陳驍勇 葛玉松 支榮榮▲

1.江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇鹽城 224000；2.江蘇省鹽城市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇鹽城 224000

三香散是鹽城市中醫(yī)院的自制制劑，由木香、小茴香、肉桂三味藥構(gòu)成，具有溫中散寒、除脹止痛的功效，臨床上常用于小兒腸絞痛以及寒瀉而致腹脹、腹痛，為兒科腹痛腹脹的外用制劑[1-3]。目前，三香散標(biāo)準(zhǔn)為《江蘇省食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)》JSZBZ20091017Z[4]，標(biāo)準(zhǔn)中只有顯微、理化鑒別等項(xiàng)目，缺乏定量測定的內(nèi)容，其中肉桂、小茴香為三香散的主要成份[5-8]。本研究參照有關(guān)文獻(xiàn)[9-15]，建立氣相色譜法（GC）同時(shí)測定三香散中桂皮醛和反式茴香腦含量的方法，旨在為該醫(yī)院制劑三香散提供更好的標(biāo)準(zhǔn)和更新的依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

安捷倫7890A GC System 氣相色譜儀（Agilent Technologies），XS205 DU 電子天平（Mettler Toledo）；QLB型純凈空氣泵（山東塞克賽斯氫能源有限公司）；SPH-300 氫氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術(shù)研究所）；A10 TOC monitor 實(shí)驗(yàn)室純水（默克化工技術(shù)有限公司）

1.2 藥品與試劑

1.2.1 藥品 三香散（鹽城市中醫(yī)院自制制劑，規(guī)格：100 g，批號(hào)：191102、191120、191218）；肉桂、小茴香、木香均來自鹽城市第一人民醫(yī)院藥劑科；桂皮醛對(duì)照品（批號(hào)：110710-201619，含量：98.9%）、反式茴香腦對(duì)照品（批號(hào)：111835-201804，含量：99.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2.2 試劑 超純水；乙酸乙酯為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-WAX 色譜柱（30 m×0.320 mm，0.25 μm）；柱程序升溫：初始110℃，保持2 min，5℃/min升溫至160℃，運(yùn)行至12 min，30℃/min 升溫至220℃，保持5 min，50℃/min 降溫至110℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度：250℃；FID 檢測器溫度：300℃；載氣：高純H2（體積分?jǐn)?shù)>99.999%）；流速：30 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；分流比：10∶1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱定桂皮醛對(duì)照品、反式茴香腦對(duì)照品430.33 mg 和46.12 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯適量使容量瓶中對(duì)照品溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為43.033 mg/mL、4.612 mg/mL 的桂皮醛對(duì)照品儲(chǔ)備液和反式茴香腦對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取上述桂皮醛對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1 mL 與反式茴香腦對(duì)照品儲(chǔ)備液1.5 mL，分別置于25 mL 容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為0.1721 mg/mL 和0.2767 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取三香散供試品，混合均勻，精密稱取0.5000 g，置于250 mL 具塞圓底燒瓶中，加入適量超純水與2 mL 乙酸乙酯，連接揮發(fā)油測定器，緩緩加熱至沸，并保持微沸約5 h，放冷至室溫，取上層乙酸乙酯液至5 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，搖勻，用0.45 μm 有機(jī)微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按照三香散處方中各飲片成分比例和該制劑的制備工藝，稱取0.2 g 木香、0.2 g 小茴香，制成不含肉桂的陰性樣品；稱取0.2 g 木香、0.1 g肉桂，制成不含小茴香的陰性樣品。按照“2.2.2”項(xiàng)下流程，制備不含有相應(yīng)飲片的陰性樣品溶液，即缺小茴香的陰性樣品溶液，缺肉桂的陰性樣品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的桂皮醛對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于20 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，分別取0.025、0.050、0.100、0.200、0.500 mL 置于25 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，用0.45 μm 有機(jī)微孔濾膜濾過，以1 μL 自動(dòng)進(jìn)樣至氣相色譜儀，測定各峰面積。以桂皮醛對(duì)照品濃度（X1）為橫坐標(biāo)，桂皮醛對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y1），繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到桂皮醛的回歸方程為Y1=1948X1+36.908（R2=0.9995），桂皮醛在濃度0.00213～0.042 56 mg/mL 范圍中呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖1A）。

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下反式茴香腦對(duì)照品儲(chǔ)備液0.4、0.8、1.0、1.5、5.0 mL，分別置于25 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋至刻度，同樣用0.45 μm 有機(jī)微孔濾膜濾過，以1 μL 自動(dòng)進(jìn)樣至氣相色譜儀，測定各峰面積。以反式茴香腦對(duì)照品濃度（X2）為橫坐標(biāo)，反式茴香腦對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y2），繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到反式茴香腦的回歸方程為Y2=3425.3X2-62.95（R2=0.9996），反式茴香腦在濃度0.0734～0.9180 mg/mL范圍中呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖1B）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，以1 μL自動(dòng)進(jìn)樣“2.2.1”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品溶液6次，至氣相色譜儀，記錄6次峰面積。計(jì)算得出，桂皮醛、反式茴香腦峰面積的RSD 分別為1.50%、0.84%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.2 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取“2.2”項(xiàng)下的供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、缺小茴香陰性樣品溶液，缺肉桂陰性樣品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，主成分峰與雜質(zhì)峰之間分離度達(dá)到要求，原輔料均無干擾（圖2）。

圖2 專屬性試驗(yàn)氣相色譜圖

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取三香散粉末（批號(hào)：191218）按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別置于室溫下0、1、2、4、8、12、24 h，按照“2.1”項(xiàng)的色譜條件自動(dòng)進(jìn)樣1 μL 于氣相色譜儀，分析測得桂皮醛、反式茴香腦的RSD值分別為1.44%、0.84%。結(jié)果表明，桂皮醛、反式茴香腦供試品溶液中，成分桂皮醛、反式茴香腦在室溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取三香散粉末（批號(hào)：191218）按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)的色譜條件自動(dòng)進(jìn)樣1 μL 于氣相色譜儀進(jìn)行進(jìn)樣分析，得到桂皮醛、反式茴香腦的平均含量分別為0.1625、0.2473 mg/g，RSD值分別為0.96%、0.48%，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取三香散粉末（批號(hào)：191218）6份，分別加入質(zhì)量濃度為0.1721 mg/mL 和0.2767 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液1 mL，精密加入2 mL乙酸乙酯，加入適量超純水，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件自動(dòng)進(jìn)樣1 μL于氣相色譜儀進(jìn)行進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，兩種成分的平均回收率均＞9.9%，RSD≥1.50。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果

2.4.6 樣品含量測定 取3個(gè)不同批號(hào)的三香散制劑（批號(hào)：191102、191120、191218），按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別吸取3 批次供試品溶液各6次，按照“2.1” 項(xiàng)下色譜條件自動(dòng)進(jìn)樣1 μL 于氣相色譜儀進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄各峰面積，計(jì)算桂皮醛和反式茴香腦的含量，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，批號(hào)191120的三香散中，桂皮醛和反式茴香腦的含量均最高，分別為0.1611 mg（RSD=1.10%）和0.2555 mg（RSD=1.20%）。

表2 樣品含量測定（n=6）

3 討論

3.1 色譜柱選擇

分別選取Agilent DB-624 色譜柱（30 m×0.530 mm，3.00 μm）和Agilent DB-WAX 色譜柱（30 m×0.320 mm，0.25 μm），對(duì)樣品中的兩種化學(xué)成分進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，采用Agilent DB-WAX 色譜柱（30 m×0.320 mm，0.25 μm），兩種化學(xué)成分的分離度>1.5，理論塔板數(shù)較高，因此本研究選取Agilent DB-WAX 色譜柱。

3.2 成分提取

在成分提取過程中，采用超聲提取20 min 與水蒸氣蒸餾法1 h 進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，水蒸氣蒸餾法提取1 h，能將桂皮醛和反式茴香腦成分提取完全，并且操作簡便易行。本研究選取水蒸氣蒸餾法提取5 h，旨在使桂皮醛和反式茴香腦成分提取更加完全。

3.3 溫度選擇

由于三香散藥味多芳香，在分離各成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，恒定柱溫?zé)o法有效分離各成分，經(jīng)過比較沸點(diǎn)、初始溫度、升溫速率，末溫等因素，確定了程序升溫。結(jié)果顯示，初始110℃，保持2 min，5℃/min 升溫至160℃，運(yùn)行至12 min，30℃/min 升溫至220℃，保持5 min，50℃/min 降溫至110℃，保持2 min，上述程序升溫方法能夠使低沸點(diǎn)組分和高沸點(diǎn)組分在色譜柱中有適宜地保留，各待測組分色譜峰分離度較好，且峰形比較對(duì)稱。

3.4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)采用了GC 測定三香散中桂皮醛、反式茴香腦的含量，方法學(xué)研究顯示，實(shí)驗(yàn)中采取的方法能夠有效地對(duì)三香散中的桂皮醛和反式茴香腦進(jìn)行含量測定，具有方便簡便、準(zhǔn)確、省時(shí)、重復(fù)性好的特點(diǎn)，并且能夠彌補(bǔ)現(xiàn)有鑒定標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)三香散各成分的定量鑒別內(nèi)容的空白，為制劑充分發(fā)揮其治療小兒腹痛、腹脹、胃腸痙攣等癥狀的功效，提供理論依據(jù)。