張艷珍，付龍威，王詠星，劉云國(guó)

(1. 臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂276000；2. 新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830046)

0 引言

鯽魚（Carassius auratus）俗名鯽瓜子、河鯽等，其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的藥用價(jià)值及滋補(bǔ)食療作用，是重要的經(jīng)濟(jì)食用魚類之一[1?3]，在我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)十分重要的地位[4,5]．隨著鯽魚養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大、種質(zhì)退化、集約化程度提高以及抗生素等藥品濫用，致使養(yǎng)殖環(huán)境惡化，其病害問題日益突出，并具有傳染迅速、發(fā)病死亡率高和治愈困難的特點(diǎn)，給漁民造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，阻礙了養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[6,7]．

在對(duì)鯽魚疾病調(diào)查中，研究人員關(guān)注較多的是細(xì)菌病原菌[8?11]，以引起鯽魚細(xì)胞性敗血病的嗜水氣單胞菌（Aeramonas hydrophila）為主[10]，而真菌病原的研究卻沒有被重視，相關(guān)報(bào)道僅有水霉菌(Saprolegnia)[12,13]．事實(shí)上，水霉菌也是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類最常見的真菌病原菌，但致使魚類患病的真菌病原并不僅僅是水霉菌，水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的變化也促使越來越多致病菌的出現(xiàn)．

目前，對(duì)真菌性病原菌的研究較多的還有鐮刀菌(Fusarium)，其隸屬菌物界，半知菌亞門，是一類重要的世界性分布真菌類群，其種類繁多，適應(yīng)性強(qiáng)；營(yíng)寄生兼腐生生活，可導(dǎo)致多種植物、動(dòng)物甚至人類發(fā)病[14,15]．養(yǎng)殖魚類在免疫力低下時(shí)可感染鐮刀菌進(jìn)而引起爆發(fā)性死亡，其感染癥狀為魚體附有棉花狀菌絲和潰瘍性病灶．近30年來，報(bào)道的魚類鐮刀病原菌主要有腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）[16?18]、鐮狀鐮刀菌（F.fusarioides）[19]、棉腐鐮刀菌（F.buharicum）[20]、彎角鐮刀菌（F.comtoceras）[21]、串珠鐮刀菌（F.moniliforme)[22]和尖孢鐮刀霉(F.oxysporum)[23?25]．目前，尚未在鯽魚中發(fā)現(xiàn)存在鐮刀病原菌的相關(guān)報(bào)道．

病原菌的分類鑒定對(duì)魚類疾病具有重要意義，也是研究發(fā)病機(jī)理和科學(xué)防治的基礎(chǔ)．ITS (Internal Transcribed Spacer) 是核糖體內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，進(jìn)化過程中受自然選擇的壓力小，可容忍更多的變異；該區(qū)域比18S rDNA更保守，體現(xiàn)在種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異較明顯，適合于真菌物種的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析[26]．目前，基于ITS r DNA序列分析的鑒定技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類法已被廣泛應(yīng)用于病原真菌的分類鑒定[27]．

新疆地區(qū)氣候寒冷，魚類在越冬期免疫力低下，增加了鐮刀菌病爆發(fā)的可能．鑒于此，本研究從新疆昌吉地區(qū)患病的鯽魚魚體分離得到一株高致病性菌株JC01，結(jié)合菌株的形態(tài)特征和ITS rDNA序列分析進(jìn)行鑒定，并探究其生物學(xué)特性，以期為鯽魚養(yǎng)殖中可能的鐮刀菌病害的有效防治提供理論參考．

1 材料與方法

1.1 材料來源

患病鯽魚及健康鯽魚卵采于新疆昌吉某漁場(chǎng)，隨后運(yùn)送到新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院魚類疾病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究．

試驗(yàn)所用病原菌分離培養(yǎng)基是PDA培養(yǎng)基，購(gòu)于青島海博生物技術(shù)公司；抗生素、青霉素和鏈霉素購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司．

1.2 菌株的分離與純化

用酒精棉擦拭患病鯽魚體表，挑取病灶處的菌絲體，75%酒精浸洗2～3 s后，再用無菌水沖洗干凈，接種于含100 mg/L青霉素-鏈霉素的PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)至貼壁生長(zhǎng)，挑取最邊緣菌絲轉(zhuǎn)接到新的PDA平板上，重復(fù)多次直至獲得純培養(yǎng)物，將布滿菌絲的平板置于4 ℃?zhèn)溆茫?/p>

1.3 菌株的人工感染實(shí)驗(yàn)

向長(zhǎng)滿菌絲的PDA平板中注入10 mL無菌過濾河水，25 ℃搖床震蕩培養(yǎng)20 h，使產(chǎn)生的孢子充分混勻到無菌河水中，3 000 rmp/min離心5 min，除去菌絲體，光學(xué)顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，最后稀釋為濃度5×103個(gè)/mL的孢子懸液．取50粒健康的鯽魚卵放入含有孢子懸液的培養(yǎng)皿中，多次吹打移液槍充氧，同時(shí)，將放入滅菌過濾河水（不含孢子）的鯽魚卵設(shè)置為對(duì)照．用無菌水反復(fù)沖洗鯽魚卵，鏡檢確保沒有菌絲或孢子附著后才用于試驗(yàn)．顯微鏡下連續(xù)觀察記錄卵的感染情況，并計(jì)算感染率(%)．鏡檢卵膜出現(xiàn)明顯菌絲即可確定為感染．

1.4 形態(tài)特征觀察

挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的JC01純培養(yǎng)物點(diǎn)接到新的PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，肉眼觀察菌落特征；打孔器打出直徑為5 mm的PDA培養(yǎng)基到載玻片上，接種JC01的純培養(yǎng)物到培養(yǎng)基上，蓋上蓋玻片[28]，放到鋪有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃培養(yǎng)3 d后在顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)特征．

1.5 生理特性試驗(yàn)

挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的JC01 參照Hussein 等[29]用打孔器無菌制備直徑為5 mm的菌餅，接種到含有雙抗的新無菌PDA平板上培養(yǎng)，分別置于4 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃下恒溫培養(yǎng)3 d記錄生長(zhǎng)情況；用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，分別配置pH為4、5、6、7、8、9、10的PDA培養(yǎng)基，參照Hussein 等[29]用打孔器無菌制備直徑為5 mm的菌餅，接種后于25 ℃培養(yǎng)3 d觀察生長(zhǎng)情況；參照Hussein 等[29]用打孔器無菌制備直徑為5 mm的菌餅，接種到用NaCl配制0～6%梯度為1.0%不同濃度NaCl的PDA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)3 d觀察生長(zhǎng)情況．均用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（mm），每組進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)．

1.6 病原菌株的ITS序列鑒定

1.6.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增

參考可小麗等[30]的方法對(duì)菌株JC01進(jìn)行DNA提取，采用通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)擴(kuò)增整個(gè)ITS序列[31]，PCR反應(yīng)體系為25 μL∶1.5 μL Mg2+(25 mM)，2.5 μL，10×PCR Buffer，0.5 μL dNTP (2.5 mM)，1.0 μL ITS1，1.0 μL ITS4，0.5 μL Taq酶(5U/μL )，1.0 μL 模板(10 ng/μL )以及17 μL ddH2O．在Power Cycler(Biometra GmbH)中進(jìn)行PCR反應(yīng)，95 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min．PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序．

1.6.2 序列分析

將測(cè)得的ITS rDNA序列用DNAMAN軟件編輯后，在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行在線BLAST比對(duì)，下載同源性較高的菌株ITS序列，使用軟件MEGA 7.0進(jìn)行多重比較，通過鄰接法（Neighbour-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從而確定菌株JC01的親緣關(guān)系及分類地位．

2 結(jié)果

2.1 菌株的分離

患病鯽魚的病灶處集中在頭部、背鰭兩側(cè)和尾部，表面附著的白色絲狀物與水霉菌很相似[19]．挑取病灶處菌絲接種于含雙抗的PDA培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接3次后，獲得純培養(yǎng)物JC01．

2.2 菌株的人工感染實(shí)驗(yàn)

由表1可知，分離株JC01對(duì)健康鯽魚卵具有較強(qiáng)的致病性．培養(yǎng)第2 d時(shí)，魚卵出現(xiàn)感染現(xiàn)象；培養(yǎng)5 d后，約92%的魚卵被感染．

表1 分離株JC01對(duì)健康鯽魚卵的人工感染試驗(yàn)Tab 1 Artificial infection test of isolated JC01 on healthy Carassius auratus eggs

2.3 菌株的形態(tài)特征

菌株JC01接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，菌株一開始生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)24 h后大量生長(zhǎng)，菌落大、邊緣整齊、結(jié)構(gòu)干燥蓬松，正面雪白背面呈黃色（圖1），顯微鏡下觀察：菌絲呈透明管狀，中間有橫隔，分支較多（圖1(c)）；具有鐮刀形分生孢子（箭頭下方）以及球狀厚垣孢子（圖1(d)），可初步鑒定為鐮刀菌．

2.4 菌株的生理特性

2.4.1 溫度對(duì)菌株JC01生長(zhǎng)的影響

由圖2可知，菌株JC01在10～30 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，10～20 ℃生長(zhǎng)緩慢，25 ℃生長(zhǎng)良好，28 ℃生長(zhǎng)最快，30℃生長(zhǎng)開始變慢，4 ℃幾乎不生長(zhǎng)．菌落的直徑隨著溫度升高而增大，在28 ℃達(dá)到最大，最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃．

圖1 分離株JC01的形態(tài)圖Fig 1 Morphological characterization of strain JC01

2.4.2 pH對(duì)菌株JC01生長(zhǎng)的影響

菌株JC01在pH 5～9 范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)（圖3），但pH 7～9間其菌落直徑隨pH的增大而緩慢降低，最適生長(zhǎng)pH為7．

圖2 溫度對(duì)菌株JC01生長(zhǎng)的影響Fig 2 Effect of temperature on the growth ofstrain JC01

圖3 pH對(duì)菌株JC01生長(zhǎng)的影響Fig 3 Effect of pH on the growth of strain JC01

圖4 NaCl對(duì)菌株JC01生長(zhǎng)的影響Fig 4 Effect of NaCl on the growth of strain JC01

圖5 基于分離株JC01 ITS rDNA 序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig 5 The constructed phylogenetic tree based on ITS rDNA sequence of strain JC01

2.4.3 NaCl濃度對(duì)菌株JC01生長(zhǎng)的影響

如圖4所示，氯化鈉濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)具有抑制作用，恒溫培養(yǎng)72 h后菌落均未達(dá)到40 mm．氯化鈉濃度為0%～3.0%時(shí)菌株生長(zhǎng)狀況良好，氯化鈉濃度從3.0%逐漸升高到6.0%時(shí)，菌株生長(zhǎng)變得緩慢，最適氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%．

2.5 菌株JC01的序列分析

用通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增出的JC01序列為542 bp的特異性片段，使用BLAST對(duì)菌株JC01的ITS序列和Gen Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知同源序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示菌株JC01與數(shù)據(jù)庫(kù)中的鐮刀菌自然聚類，同源性高達(dá)99%．鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）進(jìn)一步表明，菌株JC01與Fusarium langsethiae（NO：MG274309.1）的親緣關(guān)系最近，因此可判定分離株JC01為鐮刀菌屬中的Fusarium langsethiae．

3 討論

隨豆粕、各種谷類等植物源性飼料在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用日益增加，魚類受鐮刀菌感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)比以往更加敏感[32]，人們逐漸認(rèn)識(shí)到鐮刀菌對(duì)魚類的危害性，但有關(guān)魚類鐮刀病原菌的鑒定和致病性研究仍較少．本研究從新疆昌吉患病鯽魚中分離了一株高致病性鐮刀菌JC01，并對(duì)其形態(tài)、生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為鯽魚鐮刀菌病的防治提供理論依據(jù)．

真菌的傳統(tǒng)分類方法，主要是依據(jù)菌株的形態(tài)特征、生長(zhǎng)特性和生理生化指標(biāo)來進(jìn)行的．由于真菌的形態(tài)特征復(fù)雜，且部分形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)因環(huán)境變化而不穩(wěn)定，依靠形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力、誤差大、準(zhǔn)確性比較低，同時(shí)也難以在種的層次上判斷真菌的分類[33]．比如尖孢鐮刀菌（F.oxysporum)和串珠鐮刀菌(F.moniliforme)的分生孢子都是鐮刀狀，兩端漸尖，菌落及顯微形態(tài)特征極相似，尤其是有時(shí)候培養(yǎng)物不典型或不產(chǎn)孢，僅用傳統(tǒng)方法鑒定是很困難的[34]．近年來，隨分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基于ITS r DNA序列分析的鑒定技術(shù)逐漸被應(yīng)用到真菌的分類鑒定中，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類鑒定的不足．本研究采用形態(tài)學(xué)將菌株JC01初步鑒定為鐮刀菌，菌株JC01的ITS序列與鐮刀菌同源性最高，系統(tǒng)發(fā)育樹上和Fusarium langsethiae（No: MG274309.1）聚到一起．因此，菌株JC01被鑒定為Fusarium langsethiae．

人工感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示分離株JC01對(duì)健康魚卵具有較高的致病率，而黃文芳[18]和可小麗[25]等采用魚苗個(gè)體進(jìn)行人工感染，其結(jié)果顯示體表無損傷的魚無發(fā)病癥狀，而本研究出現(xiàn)這種情況的原因可能是魚卵的自身保護(hù)機(jī)制沒有個(gè)體魚強(qiáng)，在孢子液浸泡過程中易受到感染．分離株JC01的溫度和pH的適應(yīng)范圍很大，但低溫以及高pH條件下JC01的生長(zhǎng)狀況不好．JC01的最適NaCl濃度為3%，這與黃文芳等[18]探究的分離自大黑鱸的鐮刀菌病原菌的最適NaCl濃度不一樣，且NaCl濃度范圍也不一樣，說明了鐮刀菌菌株的種類或生長(zhǎng)條件不同，其對(duì)NaCl的敏感程度也不同，但總體上都是隨NaCl濃度升高，菌株的生長(zhǎng)被抑制．因此，在鯽魚養(yǎng)殖過程中，要防治養(yǎng)殖密度過大，根據(jù)鐮刀菌菌株對(duì)NaCl的敏感程度選擇合適用量．

4 結(jié)論

鐮刀菌感染鯽魚致使鯽魚患病，給鯽魚養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)損失，在一定程度上，也對(duì)食品安全甚至人體健康構(gòu)成威脅．本研究首次從患病鯽魚魚體分離出一株高致病性鐮刀菌Fusarium langsethiae，其最適生長(zhǎng)溫度、pH、鹽度分別為28 ℃、7、3%，這為后續(xù)鯽魚鐮刀病的防治研究提供了一定的理論依據(jù)．