成雅琪，吳靜，劉立明，宋偉

（1 江南大學藥學院，江蘇無錫214122； 2 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

引 言

手性胺類化合物作為一類具有高生理活性的化學品，廣泛應用于合成食品、精細化學品和醫(yī)藥中間體。據(jù)不完全統(tǒng)計，目前約40%的藥物結構中含有手性胺成分，因此具有很高的研究價值[1]。手性胺類化合物主要是通過化學法和生物催化合成，其中化學法合成的胺類化合物通常是通過活化中間體如烯酰胺、烯胺或預先形成的N-取代亞胺的不對稱氫化合成的，這一過程需要經(jīng)過多步化學反應，效率較低[2]。而生物催化法由于具有反應條件溫和、高對映選擇性、高轉化率、高空時產(chǎn)率、高原子經(jīng)濟性、綠色環(huán)保等優(yōu)點，受到工業(yè)及學術領域的廣泛關注。使用手性生物催化劑時，潛手性起始底物可以在一步反應中直接轉化為單一對映體，反應效率高、反應過程短，所涉及的酶主要有還原酶、脫氫酶、裂解酶和轉氨酶等。根據(jù)C—N 成鍵方式的不同，可將酶法不對稱合成手性胺的反應分為：(1)還原胺化反應；(2)氫胺化反應；(3)轉氨化反應。本文主要概述了酶法合成手性胺類化合物的研究進展，并討論了酶法合成手性胺類化合物的發(fā)展趨勢。

1 還原胺化反應

還原胺化反應是指醛類、酮類、酮醇類及酮酸類化合物中的羰基被氨基取代生成相應的胺。該反應能被酮亞胺還原酶(KIREDs)、亞胺還原酶(IREDs)、冠癭堿脫氫酶(OpDHs)、N-甲基氨基酸脫氫酶(NMAADHs)、L-亮氨酸脫氫酶(LeuDH)、苯丙氨酸脫氫酶(PheDH)、L-賴氨酸脫氫酶(LysEDH)、D-氨基酸脫氫酶(D-AADH)所催化。

1.1 以胺類化合物為供體的還原胺化反應

酮亞胺還原酶(KIREDs, E.C.1.5.1.25)是一種催化亞氨酸還原胺化的酶。可將Δ1-哌啶-2-羧酸鹽和Δ1-吡咯烷-2-羧酸鹽等環(huán)酮亞胺還原為相應的飽和環(huán)狀氨基酸。隨著對該酶的深入研究，發(fā)現(xiàn)來源于豬腎和人腦的KIREDs 能同時接受NADH 和NADPH 作為輔因子，但NADPH 是人腦KIREDs 的首選輔因子[3]。研究發(fā)現(xiàn)，所有的酮亞胺還原酶對L-烷基-α-氨基酸的形成都表現(xiàn)出嚴格的對映選擇性，其中來源于人的酮亞胺還原酶/CRYM 能催化非環(huán)亞胺的還原，但反應速率比Δ1-哌啶-2-羧酸鹽略低[4]。來 源 于Rattus norvegicus、Homo sapiens、Bos Taurus 的酮亞胺還原酶能以甲胺、烯丙基胺、炔丙基胺、環(huán)丙基胺和芐胺作為胺供體，其中以甲胺為胺供體時轉化率最高，轉化率在32%～81%之間；環(huán)丙基胺次之，轉化率介于29%～79%；而烯丙基胺和炔丙基胺的轉化率只有30%和26%[5]。

亞胺還原酶(IREDs, E.C.1.5.1.48)是NADPH 依賴的氧化還原酶，能催化亞胺不對稱還原形成相應的胺。亞胺還原酶最早發(fā)現(xiàn)于Streptomyces sp.GF3546 中[6]，催化2-甲基-1-吡咯啉(2-MPN)、1-甲基-3,4-二氫異喹啉和6,7-二甲氧基-1-甲基-3,4-二氫異喹啉的(S)-對映選擇性還原，其比酶活分別為130、44 和2.6 nmol·min-1·mg-1，光學ee 值分別為92.7%、96.4%和＞99%。在NADPH 再生體系中，反應24 h 能將10 mmol·L-12-MPN 轉化為胺，轉化率為100%，ee 值為92%[7]。為進一步提高IREDs 的生物催化活性和立體選擇性，Wetzl 等[8]利用一組環(huán)亞胺為底物篩選得到一個由28 個IREDs 組成的亞胺還原酶庫，又以不同的酮類化合物(如苯乙酮、2-己酮、環(huán)己酮和2-甲氧基環(huán)己酮等)為底物進行篩選，得到最優(yōu)胺還原酶RIR_11Q 和RIR_20Q，生成(1S,3R)-N,3-二甲基環(huán)己胺(收率71%，98% ee)和(1S,3R)-N,3-甲基環(huán)己胺(收率50%，96% ee)。此外，來源于米曲霉的IRED 同源物AspRedAm，也能催化一系列羰基化合物與多種伯胺和仲胺的還原偶聯(lián)，轉化率≥98%，ee ≥98%。進一步對AspRedAm 結構進行分析，發(fā)現(xiàn)氨基酸殘基W210 和Q240 是影響底物特異性的關鍵殘基。因此將這兩個殘基突變?yōu)轶w積較小的丙氨酸，所得的突變體W210A對底物（S）-選擇性明顯提高，而另一突變體Q240A 更偏向于生成（R）- 型 產(chǎn) 物[9]。 最 近 研 究 發(fā) 現(xiàn)，來 自 于Streptomyces ipomoeae 的IRED 能催化2-苯基丙醛和2-甲基-3-苯基丙醛生成相應的N-甲基化β-手性胺，轉化率＞95%，ee 值分別為78%和95%[10]。這一結果表明，IRED 除了用于制備α-手性胺外，還能合成β-手性胺。

冠癭堿脫氫酶(OpDHs, E.C.1.5.1.11)是氧化還原酶，催化α-酮酸與氨基酸的可逆還原偶聯(lián)生成N-羧基烷基氨基酸。1959 年發(fā)現(xiàn)的第一個冠癭堿脫氫酶(OcDH)，它能以精氨酸和丙酮酸為原料，在體外合成D- 章魚堿[11]。 隨后在土壤細菌、Agrobacterium tumefaciens 和Arthrobacter sp. 1C[12]中均發(fā)現(xiàn)了這種酶。冠癭堿脫氫酶的研究主要集中在底物選擇性上：(1)該酶對N-[1-R-(羧基)乙基]-S-蛋氨酸和N-[1-R-(羧基)乙基]-S-苯丙氨酸等物質(zhì)具有活性；(2)能接受L-氨基酸(如L-蛋氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-丙氨酸和L-蘇氨酸)作為氨基供體，而α-酮酸(如丙酮酸、草酰乙酸、乙醛酸和α-酮丁酸)作為氨基受體，其中L-蛋氨酸是最優(yōu)氨基供體(活性3.4%)[12]；(3)當固定丙酮酸為氨基受體時，該酶能以(S)-蛋氨酸、(S)-異亮氨酸等氨基酸作為氨基供體，合成一系列的光學純的仲胺羧酸，eeR＞99.9%；(4)能以短鏈中性氨基酸如(S)-2-氨基丁酸、去甲纈氨酸、正亮氨酸和苯甘氨酸為氨基供體[13]。進一步對該酶進行改造后，能與非羧基化的酮和胺(如丁胺、環(huán)戊酮和環(huán)己酮衍生物)進行結合，由此發(fā)現(xiàn)OpDH 具有催化酮還原胺化為手性胺的潛力[14]。

N-甲基氨基酸脫氫酶(NMAADHs, E.C.1.5.1.1和E.C.1.5.1.21)能促進α-酮酸與胺的分子間偶聯(lián)，生成對映體純N-甲基氨基酸。N-甲基氨基酸脫氫酶最早發(fā)現(xiàn)于1970 年[15]，用甲胺處理Pseudomonas MS 的無細胞提取物會產(chǎn)生一種新的氨基酸——N-甲基丙氨酸，5 年后分離純化并鑒定了這種酶，由于它能夠催化丙酮酸和甲胺還原胺化，因此命名為N-甲基氨基酸脫氫酶[16]。 研究發(fā)現(xiàn)，來源于Pseudomonas putida ATCC12633 的NMAADHs 能 夠催化其他不同的酮酸與甲胺之間的還原，其對丙酮酸活性最高(100%)，對含氟、芳香族和脂肪族丙酮酸衍生物的活性為16%～52%[17]。以苯丙酮酸為氨基受體，來源于P.putida、P.syringae 和P.fluorescens 的NMAADHs 以甲胺供體時，轉化率＞97%，ee ＞99%；以炔丙基胺、環(huán)丙基胺等為胺供體時，轉化率為52%～92%和59%，所有的反應均有完美的立體選擇性[5]。由于氨基酸的N-甲基化具有改善肽藥物的藥代動力學性質(zhì)的特征，因此引起了制藥行業(yè)的關注，為此開發(fā)了一條從糖和甲胺到N-甲基化氨基酸(N-甲基-L-丙氨酸)的一步轉化的策略[18]。

上述四種酶生成的N-功能化胺類化合物是制備多種生物活性分子的重要組成部分，例如：抗生素萬古霉素、免疫抑制劑環(huán)孢素、細胞抑制放線菌素和鐵載體需氧蛋白等。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)該反應不僅能夠接受不同的胺底物生成相應的苯丙酮酸及其衍生物，還能催化一系列羰基化合物與多種伯胺和仲胺的還原偶聯(lián)，生成脂肪族和芳香族的產(chǎn)物(圖1)。盡管取得了一些成果，但對于它們的序列、酶學性質(zhì)及底物特異性等方面的研究仍有一定的缺陷，因此手性N-功能化胺類化合物的可持續(xù)生產(chǎn)路線的開發(fā)仍然是制藥和精細化工行業(yè)面臨的重大挑戰(zhàn)。

圖1 N-功能化相關酶的應用Fig.1 Application of N-functionalized enzymes

1.2 以氨為供體的還原胺化反應

L-亮氨酸脫氫酶(LeuDHs, E.C.1.4.1.9)是一類催化直鏈和支鏈α-酮酸以及脂環(huán)α-酮酸還原胺化的酶，但是對芳香底物如L-苯丙氨酸卻沒有活性。最具代表性的例子是L-叔亮氨酸的制備，叔亮氨酸是一種非蛋白原的手性氨基酸，是重要的抗腫瘤藥物中間體[19]。 為了提高其產(chǎn)量，將來源于Lysinibacillus sphaericus CGMCC 1.1677 的LeuDHs 與FDH 共表達生產(chǎn)L-叔亮氨酸[20]，通過對反應條件進行優(yōu)化后，其轉化率和ee 均大于99%，時空產(chǎn)率為786 g?L-1?d-1。同時，LeuDHs 還可通過全細胞生物催化劑合成一系列的L-[15N]氨基酸[21]。隨后，Abrahamson等[22]通過多輪分子進化首次將天然的亮氨酸脫氫酶進化為非天然的亮氨酸脫氫酶，通過對酶活性口袋與天然底物羧基結合的關鍵位點進行分析和改造，所獲得的突變體（K68S/N261L）所催化的底物類型由脂肪族氨基酸改變?yōu)椴缓然闹就惢衔铩＿M一步改造后所獲得的最佳突變體K68S/E114V/N261L/V291C，可將1,3-二甲基丁胺轉化率提高至92.5%，ee值為99.8%。除了利用單一的酶進行生物合成之外，還可利用多酶級聯(lián)反應從D-去甲纈氨酸合成L-正纈氨酸，轉化率96.7%，ee＞99%[23]。最 近，Qi 等[24]從Exiguobacterium sibiricum(EsiLeuDH)中分離得到了一個新的亮氨酸脫氫酶基因，該酶可催化L-氨基酸和脂族α-酮酸，尤其是一些芳基α-酮酸的還原胺化。

苯丙氨酸脫氫酶(PheDHs, E.C.1.4.1.20)主要用于催化芳香側鏈的α-酮酸中的羰基還原胺化生成光學純L-苯丙氨酸及其類似物。針對兩個“熱點”殘基進行突變，獲得突變體G124A/E313G，其催化效率提高了7.4 倍，底物選擇性提高了612 倍[25]。對底物特異性進一步研究得到突變體K77S/N276L，發(fā)現(xiàn)該突變體催化的底物由苯丙氨酸轉變?yōu)闊o羧基的苯基丙酮類似物[26]。除此之外，定向進化得到的三突變體K66Q/S149G/N262C(TM_-pheDH)，可催化苯丙酮和4-苯基-2-丁酮高對映選擇性還原胺化，生成(R)-苯丙胺和(R)-1-甲基-3-苯丙胺，ee ＞98%[27]。將酶應用于多酶級聯(lián)反應中，催化D-對溴苯丙氨酸轉化為純度高、ee ≥99%的L-對映體[28]。

L-賴氨酸脫氫酶(LysEDH,E.C.1.4.1.18)是催化ε-脫氨反應的一種酶。廣泛存在于Geobacillus stearothemophilus[29]、Agrobacterium tumefaciens[30]和Cadida albocans[31]等微生物中。其不對稱單元由兩個亞基組成，每個單體由一個Rossmann折疊結構域和一個C 末端催化結構域組成[30]。最近，Mutti 課題組[32]以L-賴氨酸ε-脫氫酶作為模板，對活性位點周圍殘基進行突變，建立了14個突變體組成的突變文庫，獲得了具有不對稱還原胺化功能的胺脫氫酶，即LE-AmDH-v1(F713A)，該酶不僅具有非常高的熱穩(wěn)定性，而且具有較寬的底物譜，對醛酸、酮酸、醛、脂肪酮和芳香酮等化合物都顯示出一定的胺化活性。

D-氨基酸脫氫酶(D-AADH, E.C.1.4.99.1)能催化α-酮酸還原胺化為D-氨基酸。最具代表性的DAADHs 是meso-DAPDHs(E.C.1.4.1.16)，能 夠 可 逆地催化內(nèi)消旋-二氨基庚二酸的D-手性碳上的氨基氧化脫氨，生成L-2-氨基-6-酮基庚二酸[33]。為了擴大底物范圍，對C. glutamicum 的DAPDH 經(jīng)過三輪突變得到最佳突變株BC621(R196M/T170I/H245N/Q151L/D155G)，具有高度立體選擇性、寬底物范圍和NADPH 依賴等特點。能夠催化包括直鏈、支鏈和環(huán)狀脂肪族或芳香族D-氨基酸，由此說明它對D-氨基酸具有非常高的選擇性(95%至＞99% ee)[34]。通過對催化活性的進一步分析和檢測，發(fā)現(xiàn)meso-DAPDH 可分為Ⅰ型和Ⅱ型：Ⅰ型對meso-二氨基甲酸酯有很好的活性(以C.glutamicum的meso-DAPDH(CgDAPDH)為代表)，Ⅱ型具有明顯的可逆胺化活性，底物譜寬(以S. thermophilum 的meso-DAPDH(StDAPDH)為代表)。位點突變研究證實R71 是影響StDAPDH 底物偏好的相關殘基，可作為Ⅱ型胺化偏好的指標[35]。進一步的研究發(fā)現(xiàn)氨基酸 殘 基P69、K159、V68、S90、V14 和V156 在StDAPDH 的催化過程中發(fā)揮著非常重要的作用，同時這些突變的位點主要是通過殘基與配體之間相互作用的形成或消除來改變產(chǎn)物的構象[36]。這一研究結果加強了對meso-DAPDH 催化機理的認識，有助于酶工程工作的進一步開展。

酮的不對稱還原胺化制備手性胺具有僅生成副產(chǎn)物H2O、使用廉價的氨作為氨基供體、產(chǎn)品分離過程簡單等優(yōu)勢，且涉及的底物譜較寬，可生成直鏈/支鏈脂肪族胺產(chǎn)物、苯丙酮/環(huán)己酮及其衍生物和大體積胺產(chǎn)物(圖2)，但由于存在產(chǎn)物及底物抑制的現(xiàn)象導致大規(guī)模的工業(yè)化應用仍有一定的困難。

圖2 胺脫氫酶合成手性胺的應用Fig.2 Application of amine dehydrogenase to synthesize chiral amines

2 氫胺化反應

氫胺化反應是指氨對不飽和酸的α-或β-對映選擇性加成。該反應被苯丙氨酸裂解酶(PAL)、L-天冬氨酸裂解酶(DAL)、3-甲基天冬氨酸裂解酶(MAL)、苯丙氨酸氨基變位酶(PAM)、乙二胺-N,N′-二琥珀酸裂解酶(EDDS lyase)所催化。

苯丙氨酸裂解酶(PAL, E.C.4.3.1.24)主要催化L-苯丙氨酸非氧化脫氨生成肉桂酸，也可利用其逆反應合成新的L-苯丙氨酸類似物[37]。工業(yè)上最早利用PAL 生產(chǎn)L-苯丙氨酸，由于轉化率較高，受到了工業(yè)領域極大的關注[38-39]。隨后，采用化學-酶法一鍋生產(chǎn)苯丙胺酸及其衍生物，獲得了光學純度較高的L-對映體，但存在一定濃度的副產(chǎn)物，導致分離率較低[40]。利用化學Knoevenagel-Doebner 縮合與PAL 介導的氫胺化，將苯甲醛通過一鍋法合成為L-芳基苯胺，同時生成了5 種相關的L-二鹵苯丙氨酸(71%～84%產(chǎn)率，98%～99% ee)[41]。這一方法不僅可獲得高光學純度的化合物，而且具有較高的收率。 基于PAL 介導的不對稱氫胺化反應，Parmeggiani 等[42]提出了一種高效的一鍋法合成單取代和雙取代L-吡啶丙胺的方法，具有較高的收率(3%～60%)和立體選擇性(＞99%ee)。

苯丙氨酸氨基變位酶(PAM, E.C.5.4.3.10 或EC5.4.3.11)可以在沒有輔助因子的情況下催化α-苯丙氨酸轉化為β-苯丙氨酸[43]。為了進一步擴展底物范圍，隨后構建了一種利用PAM 催化氨對肉桂酸高對映選擇性加成生成芳香族α-和β-氨基酸的合成方法，這一方法具有廣闊的底物范圍，合成的α-和β-苯丙氨酸具有良好的對映體過量(＞99%ee)，但產(chǎn)物為芳香族α-和β-氨基酸的混合物[44]。為了提高手性氨基酸的純度，通過對PAM 進行X 射線結構分析和蛋白質(zhì)工程改造，獲得了突變株Q319M，β-苯丙氨酸脫氨基活性提高了5倍，β-區(qū)域選擇性提高了88%[45-46]。此外，來源于Streptomyces maritimus 的EncP 能將一系列芳基丙烯酸酯轉化為(S)-α-和(S)-β-芳基苯胺的混合物，基于對EncP 結構的理性設計，獲得了對α-或β-產(chǎn)物偏好改變的三個突變體，可使β∶α-產(chǎn)物比維持在99∶1 或者1∶99之間[47]。

天冬氨酸裂解酶(DAL,E.C.4.3.1.1)通過催化富馬酸向L-天冬氨酸轉化，在微生物氮代謝中發(fā)揮著重要作用[48]。研究發(fā)現(xiàn)，來自于Bacillus sp.YM55-1天冬氨酸裂解酶（AspB）的基因，可以羥胺、肼、甲氧胺和甲胺為底物，經(jīng)Michael 加成反應生成4 種N-取代天冬氨酸，其中，羥胺和肼都是AspB 的優(yōu)良底物，具有廣泛的親核專一性和高催化活性[49]。接著，將AspB固定在三種材料上合成天冬氨酸，反應24 h后產(chǎn)物濃度≥450 mmol·L-1，固定化生物催化劑在5個Asp合成周期中活性保持≥90%，轉化率≥90%[50]。為了進一步提高DAL 催化活性，通過定向進化得到突變體(N217K/T233R/V367G)，與野生型相比，其Kcat/Km增加了28 倍，Km下降至1/4.6[51]。由于DAL 在β-氨基酸合成中具有廣泛應用前景，通過對Bacillus sp. YM55-1 的DAL 底物結合腔進行改造，得到突變體 BSASP-C6 (T187C/M321I/K324M/N326C)，能催化巴豆酸和氨發(fā)生反應獲得對映體純(R)-3-氨基丁酸。進一步對來源于Bacillus sp.YM55-1 的DAL 底物譜進行蛋白質(zhì)工程改造，能催化氨與取代丙烯酸的不對稱加成反應，合成了對映體純的脂肪族、極性和芳香族β-氨基酸[52]。

3-甲基天冬氨酸裂解酶(MAL,E.C.4.3.1.2)能催化氨與氨基甲酸鹽可逆性加成反應，生成天冬氨酸衍生物[53]。對MAL 進行蛋白質(zhì)工程改造拓展其底物范圍，其中突變體Q73A 具有廣泛的親核范圍，包括結構多樣的線性和環(huán)狀烷基胺，同時該突變體能夠接受許多氨基苯甲酸的加成反應，可用于對映選擇性地合成多種N-取代的L-天冬氨酸[54]；而突變體L384A 具有廣泛的親電范圍，包括富馬酸及其在C2位具有烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、烷硫基和芳硫基取代基的衍生物[55]。隨后發(fā)現(xiàn)H194 A 具有高立體選擇性，可將中康酸胺化生成非對映選擇性產(chǎn)物。進一步將H194 A 突變體的高立體選擇性與L384 A 突變體的區(qū)域選擇性結合起來，獲得突變體H194 A/L384 A，具有催化2-丁硫酸非對映胺化生成蘇式-3-丁醛酸的獨特能力[56]。最近，在Escherichia coli(E. coli)O157∶H7 發(fā)現(xiàn)了一種新的MAL(命名為El-MAL)，可在Mg2+存在的條件下對富馬酸、美沙拉秦酸、馬來酸、檸檬酸和衣康酸等底物進行胺化反應[57]。

乙二胺-N,N′-二琥珀酸裂解酶(EDDS lyas, E.C. 4.3.2.1)催化乙二胺與兩分子富馬酸進行加成反應，生成中間產(chǎn)物(S)-N-(2-氨基乙基)天冬氨酸(AEAA)和終產(chǎn)物(S,S)-EDDS。由于該酶獨特的催化特性，F(xiàn)u 等[58]將毒素A、曲霉菌素A(AMA)和曲霉菌素B(AMB)與天然EDDS 裂解酶底物AEAA 和EDDS 進行對比，發(fā)現(xiàn)它們在結構上非常相似，該酶能不對稱合成毒素A、AMA、AMB 和相關的氨基羧酸。這種生物催化特性表明EDDS 裂解酶催化碳氮鍵的形成具有高度區(qū)域選擇性和立體選擇性，為難合成的氨基羧酸產(chǎn)品的制備提供了一種有效的合成方法。

綜上所述，利用生物催化劑對α,β-不飽和酸進行對映選擇性加成反應具有原子經(jīng)濟性高、無須輔因子再生系統(tǒng)等優(yōu)點。PAL介導的生物催化途徑是不對稱合成一系列光學純的芳香族α-或β-氨基酸最重要的方法之一，而借助蛋白質(zhì)工程技術，PAM不對稱合成對映體芳香族β-氨基酸也具有廣泛的應用，而乙二胺-N,N′-二琥珀酸裂解酶也為難合成的氨基羧酸類化合物提供了新的研究思路(圖3)。

3 轉氨化反應

轉氨化反應是依賴輔因子5′-磷酸吡哆醛（PLP）催化的反應，能夠催化氨基從氨基供體轉移到氨基受體的羰基碳原子上，涉及的酶有α-氨基轉移酶和ω-轉氨酶。

α-氨基轉移酶(α-AT,E.C.2.6.1.X)，包括天冬氨酸轉移酶(AspATs,E.C.2.6.1.1)[59-62]、芳香氨基轉移酶(AroATs,E.C.2.6.1.57)[62-65]、支鏈氨基轉移酶(BCATs,E. C. 2.6.1.42)[66]和 D- 氨 基 轉 移 酶(DATs,E.C.2.6.1.21)[67-68]。由于其廣泛的底物特異性和不需額外的輔因子，是手性氨基酸不對稱合成的重要生物催化劑。其中，AspATs 與AroATs 是研究最廣泛的α-氨基轉移酶。AspATs 可與磷酸烯醇丙酮酸激酶偶聯(lián)，從苯丙酮酸合成L-苯丙氨酸，轉化率為93%[60]。Cho 等[61]的研究表明，將大腸桿菌AspAT 基因導入高產(chǎn)2-苯乙醇(2-PEA)的S. cerevisiae YS58后，可生產(chǎn)2-PEA 和L-高苯丙氨酸(L-HPA)，LHPA 產(chǎn)率比野生型釀酒酵母提高了78.9%。而AroATs 可用于合成L-高苯丙氨酸(HPA)[62]、L-2-氨基丁酸[63]、L-噻吩基丙氨酸[64]和D-β-雜環(huán)丙氨酸[65]。BCATs 可利用支鏈氨基酸(BCAAs)如L-纈氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸等為底物，與α-酮戊二酸形成相應的α-酮酸。隨著對底物譜的深入研究，發(fā)現(xiàn)來源于Pseudomonas sp.的PsBCAT 對L-異亮氨酸的活性最高，其次是L-苯甘氨酸、L-亮氨酸、L-去甲纈氨酸、L-纈氨酸。但該酶對L-苯丙氨酸、L-丙氨酸和L-叔亮氨酸活性較低，對L-色氨酸、L-酪氨酸、蘇氨酸、L-組氨酸和L-賴氨酸則無活性，表明PsBCAT 更偏向于催化脂肪氨基酸的轉移[66]。D-氨基酸氨基轉移酶催化D-丙氨酸氨基轉移到α-酮戊二酸，生成D-谷氨酸[67]。Walton 等[68]對來源于Lactobacillus salivarius 的DAT底物譜進行了分析，發(fā)現(xiàn)除D-丙氨酸外，其對D-異亮氨酸、D-氨基丁酸和D-蛋氨酸均表現(xiàn)出較高的活性；同時，該酶也具有廣泛的氨基受體特異性，如對α-酮丁酸、乙醛酸、吲哚-3-丙酮酸和α-酮戊酸等都表現(xiàn)出比α-酮戊二酸或丙酮酸更高的催化活性，其中對α-酮丁酸的活性最高[68]。

圖3 氫胺化反應的應用Fig.3 Application of hydroamination reaction

ω-轉氨酶(ω-TA,E.C.2.6.1.18)催化酮或醛的胺化反應，與α-ATs 相比，ω-TAs 底物不僅局限于α-氨基酸和α-酮酸，而且可以將氨基從氨基供體轉移到氨基受體的羰基部分[69]。ω-TAs 可用于合成各種α-氨基酸、β-氨基酸和γ-氨基酸，它們是許多藥物和化學品的重要前體。重組Vibrio fluvialis JS17ω-轉氨酶(TA)以3-氟丙酮酸鹽(F-丙酮酸鹽)和(S)-α-甲基芐胺(MBA)為原料，不對稱合成(R)-3-氟丙氨酸，并采用雙相反應克服苯乙酮(α-MBA 的脫氨基產(chǎn)物)對產(chǎn)物的抑制作用，其轉化率約為95%，ee ＞99%[70]。通過多酶級聯(lián)反應，脂肪酶可將β-酮酯底物轉化為β-酮酸，然后由ω-TA 胺化為相應的β-氨基酸。(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸(3-ATfBA)具有良好的轉化率(81.9%)和對映體選擇性(99% ee)，該反應還可用于催化β-酮酸底物合成各種β-氨基酸[71]。此外，來源于Burkholderia graminis C4D1M 的Bgω-TA 和Polaromonas sp.的Poω-TA 可在異辛烷兩相反應體系中不對稱合成(S)-4-氨基-4-苯基丁酸(99%ee，95.8%轉化率)[72-73]。

轉氨酶是催化酮酸還原胺化為氨基酸的第二類酶。與AADHs相反，轉氨酶在合成過程中不需要添加額外的輔因子，可將酮或醛轉化為手性胺類化合物，但其催化活性易受到底物抑制或產(chǎn)物抑制，并且底物范圍相對較窄。對于α-ATs來說，雖然α-ATs 較低的平衡常數(shù)限制了應用，但是這種限制可以通過各種策略來解決，如將酶偶聯(lián)以分解副產(chǎn)物。而ω-TA 催化的反應在能量上是有一定的優(yōu)勢的，它可以高效地合成對映體純的α、β 和γ-氨基酸（圖4）。

4 展 望

生物法不對稱合成由于具有原子效率高、反應條件溫和、底物廉價等優(yōu)點，成為制備手性胺類化合物的重要手段，相關的研究引起了國內(nèi)外學者的廣泛關注?，F(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的還原酶、脫氫酶、裂解酶和轉氨酶雖然在合成不同類型的手性胺類化合物中具有一定的優(yōu)勢，但是這些酶在底物普適性、熱穩(wěn)定性及有機溶劑耐受等方面仍存在一定缺陷。這些問題也會為生物催化劑以及催化體系的開發(fā)提供理論依據(jù)和指導方向，從而突破現(xiàn)有的瓶頸實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

圖4 轉氨酶合成手性胺的應用Fig.4 Application of transaminase to synthesize chiral amines