遺傳距離（Nei）與遺傳相似性等。用Mega 7按群體之間的Nei"s 遺傳距離進行UPGMA 聚類分析[15]，用軟件Fstat 2.9[16]完成遺傳距離與地理距離之間mantel相關(guān)性檢驗（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古櫟群體的遺傳多樣性

由圖1 可知，這10 對SSR 標(biāo)記，具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性， 在所有的樣本中均可成功擴增和進行判讀。圖1 為引物對N1105306 的熒光擴增產(chǎn)物在自動測序儀上的條帶大小，模板分別來自DA、HA、KUAN 和LING群體的4 個個體。 由表3 可知，10 對引物共擴增出73個等位基因變異， 每個位點的平均有效等位基因數(shù)為2.813 個，平均觀察等位基因數(shù)為7.3 個。 引物N4544558檢測到的有效等位基因數(shù)最少，為1.678；引物N1010265檢測到的有效等位基因數(shù)最多，達(dá)3.641。引物多態(tài)性信息含量(PIC)最高的為N1010265（0.683），最低的為N4544558（0.364）。10 個SSR 位點平均Shannon 多樣性指數(shù)（I）為1.270（0.756～1.527）;平均期望雜合度為0.624（0.404～0.725）。

由表4 可知，除西豐群體（群體采樣數(shù)量較少）之外，平均等位基因數(shù)最高的是哈達(dá)林場群體(A=5.0)，最低的是大孤家群體和寬甸群體(A=4.2)；平均有效等位基因數(shù)群體之間差異不大（2.403～2.896），分別是寬甸和凌源群體；Shannon 多樣性指數(shù)差異也不大，最高是灣甸子群體(1.182)，最低是西豐群體(0.986，采樣個體數(shù)僅有3個)；期望雜合度最高為灣甸子群體(0.612)，最低為清河城群體（0.558）。 蒙古櫟群體遺傳多樣性處于較高水平，各群體的SSR 多態(tài)性水平變化范圍不大，說明群體之間的差異較小。

表2 SSR 引物序列Table 2 The primers of sequence used for SSR analysis

圖1 N1105306 引物的熒光PCR 擴增片段長度Figure 1 Fluorescent PCR fragment size of N1105306 primer

表3 10 個位點的遺傳多樣性、FST 與基因流Table 3 Genetic polymorphism,FST and gene flow of 10 SSR loci

表4 蒙古櫟群體遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of Q.mongolica populations

2.2 蒙古櫟群體間的遺傳分化程度

由表3 可知，不同SSR 位點的基因分化系數(shù)FST 差別較大（0.0311～0.1600），N1010265 位點的分化最低（0.0311）位點，N1014482 位點的分化最高（0.1600），平均為0.0655。 這個結(jié)果意味著僅有6.55%遺傳變異是發(fā)生在群體之間，而絕大部分的遺傳變異發(fā)生在群體內(nèi)(93.45%)。 估算出的物種水平平均基因流（Nm）基因流達(dá)到4.471（范圍為1.313～7.780）。

2.3 群體間遺傳距離

由表5 可知，寬甸和清河城群體之間的遺傳距離最小(0.0076)；清河城和西豐群體的遺傳距離最大(0.056)，從UPGMA 聚類圖可以很清晰地看出各個群體之間的關(guān)系。

表5 遺傳一致性和遺傳距離Table 5 Genetic identity and genetic distance

由圖2 可知，8 個群體可以分為3 個群： 群Ⅰ包括寬甸群體、清河城群體、哈達(dá)群體、灣甸子群體和土城子群體；群Ⅱ包括凌源群體和大孤家群體；群Ⅲ包括西豐群體。 Mantel 檢驗表明，這8 個群體的遺傳距離和地理位置之間具有顯著相關(guān)性(r=0.631，p＜0.05)，這說明地理距離與遺傳距離存在正相關(guān)，符合地理隔離模型（isolation by distance）。

3 討論與結(jié)論

圖2 8 個蒙古櫟群體的UPGMA 聚類圖Figure 2 UPGMA dendrogram among the eight populations of Q.mongolica

本研究利用新開發(fā)的SSR 分子標(biāo)記研究了遼寧分布的蒙古櫟天然群體的群體遺傳學(xué)特征， 結(jié)果表明，每個SSR 位點的平均等位基因數(shù)為7.3，平均期望雜合度為0.624，Shannon 多樣性指數(shù)為1.270。 8 個群體存在一定的多樣性差異，期望雜合度為0.558～0.612；群體分化系數(shù)為0.0655，群體之間存在基因流達(dá)到4.471，表明遺傳變異主要存在群體內(nèi)。 通過UPGMA 聚類將8 個群體分為3 個群，檢驗表明，其遺傳距離和地理距離之間成正相關(guān)系。

遼寧省分布的天然蒙古櫟群體具有較豐富的SSR 多樣性， 其遺傳多樣性水平在櫟屬植物中處于較高水平。 多樣性水平的高低決定了物種的進化潛力和對環(huán)境的適應(yīng)能力，櫟屬植物種類繁多，形態(tài)多樣，因此其遺傳背景和多樣性水平差異很大。 HORNERO 等[17]研究表明，歐洲栓皮櫟具有較高的SSR 遺傳變異水平，期望雜合度（HE）可達(dá)0.65。 我國分布的栓皮櫟SSR 多樣性水平明顯高于歐洲栓皮櫟(HE=0.81)和歐洲夏櫟[18]，山西分布的遼東櫟群體的SSR 遺傳多樣性接近中國栓皮櫟（HE=0.753）[19]，而槲櫟（HE=0.575）[20]和短柄枹櫟（HE=0.43）[21]的SSR 多樣性明顯低于栓皮櫟。 本研究利用10 對蒙古櫟專有新標(biāo)記，平均每個位點的期望雜合度可達(dá)0.624，平均等位基因數(shù)為7.3，平均Shannon 指數(shù)為1.270，這表明本研究所開發(fā)新引物的SSR 標(biāo)記多態(tài)性較高， 利用這些SSR 標(biāo)記研究遼寧蒙古櫟群體的遺傳多樣性， 能夠反映遼寧地區(qū)分布的蒙古櫟的多樣性水平（HE=0.588），雖然低于中國栓皮櫟、遼東櫟、歐洲栓皮櫟（HE=0.65），與槲櫟（HE=0.575）接近，但明顯高于中國的短柄枹櫟群體多樣性水平（HE=0.43），即便與其他科屬的林木遺傳變異[22-25]進行比較，遼寧省內(nèi)的蒙古櫟的SSR 多樣性也處于較高水平。

群體多樣性水平或分化程度差異的可能原因在于選擇、基因流、隔離或隨機漂變等。 基因流動可以消除因地理或生殖隔離導(dǎo)致的不同地方群體甚至是物種間的遺傳差異，減小種間或種內(nèi)群體間的分化程度，進一步提高群體或物種的多樣性和適應(yīng)力。很多研究表明，蒙古櫟群體間存在基因流。ISSR 標(biāo)記分析得到的蒙古櫟群體間基因流比較低(Nm=1.3818)，群體間有相當(dāng)程度的遺傳分化(GST=0.2657)[26]；等位酶標(biāo)記揭示的蒙古棟群體間群體之間基因流要大于ISSR 的結(jié)果（Nm=2.071），群體間的遺傳分化系數(shù)降低（GST=0.1077）[27]。同時，蒙古櫟和近緣櫟屬物種的基因流也是普遍存在的，特別是在物種的重疊分布區(qū)[28]。本研究中的基因流（Nm=4.471）明顯高于上述的結(jié)果，這可能源于SSR 標(biāo)記方法的高多態(tài)性，這個結(jié)果很接近基于SSR 標(biāo)記的山東蓮臺山蒙古櫟的群體（Nm=4.22）結(jié)果，低于近緣的遼東櫟（Nm=5.979），又明顯高于中國短柄枹櫟群體之間的基因流(Nm=1.88)[21]，說明蒙古櫟群體之間確實存在較強基因流，基因流進而影響了蒙古櫟群體的遺傳結(jié)構(gòu)，即較高的遺傳多樣性主要存在于群體內(nèi)，群體間的遺傳分化較低。 這種遺傳變異的分布模式很大程度上要歸因于櫟屬物種的交配方式。 櫟屬植物是風(fēng)媒、異交為主，花粉很小，可以長距離傳播，從而導(dǎo)致群體間存在廣泛的花粉流介導(dǎo)的基因流，基因流的均質(zhì)化作用反過來很大程度上又會減弱群體間的分化；遺傳分化和基因流之間為負(fù)相關(guān)，基因流強度越大，群體分化就越小，這是櫟屬物種長期進化而適應(yīng)生態(tài)環(huán)境的結(jié)果。

本研究中，蒙古櫟群體的遺傳距離和地理距離存在顯著的正相關(guān)關(guān)系，這也與前人研究結(jié)果相一致[29]。 蒙古櫟在遼寧地區(qū)有較大面積的分布，分布位置因地區(qū)差異也有明顯變化，其主要區(qū)域分布在遼寧東部山區(qū)。 本研究采樣的8 個地點中，從經(jīng)緯度來看，撫順（哈達(dá)、灣甸子、大孤家）、本溪（清河城）、丹東（寬甸、土城子）等地為遼寧東部山區(qū)，屬長白植物系區(qū)[30]，氣候、土壤等生境條件較為相近；而朝陽（凌源）在遼寧西部丘陵地區(qū)，屬華北植物區(qū)系，其生境條件明顯與其他幾個地區(qū)不同。 通過聚類分析也說明，不同區(qū)域生長的蒙古櫟群體存在一定多樣性水平差異，而在聚類圖中，鐵嶺西豐單獨聚到了一類，其多樣性指數(shù)最低，雖然鐵嶺西豐地區(qū)也屬于長白山余脈地區(qū)但與其他群體間遺傳距離相對較遠(yuǎn)，這可能與本次群體采樣數(shù)量較少有關(guān)，對于上述存在的遺傳差異原因及其與生長性狀和地理氣候因子的相關(guān)性還有待于今后進一步深入研究。