辛亞芬 陳晨 曾泰儒 杜昭昌 倪浩然 鐘怡豪 譚小平 閆艷紅

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科技學(xué)院，成都 611130）

青貯飼料是在厭氧條件下，通過乳酸菌的發(fā)酵作用而得到的一種營養(yǎng)豐富、適口性好、消化率高且能長期貯存的優(yōu)質(zhì)飼料。青貯是一個(gè)非常復(fù)雜的微生物活動(dòng)和生物化學(xué)變化的過程，是飼草非常重要的保存方式之一。青貯飼料的質(zhì)量既取決于青貯原料附著的微生物群落，也取決于其在發(fā)酵過程中的演替［1］。飼草青貯發(fā)酵過程中的主要微生物有乳酸菌、乙酸菌、梭菌、酵母菌、霉菌等，其中乳酸菌的數(shù)量和活性是影響發(fā)酵質(zhì)量的重要因素。大多牧草自身附著的有活性乳酸菌數(shù)量有限［2］，自然發(fā)酵時(shí)乳酸菌難以成為優(yōu)勢(shì)菌種，導(dǎo)致青貯失敗。為保證青貯盡快進(jìn)入乳酸菌主導(dǎo)的發(fā)酵階段，常通過添加乳酸菌的方式來增加青貯飼料中的乳酸菌數(shù)量，抑制不良微生物的生長繁殖［3］。青貯添加劑除了傳統(tǒng)的乳酸菌制劑等發(fā)酵促進(jìn)劑外，還包括發(fā)酵抑制劑、好氣性變質(zhì)抑制劑、營養(yǎng)性添加劑4大類。本文從實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用角度出發(fā)，重點(diǎn)從乳酸菌制劑、化學(xué)添加劑、酶制劑、營養(yǎng)性添加劑4個(gè)方面來討論添加劑對(duì)青貯微生物多樣性的調(diào)控，進(jìn)而對(duì)青貯品質(zhì)的影響。

1 乳酸菌制劑

乳酸菌是影響青飼料發(fā)酵的主要有益微生物，屬于兼性厭氧型、革蘭氏陽性的無芽孢細(xì)菌，能利用糖分發(fā)酵形成以乳酸為主的有機(jī)酸，并降低pH［3］，抑制腐敗微生物的生長，減少發(fā)酵過程中的蛋白水解和干物質(zhì)損失［4］。根據(jù)乳酸菌對(duì)葡萄糖的發(fā)酵形式，可分為同型乳酸菌和異型乳酸菌兩大類。同型乳酸菌是制作青貯飼料最古老和最常見的青貯接種劑，其發(fā)酵己糖，幾乎只產(chǎn)生乳酸［5］。接種這類乳酸菌后，青貯飼料中的乳酸含量和干物質(zhì)回收率（DMR）較高，乙酸、丁酸、氨態(tài)氮含量和pH較低［6］。異型乳酸菌可增加青貯飼料中的乙酸含量，抑制好氧腐敗菌的繁殖，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性［7-9］?？梢姡樗峋苿┰谀敛萸噘A料的發(fā)酵和貯藏過程中起著關(guān)鍵作用。

1.1 同型乳酸菌制劑

同型乳酸菌制劑主要作用是促進(jìn)青貯早期發(fā)酵，提高發(fā)酵效率，快速降低pH，抑制有害微生物的活性，使飼草成功青貯［10］。通常用于促進(jìn)青貯發(fā)酵的同型乳酸菌有Lactobacillus、Streptococcus、Pediococcus等［11-12］。

接種同型乳酸菌對(duì)青貯發(fā)酵中微生物多樣性及豐富度會(huì)產(chǎn)生不同影響。Keshri等［1］對(duì)小麥的細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)表明，添加同型乳酸菌青貯90 d后細(xì)菌多樣性較低，Pantoea、Pseudomonas等有害微生物相對(duì)豐度減小，乳酸菌在青貯中占主要優(yōu)勢(shì)，通過PICRUSt分析表明，有氧暴露后，添加同型乳酸菌與CK處理之間有7條途徑顯著不同，乙苯降解、D-丙氨酸代謝、萜類骨架合成和離子通道系統(tǒng)的途徑在CK處理中更豐富，而添加同型乳酸菌后，硅氧烷雙組分系統(tǒng)中新生霉素生物合成更高，這類抗生素的產(chǎn)生可能會(huì)限制細(xì)菌群落的繁殖。自選耐高溫植物乳桿菌LP694可提高青貯飼料中Lactobacillus plantarum及異型乳酸菌Lactobacillus hammesii、Lactobacillus brevis的相對(duì)豐度，生產(chǎn)較多乳酸和乙酸，有效提高青貯飼料品質(zhì)，且添加同型乳酸菌制劑牛鞭草的發(fā)酵效果優(yōu)于異型乳酸菌制劑［13-14］。Yang等［15］研究結(jié)果表明，接種植物乳桿菌降低了細(xì)菌的多樣性，顯著提高乳桿菌相對(duì)豐度和乳酸含量，抑制腐敗梭菌屬和致病性李斯特菌屬微生物的生長，延緩了高溫高濕條件下苜蓿青貯飼料的腐敗，提高了苜蓿青貯飼料的發(fā)酵質(zhì)量。王媛等［16］研究結(jié)果表明，添加植物乳桿菌青貯后微生物菌群多樣性降低，Garciella屬和Weissella屬的相對(duì)豐度較低，Lactobacillus屬的相對(duì)豐度較高，表明植物乳桿菌作為青貯添加劑可以改變細(xì)菌菌群組成。Garciella是一種厭氧嗜熱菌屬于Clostridiales門、Clostridia屬，存在于青貯環(huán)境中將會(huì)增加青貯難度［17］。Yan等［14］研究結(jié)果表明，西南濕熱地區(qū)多花黑麥草和玉米秸稈混合青貯時(shí)，添加添加自選耐高溫植物乳桿菌LP149顯著降低了青貯原料中的Carnobacterium、Stenotrophomonas、Vagococcus等 不良微生物豐度，增加乳酸菌屬相對(duì)豐度，且存在較高豐度的L. hammesii和L. brevis的異型發(fā)酵菌株，說明植物乳桿菌的添加可以抑制不良微生物的繁殖，改善濕熱地區(qū)高水分牧草青貯發(fā)酵效果；且較高的青貯溫度通常會(huì)導(dǎo)致青貯過程中乳酸菌從同型發(fā)酵向異型發(fā)酵轉(zhuǎn)變，一定程度上可以延緩青貯飼料的有氧腐敗。

綜上，接種同型乳酸菌可調(diào)控青貯環(huán)境中微生物多樣性，在青貯發(fā)酵中普遍觀察到較多的乳酸菌種類及較高的相對(duì)豐度，迅速降低環(huán)境pH，抑制酵母菌、霉菌、梭狀芽胞桿菌等微生物的生長繁殖，從而提高青貯的發(fā)酵品質(zhì)，解決青貯原料乳酸菌不足，高溫高濕等特殊環(huán)境下青貯飼料品質(zhì)較差的問題。因此，在青貯發(fā)酵前期，為了保證快速、有力的發(fā)酵，抑制有害微生物的生長，接種同型乳酸菌是提高青貯品質(zhì)的有效方法。

1.2 異型乳酸菌

異型發(fā)酵乳酸菌屬于乳桿菌科，分屬于Lactobacillus、Leuconostoc和Weissella屬［7］，常見布氏乳桿菌、希氏乳桿菌、短乳桿菌等異型乳酸菌制劑主要應(yīng)用于青貯發(fā)酵研究［18］。異型發(fā)酵乳酸菌可以在青貯后期，通過產(chǎn)生高濃度的乙酸來抑制酵母菌、霉菌等不良微生物的生長，提高青貯有氧穩(wěn)定性［19-20］；此外，一些布氏乳桿菌能夠在青貯中產(chǎn)生阿魏酸酯酶，在抗菌和提高纖維的消化率等方面表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)［16］，然而，其對(duì)青貯飼料的發(fā)酵效果表現(xiàn)不一［21-23］。

布氏乳桿菌是專性異型青貯添加劑中的優(yōu)勢(shì)菌種，接種異型乳酸菌制劑對(duì)青貯發(fā)酵中微生物多樣性及豐富度有較大影響。Wambacq等［24］研究表明，布氏乳桿菌能有效抑制青貯過程中酵母菌等真菌的生長，改善青貯發(fā)酵的有氧穩(wěn)定性。萬江春等［25］研究表明，布氏乳桿菌處理有效抑制了酵母菌的增長速率，且有氧暴露后酵母菌的種類也僅有Zygosaccharomyces bailii、Candida tropicalis、Candida ethanolica和Candida rugosa四類，而Z. bailii可能是引起蘇丹草青貯飼料有氧變質(zhì)的主要酵母菌。Si等［26］研究表明，布氏乳桿菌的添加通過抑制紫花苜蓿原料上附著的Enterobacter ludwigii豐度，降低了蛋白質(zhì)在青貯過程中的降解，改善了青貯發(fā)酵的品質(zhì)。Pascal等［27］研究了異型乳酸菌接種處理對(duì)玉米青貯飼料中微生物群落動(dòng)態(tài)變化的影響，結(jié)果表明經(jīng)布氏乳桿菌處理的青貯飼料細(xì)菌豐富度在青貯后下降，但含有較高的乳酸菌多樣性，主要是專性異發(fā)酵菌種，包括Lactobacillus brevis-和Lactobacillus ingluviei相關(guān)的OTUs，有助于乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸［28］，而乙酸可以很容易地進(jìn)入微生物細(xì)胞，分解并降低細(xì)胞內(nèi)的pH，并消耗大量能量來維持其生理pH，最終殺死無法適應(yīng)的微生物，從而提高了青貯飼料的穩(wěn)定性［28］。雖然布氏乳桿菌在發(fā)酵過程中會(huì)消耗青貯飼料的營養(yǎng)物質(zhì)，但對(duì)真菌的抑制方面表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性作用，在青貯發(fā)酵和動(dòng)物生產(chǎn)效率方面的優(yōu)勢(shì)能夠彌補(bǔ)營養(yǎng)物質(zhì)的損失［29］。添加布氏乳桿菌可改變牧草青貯發(fā)酵的微生物多樣性及豐富度，顯著提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。

可見，接種異型乳桿菌可調(diào)控青貯環(huán)境中微生物多樣性，通過將青貯發(fā)酵系統(tǒng)中的乳酸轉(zhuǎn)化為乙酸，抑制Z. bailii、C. tropicalis等酵母菌的活性和Pantoea、霉菌等微生物的繁殖，提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性。因此，為了抑制腐敗微生物的繁殖生長，解決青貯飼料開窖后的腐敗變質(zhì)問題，接種異型乳酸菌是提高青貯飼料貯藏的有效途徑。

同型和異型發(fā)酵的乳酸菌以不同的方式調(diào)節(jié)青貯飼料的發(fā)酵，發(fā)酵中各種微生物群落演替規(guī)律和代謝物也存在很大差異。外源乳酸菌制劑通常對(duì)青貯飼料的發(fā)酵具有積極作用，了解乳酸菌添加劑種類、微生物演替規(guī)律及青貯飼料發(fā)酵過程中二者的相互作用，將有助于改進(jìn)青貯發(fā)酵過程，生產(chǎn)高質(zhì)量的青貯飼料。

2 化學(xué)添加劑

化學(xué)添加劑也是青貯發(fā)酵中常用的添加劑［30］，包括無機(jī)酸、有機(jī)酸等。添加無機(jī)酸（如硫酸、鹽酸）可迅速制造酸性環(huán)境，殺死不良微生物，促進(jìn)青貯飼料的有利發(fā)酵，但研究表明無機(jī)酸對(duì)青貯設(shè)備腐蝕性大、環(huán)境污染嚴(yán)重，且易引起動(dòng)物體內(nèi)酸堿度失衡、采食量降低、生產(chǎn)性能下降等不利影響，目前無機(jī)酸在青貯中使用較少。有機(jī)酸（鹽）雖不能直接促進(jìn)乳酸菌的增殖，但可以有效抑制酵母菌、霉菌等不良微生物的生長繁殖，有效提高青貯的有氧穩(wěn)定性，降低飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的損失［31-35］。

接種有機(jī)酸制劑顯著影響微生物菌群動(dòng)態(tài)。Jiang等［36］的研究表明，有機(jī)酸處理降低了青貯飼料中微生物多樣性，提高了乳酸桿菌的相對(duì)豐度，抑制了Klebsiella、Paenibacillus和Enterobacter等微生物的生長，有效提高了玉米青貯飼料的品質(zhì)。陸永祥等［37］的研究表明，添加甲酸后，青貯飼料中不良微生物如酵母菌數(shù)量以及微生物多樣性指數(shù)降低，有益微生物如乳酸菌數(shù)量增加，并且能提高燕麥青貯飼料中乳酸菌的豐度，從而改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。然而，也有報(bào)道指出，甲酸可迅速滲透到乳酸菌細(xì)胞膜上，破壞其生物活性，導(dǎo)致乳酸菌活性降低，青貯發(fā)酵受到抑制，對(duì)有益微生物乳酸菌產(chǎn)生不利影響［38］。李曉紅等［39］測(cè)定了有機(jī)酸鹽不同復(fù)配比對(duì)牧草青貯發(fā)酵有害菌的抑制效果，結(jié)果表明雙乙酸鈉處理顯著抑制了大腸桿菌、青霉菌和酵母菌3種有害菌的生長，苯甲酸鈉處理對(duì)大腸桿菌和青霉菌的抑制作用較為顯著，山梨酸鉀處理僅對(duì)青霉菌的抑制較為顯著，復(fù)配使用對(duì)有害菌的抑制效果更為顯著。雙乙酸鈉對(duì)酵母的抑制更有效，且化學(xué)添加劑進(jìn)行復(fù)配使用對(duì)減少青貯飼料發(fā)酵過程中有害微生物的數(shù)量，確保乳酸菌群的優(yōu)勢(shì)地位有很大的積極作用，可以有效提高青貯發(fā)酵的成功率和青貯品質(zhì)。

化學(xué)添加劑可迅速制造酸性環(huán)境，降低青貯飼料的pH，抑制Klebsiella、Paenibacillus和大腸桿菌等有害微生物的生長繁殖，減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失，提高青貯飼料的品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性。因此，了解有機(jī)酸添加劑種類、復(fù)配劑量等對(duì)牧草青貯的細(xì)菌和真菌群落組成影響，有助于解釋有機(jī)酸制劑如何提高青貯飼料的品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性。

3 酶制劑

青貯中添加的酶制劑主要是多種細(xì)胞壁分解酶，包括纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶、木聚糖酶及復(fù)合酶等，可將原料細(xì)胞壁的纖維素和半纖維素分解為能被乳酸菌利用的單糖及雙糖，為乳酸菌的繁殖發(fā)酵提供充足的底物，有利于抑制腐敗菌的滋生，提高青貯品質(zhì)和飼料的利用率。然而，Lynch等［40］的研究表明，添加酶制劑使得酵母菌數(shù)量增加，青貯飼料品質(zhì)未得到提高。

接種酶制劑對(duì)青貯發(fā)酵中微生物多樣性及豐富度會(huì)產(chǎn)生不同影響。纖維素酶和α-半乳糖苷酶聯(lián)合使用增加了乳酸菌的相對(duì)豐度［41］；纖維素酶和木聚糖酶聯(lián)合使用抑制了酵母菌、霉菌和大腸桿菌的滋生［42］。黃媛等［43］的研究結(jié)果表明，在添加糖蜜的基礎(chǔ)上添加纖維素酶可增加Enterococcus及Lactobacillus的相對(duì)豐度，降低了Weissella的相對(duì)豐度，同時(shí)減少Proteobacteria的相對(duì)豐度，引起微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，提高構(gòu)樹的青貯飼料品質(zhì)。劉菲菲［44］研究了纖維素酶、木聚糖酶及二者復(fù)合酶制劑對(duì)酒糟與麥麩混貯微生物菌群的影響，結(jié)果表明，F(xiàn)irmicutes和Lactobacillus相對(duì)豐度隨著青貯時(shí)間延長逐漸升高，Proteobacteria相對(duì)豐度降低，且纖維素酶和木聚糖酶復(fù)配使用青貯效果更優(yōu)。Firmicutes是革蘭氏陽性菌，能降解多種大分子化合物，Proteobacteria包括大腸桿菌、沙門氏菌等病原菌，會(huì)與乳酸菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)并產(chǎn)生生物胺，對(duì)混貯發(fā)酵品質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響。可見，添加酶制劑有利于青貯品質(zhì)的提升，且聯(lián)合添加酶制劑時(shí)對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的提高作用影響要優(yōu)于單獨(dú)添加。盡管酶制劑已經(jīng)使用了很多年，但直到最近才有關(guān)于蛋白酶水解玉米籽粒中淀粉顆粒周圍的蛋白質(zhì)基質(zhì)以改善淀粉消化率方面的研究［45-46］，這種添加劑可以改善較短青貯時(shí)間的高水分玉米淀粉消化率，但在開發(fā)添加劑方面仍需進(jìn)一步研究［7］。

酶制劑通過纖維素的分解對(duì)乳酸菌提供充足的發(fā)酵底物，抑制霉菌等腐敗微生物的繁殖，提高青貯品質(zhì)，且酶制劑的復(fù)配使用對(duì)發(fā)酵品質(zhì)的效果更優(yōu)。因此，建議在纖維含量較高、WSC含量較低的飼草青貯時(shí)添加適量的酶制劑促進(jìn)青貯品質(zhì)的提升。

4 營養(yǎng)性添加劑

營養(yǎng)性添加劑包括葡萄糖、糖蜜飼料、谷類等［47］，可為乳酸菌提供更多的發(fā)酵底物，使乳酸發(fā)酵迅速占據(jù)主導(dǎo)地位，另外，營養(yǎng)性添加劑中還含有天門冬氨酸和谷氨酸等呈味物質(zhì)，可在青貯中明顯改善發(fā)酵品質(zhì)，已作為一種綠色、安全的發(fā)酵促進(jìn)劑被廣泛使用。

營養(yǎng)性添加劑可以改變牧草青貯中的微生物群落結(jié)構(gòu)。Luo等［48］研究了添加糖蜜對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)、微生物群落的影響，發(fā)現(xiàn)添加糖蜜后Enterococcus和Lactobacillus在苜蓿青貯中占優(yōu)勢(shì)地位，梭狀芽胞桿菌、酵母菌、霉菌等不良微生物被抑制，且乳酸/乙酸隨著糖蜜添加量的增加而顯著增加?？梢?，糖蜜的添加為青貯提供額外的發(fā)酵基質(zhì)，促進(jìn)青貯發(fā)酵系統(tǒng)中有益微生物的主導(dǎo)地位，為青貯飼料的發(fā)酵和長期保存提供良好的條件。Wu等［49］研究表明，補(bǔ)糖提高了青貯飼料中Lactobacillus相對(duì)豐度，降低Pediococcus相對(duì)豐度；糖蜜處理顯著提高有益乳酸菌相對(duì)豐度，降低Citrobacter和Enterobacter的相對(duì)豐度，進(jìn)而提高了苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)，且微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化為減少脂肪酸的損失提供了思路。由此可見，營養(yǎng)性添加劑通過為青貯外源補(bǔ)充發(fā)酵底物，促進(jìn)乳酸菌等有益菌的快速發(fā)酵，降低pH，抑制梭狀芽胞桿菌、酵母菌、霉菌等有害微生物，進(jìn)而提高青貯發(fā)酵品質(zhì)。

5 小結(jié)與展望

牧草青貯發(fā)酵是多種微生物共同作用的結(jié)果，青貯品質(zhì)與微生物群落結(jié)構(gòu)之間有著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系。乳酸菌制劑主要通過提高乳酸菌的相對(duì)豐度，降低pH，抑制好氧微生物的生長，提高青貯品質(zhì)；化學(xué)添加劑通過迅速制造酸性環(huán)境，抑制有害微生物的生長繁殖，減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失，提高有氧穩(wěn)定性；酶制劑和營養(yǎng)性添加劑通過為乳酸菌提供充足的發(fā)酵底物，促進(jìn)乳酸菌等優(yōu)勢(shì)菌的快速發(fā)酵，降低pH，改善青貯品質(zhì)。4種青貯添加劑通過調(diào)節(jié)微生物種類及數(shù)量，使乳酸菌等有益微生物占據(jù)主導(dǎo)地位，抑制酵母菌、霉菌等微生物的生長繁殖，為青貯發(fā)酵品質(zhì)和牧草長期保存提供條件，同時(shí)，還可以滿足在多種環(huán)境下對(duì)青貯品質(zhì)的提升。

因此，了解飼草表面附著微生物特性是決定是否需要添加劑的重要依據(jù)，以此為基礎(chǔ)，針對(duì)青貯的不同需要，將多種優(yōu)質(zhì)菌劑聯(lián)合使用，充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢(shì)才能全面提升青貯飼料的品質(zhì)以及牲畜生產(chǎn)性能。在該過程中，通過篩選提高菌劑資源庫的多樣性、定向研發(fā)具有特定功能的優(yōu)質(zhì)菌劑，結(jié)合現(xiàn)代分子生物技術(shù)，進(jìn)一步揭示微生物群落結(jié)構(gòu)及功能與青貯品質(zhì)之間的關(guān)系，將為青貯系統(tǒng)中完整的微生物群落提供有價(jià)值的生物學(xué)信息。