徐婷婷 馮海英 朱振華

[摘要] 目的 研究觀察微小核糖核酸-486-5p（miR-486-5p）對(duì)博萊霉素致肺纖維化（PF）小鼠中的作用及機(jī)制。 方法 選取健康、清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠40只，10只分為正常組，剩余30只建立博萊霉素致PF模型，為模型組、miR-486-5p低表達(dá)組、miR-486-5p過(guò)表達(dá)組，各10只。檢測(cè)miR-486-5p表達(dá)，觀察病理組織，統(tǒng)計(jì)肺指數(shù)、HYP含量，檢測(cè)FN、α-SMA蛋白表達(dá)及TGFβ1/Smad通路相關(guān)蛋白。 結(jié)果 miR-486-5p過(guò)表達(dá)組miR-486-5p表達(dá)高于模型組、miR-486-5p低表達(dá)組（P<0.05）。miR-486-5p過(guò)表達(dá)組肺指數(shù)、HYP含量低于模型組，F(xiàn)N、α-SMA、TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)低于模型組（P<0.05）;miR-486-5p過(guò)表達(dá)組肺指數(shù)、HYP含量以及FN、α-SMA、TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)低于miR-486-5p低表達(dá)組（P<0.05）。 結(jié)論 miR-486-5p過(guò)表達(dá)調(diào)控TGFβ1/Smad信號(hào)通路對(duì)博萊霉素致PF小鼠肺纖維化有抑制作用。

[關(guān)鍵詞] 微小核糖核酸-486-5p;博萊霉素;肺纖維化;作用機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R563.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）34-0024-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of microRNA-486-5p （miR-486-5p） on bleomycin-induced pulmonary fibrosis（PF） in mice and its underlying mechanism. Methods Forty healthy， clean-grade male C57BL/6 mice were selected， 10 of which were assigned into the normal group， and the remaining 30 were used to establish bleomycin-induced PF models and were divided into the model group， the miR-486-5p low expression group and the miR-486-5p overexpression group， with 10 mice in each group. The miR-486-5p expression was detected， and the pathological tissue was observed. In addition， the lung index and hydroxyproline （HYP） content were counted， and the expression of fibronectin （FN） and α-smooth muscle actin （α-SMA）， and transforming growth factor-β1 （TGFβ1）/Smad pathway-related proteins were detected. Results The miR-486-5p expression in the miR-486-5p overexpression group was higher than that in the model group and the miR-486-5p low expression group（P<0.05）. The lung index and HYP content in the miR-486-5p overexpression group were lower than those in the model group， and the expressions of FN， α-SMA， TGFβ1， Smad2 and Smad3 protein in the miR-486-5p overexpression group were lower than those in the model group（P<0.05）. The lung index， HYP content， and the expressions of FN， α-SMA， TGFβ1， Smad2， and Smad3 protein in the miR-486-5p overexpression group were lower than those in the miR-486-5p low expression group（P<0.05）. Conclusion The miR-486-5p overexpression plays a role of inhibiting bleomycin-induced PF in mice through regulating the TGFβ1/Smad signaling pathway.

[Key words] microRNA-486-5p; Bleomycin; Pulmonary fibrosis; Mechanism

肺纖維化（Pulmonary fibrosis，PF）屬于一種慢性炎癥反應(yīng)疾病，患者主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎、間質(zhì)纖維化等，且近年來(lái)顯示其發(fā)病率逐年增加，患者5年生存率低于50%[1]。目前臨床關(guān)于PF發(fā)布機(jī)制較為復(fù)雜，主要通過(guò)糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等治療，但治療效果不理想[2]。目前，在動(dòng)物研究中常常通過(guò)氣管運(yùn)送博萊霉素建立肺纖維化模型，模擬人特發(fā)性肺纖維化疾病，研究其發(fā)病機(jī)制[3]。已經(jīng)有研究證實(shí)，在肺纖維化發(fā)病過(guò)程中，涉及到多種細(xì)胞因子、基因等復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，微小核糖核酸（miRNAs）在肺纖維化發(fā)生中至關(guān)重要[4]。已有研究證實(shí)，在矽肺及特發(fā)性肺纖維化患者血清和肺組織中，miR-486-5p表達(dá)下調(diào)，可作為早期肺纖維化疾病標(biāo)志物[5]。目前臨床缺乏miR-486-5p參與肺纖維化作用機(jī)制，因此本研究旨在探討miR-486-5p對(duì)博萊霉素致PF小鼠的作用及機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源

選取健康、清潔級(jí)雄性C57BL/6小鼠40只，體質(zhì)量20～25 g，均由賽業(yè)（固安）生物科技有限公司提供，SYXK（冀）2021-005。鼠齡為6～8周。所有小鼠均給予常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，黑/白光照交替12 h，溫度為20～25℃，濕度為40%～50%。

1.2 方法

1.2.1 博萊霉素致PF模型建立? 40只小鼠隨機(jī)選取10只作為正常組，剩余30只參考文獻(xiàn)[6]建立博萊霉素致PF模型，小鼠麻醉蘇醒后常規(guī)飼養(yǎng)21 d。

1.2.2 分組及干預(yù)? 30只模型小鼠隨機(jī)分為模型組、miR-486-5p低表達(dá)組、miR-486-5p過(guò)表達(dá)組，各10只。腺病毒載體Ad-miR486及空載腺病毒（由上海漢恒生物公司提供）。miR-486-5p過(guò)表達(dá)組使用微量注射器給予75 μL攜帶miR-486-5p腺病毒溶液（正義鏈：TGGGATCCATGAGGAAGGGACATGAAGA;反義鏈：ACCGAAGCTTAAAAAAGCTCGGTCCCAGAGTCAG）;miR-486-5p低表達(dá)組使用給予75 μL腺病毒載體溶液（正義鏈：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT;反義鏈：ACGUGACACGUUCGGAGAATT）;模型組、正常組兩組均給予75 μL的生理鹽水干預(yù)，直接注射到肺組織中，各組均連續(xù)干預(yù)5 d。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 miR-486-5p檢測(cè)? 取小鼠尾部靜脈血3 mL，3000 r/min離心10 min，取得上層血清，放置-20℃凍箱內(nèi)備用。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit）逆轉(zhuǎn)成cDNA操作說(shuō)明書進(jìn)行，2-ΔΔCT法對(duì)miR-486-5p表達(dá)水平分析。

1.3.2 病理組織觀察? 干預(yù)后5 d小鼠麻醉處死后，采集小鼠肺部組織，提取后采用生理鹽水沖洗后，清除干凈，吸干后制備切片，經(jīng)過(guò)二甲苯脫蠟后，梯度酒精水化，蘇木精染色5 min，流水沖洗后給予伊紅染色30 s，觀察。

1.3.3 統(tǒng)計(jì)肺指數(shù)、羥脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）含量? 小鼠處死后取肺組織稱重，生理鹽水沖洗后吸干水分再次稱重，肺指數(shù)=肺濕重/小鼠體質(zhì)量。取適量肺組織勻漿采用堿水水解法檢測(cè)肺組織中HYP含量。

1.3.4 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)n）表達(dá)檢測(cè)? 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA），試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所，試驗(yàn)操作嚴(yán)格根據(jù)說(shuō)明書的步驟進(jìn)行。

1.3.5 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測(cè)? 采用免疫印跡（Western blot）將標(biāo)本提取液通過(guò)1000 rpm離心處理后提取沉淀，滴加裂解液、反復(fù)凍融后，120 000rpm離心處理，提取上清液，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)TGFβ1、Smad2、Smad3 蛋白濃度，保存。滴加10%的分離膠，封閉，吸干水分，給予5%的濃縮膠灌注，凝固后，將其在電泳槽中固定，加5 μL Marker、變性蛋白樣品，電泳干預(yù)30 min，待蛋白分離膠底，結(jié)束電泳;轉(zhuǎn)膜成功后將硝酸纖維素膜（Nitrocellulosefilter membrane，NC）在5%的脫脂奶粉中封閉固定1 h，加一抗（TGFβ1、Smad2、Smad3 1∶1000）孵育，經(jīng)過(guò)震蕩洗膜后加二抗（TGFβ1、Smad2、Smad3 1∶10 000），孵育，再次震蕩洗膜，使用紅外熒光成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果給予分析，以GAPDH為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠miR-486-5p表達(dá)比較

模型組、miR-486-5p低表達(dá)組miR-486-5p表達(dá)低于正常組，miR-486-5p過(guò)表達(dá)組miR-486-5p表達(dá)高于正常組（P<0.05）;miR-486-5p過(guò)表達(dá)組miR-486-5p表達(dá)高于模型組、miR-486-5p低表達(dá)組（P<0.05）。見圖1。

2.2各組小鼠肺病理組織觀察

正常組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡中無(wú)炎癥浸潤(rùn);模型組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔變寬，有大量成纖維細(xì)胞出現(xiàn);miR-486-5p低表達(dá)組肺泡結(jié)構(gòu)、肺泡間隔等表現(xiàn)更為嚴(yán)重;miR-486-5p過(guò)表達(dá)組肺泡結(jié)構(gòu)逐漸清晰，肺泡中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)改善。見封三圖2。

2.3 各組小鼠肺指數(shù)、HYP含量比較

模型組、miR-486-5p低表達(dá)組、miR-486-5p過(guò)表達(dá)組肺指數(shù)、HYP含量高于正常組（P<0.05）;miR-486-5p低表達(dá)組肺指數(shù)、HYP含量高于模型組，miR-486-5p過(guò)表達(dá)組肺指數(shù)、HYP含量低于模型組（P<0.05）;miR-486-5p過(guò)表達(dá)組肺指數(shù)、HYP含量低于miR-486-5p低表達(dá)組（P<0.05）。見表1。

2.4 各組小鼠FN、α-SMA蛋白表達(dá)比較

模型組、miR-486-5p低表達(dá)組、miR-486-5p過(guò)表達(dá)組FN、α-SMA蛋白表達(dá)高于正常組（P<0.05）;miR-486-5p低表達(dá)組FN、α-SMA蛋白表達(dá)高于模型組，miR-486-5p過(guò)表達(dá)組FN、α-SMA蛋白表達(dá)低于模型組（P<0.05）;miR-486-5p過(guò)表達(dá)組FN、α-SMA蛋白表達(dá)低于miR-486-5p低表達(dá)組（P<0.05）。見表2。

2.5各組小鼠TGFβ1/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

模型組、miR-486-5p低表達(dá)組、miR-486-5p過(guò)表達(dá)組TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)高于正常組（P<0.05）;miR-486-5p低表達(dá)組TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)高于模型組，miR-486-5p過(guò)表達(dá)組TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)低于模型組（P<0.05）;miR-486-5p過(guò)表達(dá)組TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)低于miR-486-5p低表達(dá)組（P<0.05）。見表3、圖2。

3討論

博萊霉素屬于一種抗腫瘤藥物，其主要的不良反應(yīng)是肺毒性，導(dǎo)致肺泡炎發(fā)生，發(fā)展為肺間質(zhì)纖維化，通過(guò)博萊霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化模型病理特點(diǎn)與早期普通間質(zhì)性肺炎及特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化相似[7-8]。

在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí)，miR-29、miR-200等均具有一定的抗纖維化作用[9-10]，但關(guān)于miR-486-5p抗纖維化作用研究較少。本研究結(jié)果顯示，miR-486-5p過(guò)表達(dá)組miR-486-5p表達(dá)高于模型組、miR-486-5p低表達(dá)組，提示miR-486-5p過(guò)表達(dá)構(gòu)建成功。PF主要病理變化主要體現(xiàn)在肺組織結(jié)構(gòu)被破壞，伴隨大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞異常活化[11]。本研究中博萊霉素致PF小鼠肺組織HE染色發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎，肺泡中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明博萊霉素致PF模型建立成功，與付鈺等[12]研究結(jié)果保持一致。

肺指數(shù)能有效反映肺組織炎癥、PF嚴(yán)重程度，HYP含量在肺組織膠原纖維中大量存在，其含量高低能反映肺組織膠原纖維變化，對(duì)膠原組織代謝有評(píng)估作用[13]。本研究結(jié)果顯示，miR-486-5p過(guò)表達(dá)組肺指數(shù)、HYP含量明顯降低，提示miR-486-5p過(guò)表達(dá)可以降低PF小鼠肺組織中HYP含量，有助于組織修復(fù)，抑制肺纖維化進(jìn)程。FN主要存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，對(duì)成纖維細(xì)胞有趨化刺激作用，在肺纖維化過(guò)程中，F(xiàn)N會(huì)促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生，加快膠原細(xì)胞合成和轉(zhuǎn)錄[14]。張翠影等[15]研究指出，α-SMA蛋白在肺纖維化組織中顯示高表達(dá)，與纖維化程度呈正相關(guān)。以上研究證實(shí)，F(xiàn)N、α-SMA蛋白參與肺纖維化發(fā)生過(guò)程。本研究結(jié)果顯示，miR-486-5p過(guò)表達(dá)組FN、α-SMA蛋白表達(dá)下降，提示miR-486-5p過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制FN、α-SMA蛋白表達(dá)，控制肺纖維化疾病發(fā)展。

本研究中肺成纖維細(xì)胞TGFβ處理后，會(huì)促進(jìn)miR-155表達(dá)上調(diào)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF-7）屬于miR-155靶基因，miR-155表達(dá)水平與博萊霉素致PF小鼠纖維化程度相關(guān)[16]。TGFβ信號(hào)通路在纖維化過(guò)程中至關(guān)重要，TGFβ1直接作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其增殖，向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，大量細(xì)胞外基質(zhì)釋放，導(dǎo)致纖維化產(chǎn)生[17-18]。本研究結(jié)果證實(shí)，miR-486-5p過(guò)表達(dá)組TGFβ1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)降低，分析miR-486-5p作用機(jī)制為miR-486-5p下調(diào)TGFβ1表達(dá)，避免Smads蛋白發(fā)生磷酸化，避免介質(zhì)Smad4蛋白形成三聚體，抑制肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，減少肺組織中FN、α-SMA蛋白表達(dá)[19-20]。

綜上所述，miR-486-5p過(guò)表達(dá)能改善博萊霉素致PF小鼠肺病理組織，降低肺指數(shù)、HYP含量及FN、α-SMA蛋白表達(dá)，通過(guò)調(diào)控TGFβ1/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白，抑制小鼠肺纖維化，為臨床研究肺纖維化疾病治療提供有效的靶點(diǎn)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 韓有明，李志剛，王海龍. 并發(fā)于特發(fā)性肺纖維化的肺癌發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 山東醫(yī)藥，2021，61（15）：98-102.

[2] 郭玉娟，李瑞，顏天華. 肺纖維化的相關(guān)機(jī)制及研究進(jìn)展[J]. 西北藥學(xué)雜志，2020，35（4）：624-629.

[3] Kobayashi Y，Tata A，Konkimalla A，et al. Persistence of a regeneration-associated， transitional alveolar epithelial cell state in pulmonary fibrosis[J]. Nat Cell Biol，2020， 22（8）：934-946.

[4] 許夢(mèng)婷，劉乃國(guó). 特發(fā)性肺纖維化相關(guān)miRNAs的研究新進(jìn)展[J]. 國(guó)際遺傳學(xué)雜志，2017，40（2）：118-122.

[5] 石雪峰，王楷博，張紅衛(wèi)，等. miR-486在低氧誘導(dǎo)肺間質(zhì)纖維化中的調(diào)控作用及機(jī)制[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，55（4）：578-582.

[6] 蔣怡芳，范曉杰，劉曉，等. 柚皮素對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的改善作用及其作用機(jī)制[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，56（2）：202-207.

[7] 喻雪飛，李理，鄭林鑫，等. 博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化中差異表達(dá)的mRNA及其與LncRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，41（1）：39-46.

[8] 呂曉希，劉姍姍，李云炫，等. 一種小鼠無(wú)創(chuàng)氣管插管的方法及其應(yīng)用[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2020，55（6）：1187-1192.

[9] 岳中正，李娟，暴磊，等. 特發(fā)性肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中miR-29的作用及上下游信號(hào)通路研究進(jìn)展[J]. 山東醫(yī)藥，2017，57（11）：111-114.

[10] 曹永梅，呂毅，劉玉靜，等. miR-200及其靶基因ZEB1/2在急性肺損傷后早期肺纖維化中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程[J]. 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，37（12）：1-7.

[11] 胡鉞，梅舒雅，徐僑翌，等. 乳酸-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1途徑促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞活化介導(dǎo)機(jī)械通氣相關(guān)性肺纖維化的機(jī)制研究[J]. 國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志，2021，42（3）：227-233.

[12] 付鈺，吳瑕，陳隨清. 甘草查爾酮A通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路抑制小鼠肺纖維化[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（4）：94-100.

[13] 陳宏，張偉，郭建波，等. 地龍?zhí)崛∥锟狗卫w維化的有效成分分析[J]. 中醫(yī)藥信息，2020，37（3）：14-16.

[14] 張興彩，蔡余力，張偉，等. 吡非尼酮與槲皮素通過(guò)S1P/SPHK信號(hào)通路抗小鼠肺纖維化比較研究[J]. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2019，47（5）：4-8.

[15] 張翠影，折虹，王艷陽(yáng)，等. 放射性肺損傷小鼠肺組織TGFβ1與α-SMA、Col1a1、FN mRNA表達(dá)的關(guān)系[J]. 寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，37（6）：631-634，封3.

[16] Sun X，Kang Y，Xue S，et al. In vivo therapeutic success of microRNA-155 antagomir in a mouse model of pulmonary fibrosis induced by bleomycin[J]. Korean J Intern Med，2021，36（Suppl 1）：S160-S169.

[17] 張彥偉，張志強(qiáng)，吳麗賢，等. 雷公藤內(nèi)酯醇減少放射性肺纖維化中肌成纖維細(xì)胞活化與抑制TGF-β1/ERK/Smad3通路相關(guān)[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2017，33（5）：630-636.

[18] 陳宏，張偉，郭建波，等. 地龍?zhí)崛∥锿ㄟ^(guò)抑制TGF-β1信號(hào)通路發(fā)揮抗肺纖維化作用研究[J]. 陜西中醫(yī)，2021， 42（4）：427-429.

[19] 席苑，張海靜，高云航，等. 漢防己甲素對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細(xì)胞中Col-Ⅰ及FN表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2020，26（12）：94-99.

[20] 田新瑞，田新利，王慧芳，等. β-連環(huán)素通路對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1致肺纖維化的調(diào)控作用[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2016，96（24）：1929-1933.

（收稿日期：2021-06-28）