王 媛，劉艷杰，顏 南，王正東，王夢(mèng)露，沈超男

1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 干診內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110024；沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院 2.醫(yī)學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4.公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110000

放射線會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)炎性因子，促進(jìn)炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷和凋亡[1]。全氟辛烷磺酸鹽(perfluorooctane sulphonate，PFOS)是一種常用的表面活性劑。有研究報(bào)道，PFOS已成為一種新型的持久性污染物，可在人體中富集，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用[2]。另有研究發(fā)現(xiàn)，PFOS會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，引起神經(jīng)元損傷，通過(guò)海馬體的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)及其下游的酪氨酸激酶受體(tyrosine kinase receptor B，TkrB)誘導(dǎo)神經(jīng)毒性[3]。但是，PFOS對(duì)放射后海馬體損傷的影響尚不清楚。本研究旨在探討PFOS對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及放射后海馬體損傷的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)雌性昆明(KM)小鼠40只，體質(zhì)量(30±2)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。放射源鈷(60Co，GWXJ80型)，水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(泰盟科技有限公司，中國(guó))，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒和TUNEL凋亡試劑盒(碧云天公司，中國(guó))，免疫熒光染色抗體(Abcam公司，美國(guó))，PVDF膜(Bio-Rad公司，美國(guó))。ECL試劑盒(Amersham，美國(guó))，顯微鏡以及激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將40只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、放射組、PFOS組和放射+PFOS組，每組各10只。放射組和放射+PFOS組小鼠通過(guò)60Co照射，根據(jù)參考文獻(xiàn)[4]，將小鼠固定在距放射源80 cm的操作臺(tái)上，通過(guò)鉛孔垂直照射，避開(kāi)眼睛等器官，照射劑量為15 Gy，隔天照射，進(jìn)行2次，累積30 Gy。PFOS組與放射+PFOS組根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]，使用PFOS干預(yù)，于照射前3 d和1 d腹腔注射PFOS，劑量為10 mg/kg，其他各組小鼠注射等量生理鹽水。

1.3 水迷宮實(shí)驗(yàn) 建模后第7天通過(guò)水迷宮視頻跟蹤對(duì)小鼠空間記憶能力進(jìn)行檢測(cè)，逃避潛伏期越長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)越低提示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重，記憶力越差[6]。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)炎性因子 小鼠進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)后，眼眶取血，2 000 r/min離心20 min，取上層血清，根據(jù)試劑盒的說(shuō)明加入抗體和顯色劑，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm下的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的水平。

1.5 TUNEL染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡 小鼠頸脫臼處死，取出海馬組織，然后將海馬體固定、透化、切片，操作過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后將其放置于TUNEL溶液中，37℃下孵育1 h。洗滌后加入Converter-POD溶液孵育30 min，之后依次進(jìn)行顯色、DAPI染色細(xì)胞核、封片。通過(guò)檢測(cè)熒光反應(yīng)計(jì)算凋亡率。

1.6 雙標(biāo)免疫熒光染色 將固定的海馬切片進(jìn)行雙標(biāo)免疫熒光染色，通過(guò)CD11B對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)志性染色，然后對(duì)BDNF和TrkB進(jìn)行染色。切片中首先加入紅色熒光標(biāo)記的anti-CD11B4(1∶200稀釋)在4℃下避光孵育過(guò)夜，然后分別加入綠色熒光標(biāo)記的anti-BDNF和anti-TrkB(1∶200稀釋)，在室溫下避光孵育1 h。通過(guò)甘油封片，立即通過(guò)激光共聚焦顯微鏡計(jì)算平均光密度并拍照。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 與對(duì)照組比較，放射組、PFOS組、放射+PFOS組逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與放射+PFOS組比較，放射組、PFOS組逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

2.2 各組海馬神經(jīng)元凋亡情況比較 對(duì)照組海馬神經(jīng)元凋亡率為(3.15%±0.56%)，顯著低于放射組的(13.47%±2.15%)、PFOS組的(9.15%±1.84%)、放射+PFOS組的(24.61%±5.28%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。放射+PFOS組海馬神經(jīng)元凋亡率顯著高于放射組和PFOS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 TUNEL染色檢測(cè)各組海馬組織神經(jīng)元凋亡情況(a.對(duì)照組；b.放射組；c.PFOS組；d.放射+PFOS組；TUNEL×200)

2.3 各組炎性因子水平比較 與對(duì)照組比較，放射組、PFOS組、放射+PFOS組的TNF-α、IL-1β水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。放射+PFOS組TNF-α、IL-1β水平顯著高于放射組和PFOS組，(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組炎性因子水平比較

2.4 各組小膠質(zhì)細(xì)胞BNDF、TrkB表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，放射組、PFOS組、放射+PFOS組BDNF和TrkB水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。放射+PFOS組BDNF、TrkB水平顯著高于放射組和PFOS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小膠質(zhì)細(xì)胞BDNF和TrkB表達(dá)水平比較

3 討論

放射治療是治療原發(fā)或繼發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的重要方法。然而，在手術(shù)過(guò)程中，放射線會(huì)不可避免地對(duì)神經(jīng)元造成損傷。當(dāng)海馬體受到放射線照射后，會(huì)出現(xiàn)水腫、神經(jīng)元凋亡，造成患者記憶功能減退。因此，減少放射線對(duì)海馬體以及其他腦組織的影響具有重要的意義[7]。PFOS是制冷劑、潤(rùn)滑劑、殺蟲(chóng)劑或阻燃劑的常用成分，不易降解、代謝，具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性[8]，在人體內(nèi)的半衰期約為5.4年，在職業(yè)暴露的人群血液中水平更高。

本研究水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，放射線和PFOS均會(huì)影響小鼠的記憶功能，而PFOS聯(lián)合放射線照射會(huì)進(jìn)一步加劇記憶功能的損傷，且PFOS可加劇放射線誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。Wang等[9]研究表明，PFOS可以通過(guò)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡影響神經(jīng)功能。另有研究報(bào)道，PFOS可以通過(guò)調(diào)節(jié)PARP和p53通路誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡以及氧化應(yīng)激反應(yīng)[10]。本研究中，在PFOS存在的情況下，放射線引起的海馬體細(xì)胞凋亡及小鼠記憶力損傷會(huì)加劇。這提示，對(duì)于體內(nèi)累積了PFOS的患者，進(jìn)行放射線治療可能會(huì)加劇神經(jīng)損傷。

小膠質(zhì)細(xì)胞具有雙重作用:一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)通過(guò)免疫炎性反應(yīng)及時(shí)清除受損神經(jīng)元并促進(jìn)神經(jīng)元存活；另一方面，放射線或PFOS會(huì)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，引起神經(jīng)元炎性損傷和凋亡[11-12]。Chen等[13]研究結(jié)果表明，PFOS可以通過(guò)激活A(yù)KT/NF-κB通路促進(jìn)星型角質(zhì)細(xì)胞活化，誘導(dǎo)IL-1β分泌，引起神經(jīng)炎性損傷。Yang等[14]研究結(jié)果表明，PFOS可通過(guò)Ca2+依賴(lài)NF-кB信號(hào)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化和TNF-α分泌。Miao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素激活BDNF/TrkB途徑可以通過(guò)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活導(dǎo)致神經(jīng)損傷。本研究結(jié)果顯示，放射+PFOS組TNF-α、IL-1β、BNDF、TrkB水平均顯著升高。這提示，PFOS可能通過(guò)BDNF/TrkB途徑激活小膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α和IL-1β。

綜上所述，PFOS通過(guò)BDNF/TrkB通路進(jìn)一步激活小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性因子，從而加劇放射線引起的小鼠海馬體神經(jīng)元凋亡和記憶功能損傷。